Preparación de una suspensión unicelular de arterias carótidas de ratón para la secuenciación de células individuales

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica asociada a factores de riesgo como hipertensión arterial, hiperlipidemia y hemodinámica¹. Las bifurcaciones de las arterias carótidas son propensas a cambios hemodinámicos y conducen a la formación de placa carotídea. La presentación clínica de la aterosclerosis carotídea puede ser aguda, como el accidente cerebrovascular y la isquemia cerebral transitoria, o crónica, como la isquemia cerebral transitoria recurrente y la demencia vascular². Mecánicamente, la placa carotídea es el resultado de la interacción entre diferentes células de la pared de los vasos y varias células sanguíneas en condiciones patológicas. Por lo tanto, revelar el atlas unicelular de los vasos carotídeos en condiciones fisiológicas y patológicas es particularmente importante para prevenir y tratar el desarrollo de la placa carotídea.

La secuenciación de ARN unicelular es una de las tecnologías más potentes de la investigación biológica debido a su ultra alta resolución y a la detección de la heterogeneidad celular del mismo tipo de células de organismos ^3,4. Los investigadores han utilizado la secuenciación de ARN de una sola célula para realizar investigaciones en muchos campos, como las enfermedades cardiovasculares⁵ y el cáncer⁶. Sin embargo, separar los tejidos de forma rápida y precisa en células individuales sigue siendo uno de los principales desafíos. La disociación enzimática es un método de uso común que incluye predominantemente colagenasa, papaína, tripsina, DNasa e hialuronidasa. Específicamente, las colagenasas son las principales especies de enzimas para la digestión unicelular, principalmente hidrolizando los componentes de colágeno en los tejidos conectivos. Diferentes tipos de colagenasa son aplicables para la disociación de diferentes tejidos, como la glándula mamaria⁷, el glomérulo⁸, el ángulo iridocorneal⁹, la articulación de la rodilla¹⁰, la aorta 11 y el pulmón¹². Debido a las propiedades fisiológicas únicas de los diferentes tejidos, la disociación utilizando el mismo método puede causar muchos problemas en la adquisición de células individuales, como baja viabilidad celular, bajo número de células y restos celulares grandes. Por lo tanto, la invención de métodos de digestión para diferentes tejidos es esencial para preparar suspensiones unicelulares de alta calidad.

Este protocolo tiene como objetivo desarrollar un método de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje. De acuerdo con las características de la arteria carótida, combinamos colagenasa/DNasa con tripsina para obtener una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida del ratón, ya que la colagenasa puede hidrolizar el colágeno de los tejidos carotídeos, que luego fue digerido por la tripsina en una suspensión unicelular. Se utilizó el recuento de doble fluorescencia de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) para detectar la viabilidad y concentración celular, y se encontró que la suspensión de una sola célula cumplía con los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Después del procesamiento de datos de una sola célula, se identificaron cuatro tipos de células, incluidas las células del músculo liso vascular (VSMC), los fibroblastos, las células endoteliales (CE) y los macrófagos y las células dendríticas (Mφ/DC), en las arterias carótidas normales del ratón después de la digestión. Las ventajas de este protocolo son que: 1) se pueden identificar múltiples tipos de células en la arteria carótida, 2) la viabilidad celular está bien conservada y 3) se puede repetir fácilmente sin equipo especial. Este protocolo es adecuado para investigadores que estén interesados en estudiar la multiómica unicelular de las arterias carótidas de ratón. Este protocolo también puede ser útil en la disociación de otros vasos sanguíneos con las modificaciones adecuadas.

Todos los procedimientos con animales que se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Soochow.

1. Preparación de reactivos y materiales

1. Utilice 1x PBS sin calcio y magnesio y 2.5 U/mL de sal sódica de heparina para preparar la solución de perfusión. Conservar a 4 °C y preenfriar en hielo cuando se utilice.
2. Prepare el reactivo de disociación A que contenga 125 CDU/mL colagenasa II y 60 U/mL de DNasa I diluyendo 1250 CDU/mL de colagenasa II y 3000 U/mL de DNasa I con HBSS. Conservar a 4 °C hasta su uso.
3. Prepare el reactivo de disociación B que contenga una concentración final de tripsina al 0,12 % diluyendo 1 ml de tripsina libre de EDTA al 0,25 % (sin rojo de fenol) en 1 ml de 1x PBS. Conservar a 4 °C hasta su uso.
4. Prepare 10 mL de FBS al 1,5% y 10 mL de FBS al 5% en 1x PBS. Use FBS al 1.5% para agrupar las arterias carótidas y manténgalas en hielo antes de usar. Use 5% de FBS para neutralizar la digestión y almacene a temperatura ambiente (RT).
5. Obtenga los materiales experimentales, incluidas jeringas de 1 ml, jeringas de 20 ml con agujas de 26 g, placas de cultivo celular de seis pocillos, tubos de centrífuga de 1,5 ml, filtros de células estériles de 40 μm y recipientes de hielo.

2. Preparación del equipo

1. Esterilice todo el equipo quirúrgico, incluido un microscopio estereoscópico, tijeras de disección, tijeras de microdisección y pinzas de punta fina.
2. Encienda el contador de celdas automatizado y manténgalo en RT.
3. Abra el baño de agua a 37 °C con anticipación.
4. Enfríe previamente la microcentrífuga a 4 °C antes de su uso.

3. Aislamiento de la arteria carótida del ratón

1. Anestesiar al ratón con tribromoetanol al 1,25% mediante inyección intraperitoneal (0,24 ml por cada 10 g de peso corporal) y voltear el ratón para comprobar si hay un reflejo de enderezamiento después de 3 min. Luego, sacrifica al ratón por dislocación cervical y acuéstate boca arriba. Rocía la piel del ratón con alcohol al 75%.
2. Use tijeras de disección esterilizadas para abrir la piel y exponer la cavidad torácica. Corta el diafragma.
3. Continúe cortando hacia arriba hasta la mandíbula inferior y retire con cuidado el exceso de tejido conectivo y grasa, exponiendo la arteria carótida.
4. Corta la vena cava inferior del ratón para que la sangre fluya fuera de la circulación cerrada.
5. Inyecte 20 ml de solución de perfusión preenfriada en el ventrículo izquierdo con una jeringa lenta y continuamente.
   NOTA: Si la perfusión es exitosa, los órganos ricos en sangre, como el hígado, el bazo y los riñones, se volverán de color blanco grisáceo.
6. Pele toda la grasa y los tejidos conectivos alrededor de la arteria carótida con unas tijeras de microdisección bajo un microscopio estereoscópico.
   NOTA: Este paso debe realizarse lenta y cuidadosamente para evitar daños en la arteria carótida.
7. Aísle la arteria carótida del ratón, lávela con 1x PBS para enjuagar la sangre nuevamente y transfiérala a placas de seis pocillos que contengan 1.5% de FBS en hielo.

4. Digestión de la arteria carótida en suspensión unicelular

1. Utilice unas tijeras de microdisección para diseccionar la arteria carótida longitudinalmente y colóquela plana en otra placa de cultivo celular de 6 pocillos que contenga 1 ml de FBS al 1,5 % en hielo.
2. Enjuague la íntima cuidadosamente con FBS al 1,5% para eliminar la sangre residual.
   NOTA: El enjuague debe ser suave y lento para evitar dañar las células endoteliales.
3. Cortar cada arteria carótida en trozos de tejido de aproximadamente 2^mm2 utilizando tijeras de microdisección en FBS al 1,5%.
4. Transfiera estas piezas de tejido a un tubo de centrífuga de 1,5 ml con puntas de 1 ml de diámetro ancho, centrifugue a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C para hundir los tejidos hasta el fondo.
5. Desechar el sobrenadante y resuspender los tejidos en 500 μL de reactivo de disociación A.
6. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 1 h. Pipetear suavemente con una pipeta de 1 ml cada 10 min.
7. Añadir 500 μL de FBS al 5% en el tubo y mezclar bien con una pipeta de 1 mL.
8. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular estéril de 40 μm en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
9. Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el gránulo celular en 200 μL de reactivo de disociación B.
10. Colocar al baño maría a 37 °C y digerir durante otros 5 min. Pipetear suavemente cada 2 minutos durante la digestión para disociar completamente en una suspensión unicelular.
11. Utilice 200 μL de FBS al 5% para finalizar la reacción de digestión y centrifugue a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
12. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 100 μL de 1x PBS en hielo.

5. Examen de suspensión celular y secuenciación de ARN de una sola célula

1. Añadir 10 μL de solución AO/PI en 10 μL de suspensión unicelular y mezclar suavemente con una pipeta de 20 μL.
2. Pipetear 20 μL de la mezcla en la cámara deslizar y esperar 1 min.
3. Cargue la corredera en el instrumento de contador de celdas automatizado.
4. Seleccione el ensayo de viabilidad AO/PI y, a continuación, espere el informe de calidad.
5. Utilice un kit de reactivos de 3 ° de una sola celda para generar perlas de gel de una sola celda en la emulsión en un controlador de una sola celda y amplifique el ADNc con código de barras en un termociclador siguiendo el protocolo del fabricante.
   NOTA: En este caso, se utilizó Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3.
6. Realice la secuenciación en un secuenciador con una estrategia de lectura de 150 pb (PE150) de extremo emparejado. Utilice una aplicación de software (Cell Ranger) para convertir archivos de llamadas base sin procesar en archivos fastq mediante la canalización mkfastq . A continuación, utilice la canalización de recuento de Cell Ranger para realizar la alineación, el filtrado, el recuento de códigos de barras y el recuento de identificadores moleculares únicos (UMI) para generar matrices de códigos de barras de características¹³.
7. Realice la reducción y visualización de la dimensionalidad de los datos con el paquete R Seurat¹⁴.
   1. En primer lugar, la función Read10X() de Seurat lee la salida de la canalización de Cell Ranger y, a continuación, utiliza la matriz count para crear un objeto Seurat. A continuación, filtre las células con expresión de <200 o >4000 genes o una proporción de genes mitocondriales que fuera superior al 10% por la función subset() de Seurat.
   2. Utilice NormalizeData () y FindVariableFeatures() para normalizar los datos e identificar 2000 entidades muy variables, respectivamente.
   3. Realice un análisis de componentes principales (PCA) en los datos escalados y agrupe las celdas con dims = 30 y resolution = 0,5. Por último, utilice la función RunUMAP () para visualizar los conjuntos de datos de una sola celda y FindAllMarkers() para encontrar cada biomarcador de clúster.

Este protocolo describe un método de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de las arterias carótidas de ratón (Figura 1). Este método de digestión celular de dos pasos combina colagenasa/DNasa con tripsina para disociar eficazmente la pared vascular carotídea del ratón y obtener suspensiones unicelulares de alta calidad para la secuenciación de células individuales. Después de la disociación, la concentración celular y la viabilidad celular se calcularon mediante un contador celular automatizado. El campo claro mostró la morfología de las células vasculares carotídeas después de la digestión, y la tinción de doble fluorescencia AOPI detectó simultáneamente la viabilidad celular (Figura 2A, B). En particular, en comparación con el uso del reactivo de disociación A solo, el tejido de la arteria carótida puede disociarse más completamente cuando se combina con el reactivo de disociación B. Además, encontramos un recuento de células viables de nueve arterias, y el diámetro celular promedio satisfizo los requisitos de la secuenciación de una sola célula después de la digestión celular en dos pasos (Figura 2C). Mientras tanto, se recolectaron un total de 176.000 células individuales de nueve carótidas izquierdas, y la mayoría de los vasos vasculares se disociaron en células individuales con alta viabilidad (Figura 2C).

Después de la alineación, el filtrado, el conteo de códigos de barras y el conteo UMI, los datos brutos de la secuenciación de una sola celda se analizaron con el paquete R Seurat. La distribución de genes por célula, UMI por célula y lecturas mitocondriales por célula se muestran en gráficos de violín (Figura 3A-C). En particular, se detectó una mediana de ~ 2500 transcripciones por célula en cada célula de la arteria carótida. Después de eliminar las células de baja calidad, se detectaron 14.580 células y se utilizaron para el análisis posterior de secuenciación de ARN de una sola célula. Utilizando 2000 genes variables con perfiles similares, el agrupamiento no supervisado basado en Seurat mostró cuatro tipos principales de células, incluyendo VSMCs (74,0%), fibroblastos (16,5%), ECs (6,5%) y Mφ/DC (3,0%), en arterias carótidas normales de ratón después de la digestión (Figura 3D-F).

Figura 1: Diagrama esquemático de la digestión de la arteria carótida del ratón. Después de aislar y cortar la arteria carótida del ratón, se añadieron 500 μL del reactivo de disociación A para disociar la arteria carótida del ratón. Cuando la suspensión celular se filtró y centrifugó, se agregaron 200 μL de reactivo de disociación B para una mayor disociación y obtener una suspensión de una sola célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación de suspensión unicelular de la arteria carótida de ratón. (A) La morfología celular y la viabilidad celular de las células de la arteria carótida después de 1 h de digestión con el reactivo de disociación A se muestran en la vista de campo claro y la tinción AOPI. Las células nucleadas teñidas con fluorescencia verde son células vivas, mientras que las teñidas con fluorescencia roja son células muertas. Barra de escala = 100 μm. (B) La morfología celular y la viabilidad celular de las células de la arteria carótida después de la digestión celular en dos pasos se muestran en la vista de campo claro y la tinción AOPI. Las células nucleadas teñidas con fluorescencia verde son células vivas, mientras que las teñidas con fluorescencia roja son células muertas. Barra de escala = 100 μm. (C) La viabilidad celular, el recuento total de células, el recuento de células viables y el diámetro promedio de las células se midieron después de la digestión celular en dos pasos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Métricas estándar de control de calidad (QC) para scRNA-seq y el paisaje celular de la arteria carótida. (A) Gráficos de violín que muestran la distribución de genes por célula (nFeature RNA), (B) UMI por célula (nCount_RNA) y (C) lecturas mitocondriales por célula (porcentaje mt) para los datos de scRNA-seq. (D) Gráfico de aproximación y proyección uniforme de variedades (UMAP) que muestra los cuatro tipos de células identificadas de la arteria carótida. (E) Diagrama de puntos que muestra los marcadores que definen cada tipo de grupo de células en el panel D. El tamaño de cada círculo denota la proporción de celdas dentro del grupo que expresa cada transcripción. Los puntos azules indican genes altamente expresados y los puntos grises indican genes con baja expresión. (F) Gráfico de barras apiladas que muestra la abundancia relativa de los cuatro tipos de células detectados por scRNA-seq de ratones de tipo salvaje (WT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje, en el que se construyó un método de digestión de dos pasos que integra el proceso de digestión de colagenasa/DNasa y tripsina. Tras el control de calidad de la suspensión unicelular, comprobamos que cumplía los requisitos para la secuenciación unicelular, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Además, una variedad de tipos de células en la arteria carótida, incluidas las CMV, los fibroblastos, las CE y las Mφ/DC, se detectaron con éxito después del procesamiento de datos de una sola célula.

Los métodos actuales para preparar suspensiones unicelulares carotídeas son todavía escasos. Depuydt et al. obtuvieron una suspensión unicelular a partir de placas carotídeas humanas combinando colagenasa, DNasa, fracción V de albúmina humana y flavopiridol a 37 °C durante 30 min¹⁵. Después de la clasificación celular activada por fluorescencia, identificaron 14 poblaciones celulares distintas, incluidas las células endoteliales, las células musculares lisas, los mastocitos, las células B, las células mieloides y las células T¹⁵. Además, los investigadores digirieron arterias carótidas comunes de ratas utilizando tripsina-EDTA al 0,25% y colagenasa al 0,1% a 37 °C y realizaron con éxito la secuenciación del ARN de una sola célula¹⁶. Se identificaron cinco tipos de células, incluyendo CMV, fibroblastos, CE, células transicionales y macrófagos, tanto en arterias carótidas normales como experimentales¹⁶. Además, también se ha establecido un protocolo para la obtención de preparados unicelulares enriquecidos con CE de la arteria carótida¹⁷. Después de completar la digestión enzimática luminal, el lavado de la arteria carótida obtendrá suficientes gránulos unicelulares para scRNAseq y scATACseq¹⁷. Para controlar de manera flexible el tiempo de digestión, desarrollamos un método de digestión de dos pasos para las arterias carótidas de ratón, separando los pasos de disociación tisular y preparación de suspensión unicelular. El proceso comienza con 125 CDU/mL de colagenasa II y 60 U/mL de DNasa I durante 1 h, seguido de tripsina sin EDTA durante 5 min. Significativamente, podemos modificar adecuadamente cualquier paso del método para la digestión de otros tejidos de vasos sanguíneos en función de las características de los vasos sanguíneos.

El método descrito tiene algunas limitaciones. En primer lugar, no sabemos si este método se puede utilizar para el cultivo celular primario in vitro. Dado que la pared de la arteria carótida es más delgada y tiene menos células, la forma de cultivar y expandir in vitro es un desafío. En segundo lugar, a diferencia de otros métodos de digestión, este protocolo requiere un pipeteo suave para disociar las células durante la digestión. Un baño de agua agitado también puede dar como resultado una suspensión unicelular de buena calidad. En tercer lugar, dado que nuestro método es aplicable a las arterias carótidas normales, queda por estudiar si es adecuado para la digestión de la placa carotídea.

En conclusión, diseñamos un método de digestión en dos pasos para obtener una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje. Este protocolo se puede utilizar para preparar suspensiones unicelulares para otros vasos con modificaciones menores, lo que lo hace muy útil en la investigación cardiovascular.