Summary
여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
경동맥은 뇌에 혈액과 산소를 공급하는 목의 주요 혈관이지만, 경동맥 협착증은 플라크로 경동맥이 막힐 때 발생합니다. 단세포 수준에서 경동맥의 세포 구성을 밝히는 것은 경동맥 죽상동맥경화증 치료에 필수적입니다. 그러나 경동맥에서 단세포 현탁액을 제조하기 위해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 세포 손상을 줄이면서 단세포 수준에서 정상 경동맥을 해리하는 데 적합한 프로토콜을 얻기 위해 콜라겐분해효소/DNase와 트립신의 분해 과정을 통합하여 2단계 소화 방법을 설계했습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 각 경동맥 세포에서 세포당 ~2500개의 전사체 중앙값이 검출되었습니다. 특히, 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피세포(EC), 대식세포 및 수지상세포(Mφ/DC)를 포함한 정상 경동맥의 다양한 세포 유형이 동시에 검출되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 갖는 다른 조직으로부터의 혈관의 단세포 현탁액을 제조하기 위해 적용될 수 있다.
Introduction
죽상동맥경화증은 고혈압, 고지혈증, 혈류역학 등의 위험인자와 관련된 만성 염증성 질환이다1. 경동맥 분기는 혈역학적 변화가 일어나기 쉬우며 경동맥 플라크 형성을 유발합니다. 경동맥 죽상동맥경화증의 임상적 양상은 뇌졸중, 일과성 뇌허혈과 같은 급성일 수도 있고, 재발성 일과성 뇌허혈, 혈관성 치매와 같은 만성일 수도 있다2. 기계적으로 경동맥 플라크는 병리학적 조건에서 서로 다른 혈관 벽 세포와 다양한 혈액 세포 간의 상호 작용의 결과입니다. 따라서 생리학적 및 병리학적 조건에서 경동맥의 단세포 아틀라스를 밝히는 것은 경동맥 플라크 발생을 예방하고 치료하는 데 특히 중요합니다.
단일 세포 RNA 염기서열 분석은 초고분해능과 동일한 세포 유형의 유기체에서 세포 이질성을 검출하기 때문에 생물학 연구의 가장 강력한 기술중 하나입니다 3,4. 연구자들은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 심혈관 질환5 및 암6과 같은 많은 분야에서 연구를 수행했습니다. 그러나 조직을 단일 세포로 빠르고 정확하게 분리하는 것은 여전히 주요 과제 중 하나입니다. 효소 해리는 콜라겐분해효소, 파파인, 트립신, DNase 및 히알루로니다아제를 주로 포함하는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 특히, 콜라겐분해효소는 단세포 소화를 위한 주요 효소 종으로, 주로 결합 조직의 콜라겐 성분을 가수분해합니다. 다양한 콜라겐분해효소 유형은 유선7, 사구체8, 홍채각9, 무릎관절10, 대동맥11, 폐12와 같은 다양한 조직의 해리에 적용할 수 있다. 서로 다른 조직의 고유한 생리학적 특성으로 인해 동일한 방법을 사용한 해리는 낮은 세포 생존율, 낮은 세포 수 및 큰 세포 파편과 같은 단일 세포를 획득하는 데 많은 문제를 일으킬 수 있습니다. 그러므로, 상이한 조직에 대한 분해 방법의 발명은 고품질 단세포 현탁액을 제조하는 데 필수적이다.
이 프로토콜은 야생형 마우스의 경동맥의 단세포 현탁액을 제조하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 경동맥의 특성에 따라 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 생쥐 경동맥의 고품질 단세포 현탁액을 얻었는데, 이는 콜라겐분해효소가 경동맥 조직의 콜라겐을 가수분해할 수 있기 때문이며, 이는 트립신에 의해 단세포 현탁액으로 더 소화되었습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 소화 후 정상 마우스 경동맥에서 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피 세포(EC), 대식세포 및 수지상 세포(Mφ/DC)를 포함한 4가지 세포 유형이 확인되었습니다. 이 프로토콜의 장점은 1) 경동맥의 여러 세포 유형을 식별할 수 있고, 2) 세포 생존율이 잘 보존되며, 3) 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단세포 다중체학 연구에 관심이 있는 연구자에게 적합합니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 통해 다른 혈관을 해리하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
아래에 설명된 모든 동물 시술은 Soochow University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 시약 및 재료 준비
- 칼슘과 마그네슘이 없는 1x PBS와 2.5U/mL 헤파린 나트륨염을 사용하여 관류 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 사용 시 얼음에서 예식하십시오.
- 1250 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 3000 U/mL DNase I을 HBSS로 희석하여 125 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 60 U/mL DNase I을 포함하는 해리 시약 A를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 0.25% EDTA-free 트립신 1mL(페놀 레드 제외) 1mL를 1x PBS 1mL로 희석하여 최종 농도 0.12% 트립신을 포함하는 해리 시약 B를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 1x PBS에 10% FBS 1.5mL와 5% FBS 10mL를 준비합니다. 1.5% FBS를 사용하여 경동맥을 모으고 사용하기 전에 얼음 위에 보관하십시오. 5% FBS를 사용하여 소화를 중화하고 실온(RT)에서 보관하십시오.
- 1mL 주사기, 26G 니들이 있는 20mL 주사기, 6웰 세포 배양 플레이트, 1.5mL 원심분리 튜브, 40μm 멸균 세포 여과기 및 얼음 용기를 포함한 실험 재료를 준비하십시오.
2. 장비 준비
- 실체 현미경, 해부 가위, 미세 해부 가위, 미세 끝 집게를 포함한 모든 수술 장비를 소독합니다.
- 자동 셀 카운터를 켜고 RT로 유지하십시오.
- 미리 수조를 37°C로 켭니다.
- 사용하기 전에 마이크로 원심분리기를 4°C로 사전 냉각하십시오.
3. 마우스 경동맥의 격리
- 복강내 주사(체중 10g당 0.24mL)로 1.25% 트리브로모에탄올을 사용하여 마우스를 마취하고 3분 후 직립 반사가 있는지 확인하기 위해 마우스를 뒤집습니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시키고 등을 눕힙니다. 쥐의 피부에 75% 알코올을 뿌립니다.
- 멸균 된 해부 가위를 사용하여 피부를 열고 흉강을 노출시킵니다. 다이어프램을 잘라 엽니다.
- 아래턱까지 위쪽으로 계속 자르고 과도한 결합 조직과 지방을 조심스럽게 제거하여 경동맥을 노출시킵니다.
- 쥐의 하대정맥을 잘라 닫힌 순환계에서 혈류가 나오도록 합니다.
- 20mL의 미리 냉각된 관류 용액을 주사기로 좌심실에 천천히 지속적으로 주입합니다.
알림: 관류가 성공하면 간, 비장, 신장과 같은 혈액이 풍부한 기관이 회백색으로 변합니다. - 입체 현미경으로 미세 해부 가위로 경동맥 주변의 모든 지방과 결합 조직을 벗겨냅니다.
알림: 이 단계는 경동맥의 손상을 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 수행해야 합니다. - 마우스에서 경동맥을 분리하고 1x PBS로 세척하여 혈액을 다시 씻어낸 다음 얼음 위에 1.5% FBS가 포함된 6웰 플레이트로 옮깁니다.
4. 경동맥을 단세포 현탁액으로 소화
- 미세 해부 가위를 사용하여 경동맥을 세로로 절개하고 얼음 위에 1.5% FBS 1mL가 들어 있는 다른 6웰 세포 배양 플레이트에 평평하게 눕힙니다.
- 잔류 혈액을 제거하기 위해 1.5% FBS로 조심스럽게 내정을 씻어냅니다.
알림: 내피 세포가 손상되지 않도록 세척은 부드럽고 천천히 이루어져야 합니다. - 각 경동맥을 약 2mm2 개의 티슈 조각으로 자르고 1.5 % FBS의 미세 해부 가위를 사용합니다.
- 이 조직 조각을 1mL 너비의 보어 팁이 있는 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 조직을 바닥으로 가라앉힙니다.
- 상층액을 버리고 500μL의 해리 시약 A에 조직을 재현탁시킵니다.
- 튜브를 37°C 수조에 1시간 동안 넣습니다. 10분마다 1mL 피펫으로 부드럽게 피펫팅합니다.
- 500μL의 5% FBS를 튜브에 넣고 1mL 피펫과 잘 섞습니다.
- 40μm 멸균 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 1.5mL 원심분리 튜브로 여과하고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 조심스럽게 제거하고 200μL의 해리 시약 B에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 37°C 수조에 넣고 5분간 더 소화시킵니다. 분해 중 2분마다 부드럽게 피펫팅하여 단세포 현탁액으로 완전히 해리합니다.
- 200μL의 5% FBS를 사용하여 분해 반응을 종료하고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 셀 펠릿을 얼음 위의 1x PBS 100μL에 재현탁시킵니다.
5. 세포 현탁액 검사 및 단세포 RNA 염기서열 분석
- 10μL의 AO/PI 용액을 10μL의 단일 셀 현탁액에 넣고 20μL 피펫과 부드럽게 혼합합니다.
- 혼합물 20μL를 챔버에 피펫팅하고 1분 동안 기다립니다.
- 슬라이드를 자동 세포 계수기 기기에 로드합니다.
- AO/PI Viability assay를 선택한 다음 품질 보고서를 기다립니다.
- 단일 세포 3ʹ 시약 키트를 사용하여 단일 세포 컨트롤러의 에멀젼에서 단일 세포 겔 비드를 생성하고 제조업체의 프로토콜에 따라 열 순환기에서 바코드가 찍힌 cDNA를 증폭합니다.
참고: 여기서는 Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3을 사용하였다. - paired-end 150 bp (PE150) 판독 전략으로 시퀀서에서 염기서열분석을 수행합니다. 소프트웨어 애플리케이션(Cell Ranger)을 사용하여 mkfastq 파이프라인을 사용하여 원시 기본 호출 파일을 fastq 파일로 변환합니다. 그런 다음, 정렬, 필터링, 바코드 카운팅 및 고유 분자 식별자(UMI) 카운팅을 수행하기 위해 Cell Ranger의 Count Pipeline 을 사용하여 특징-바코드 매트릭스13을 생성한다.
- R 패키지 Seurat14를 사용하여 데이터 차원 축소 및 시각화를 수행합니다.
- 먼저 Seurat의 Read10X() 함수는 Cell Ranger 파이프라인의 출력을 읽은 다음 count 행렬을 사용하여 Seurat 객체를 만듭니다. 그런 다음 <200 또는 >4000 유전자의 발현 또는 Seurat의 subset() 함수에 의해 10% 이상의 미토콘드리아 유전자 비율을 가진 세포를 걸러냅니다.
- NormalizeData() 및 FindVariableFeatures()를 사용하여 데이터를 정규화하고 각각 2000개의 매우 가변적인 특징을 식별합니다.
- 스케일링된 데이터에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행하고 dims = 30 및 resolution = 0.5를 사용하여 셀을 군집화합니다. 마지막으로 RunUMAP () 함수를 사용하여 단일 셀 데이터 세트를 시각화하고 FindAllMarkers() 를 사용하여 각 클러스터 바이오마커를 찾습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 설명합니다(그림 1). 이 2단계 세포 분해 방법은 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 쥐 경동맥 혈관벽을 효과적으로 해리하여 단일 세포 염기서열 분석을 위한 고품질 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 해리 후, 세포 농도 및 세포 생존율은 자동화된 세포 카운터에 의해 계산되었습니다. 명시야는 소화 후 경동맥 혈관 세포의 형태를 보여주었고, AOPI 이중 형광 염색은 세포 생존율을 동시에 검출했습니다(그림 2A,B). 특히, 해리 시약 A를 단독으로 사용하는 것과 비교했을 때, 경동맥 조직은 해리 시약 B와 병용할 때 더 철저하게 해리될 수 있습니다. 또한 9개의 동맥에서 생존 가능한 세포 수를 발견했으며, 평균 세포 직경은 2단계 세포 분해 후 단일 세포 염기서열 분석의 요구 사항을 충족했습니다(그림 2C). 한편, 9개의 좌경동맥에서 총 176,000개의 단세포를 수집했으며, 대부분의 혈관은 생존율이 높은 단세포로 해리되었습니다(그림 2C).
정렬, 필터링, 바코드 카운팅 및 UMI 카운팅 후 단일 세포 시퀀싱의 원시 데이터는 R 패키지 Seurat로 분석되었습니다. 세포당 유전자 분포, 세포당 UMI, 세포당 미토콘드리아 판독은 바이올린 플롯에 나와 있습니다(그림 3A-C). 특히, 각 경동맥 세포에서 세포당 ~2500개의 전사체 중앙값이 검출되었습니다. 품질이 낮은 세포를 제거한 후 14,580개의 세포를 검출하여 다운스트림 단일 세포 RNA-seq 분석에 사용했습니다. 유사한 프로파일을 가진 2000개의 가변 유전자를 사용한 비지도 Seurat 기반 클러스터링은 소화 후 정상 마우스 경동맥에서 VSMC(74.0%), 섬유아세포(16.5%), EC(6.5%) 및 Mφ/DC(3.0%)를 포함한 4가지 주요 세포 유형을 보여주었습니다(그림 3D-F).
그림 1: 쥐의 경동맥 소화 개략도. 마우스 경동맥을 분리하고 절단한 후, 500μL의 해리 시약 A를 첨가하여 마우스 경동맥을 해리시켰다. 세포 현탁액을 여과하고 원심분리할 때, 추가 해리를 위해 200μL의 해리 시약 B를 첨가하여 단일-세포 현탁액을 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 경동맥의 단세포 현탁액 준비. (A) 해리 시약 A로 1시간 분해 후 경동맥 세포의 세포 형태 및 세포 생존율은 명시야 보기 및 AOPI 염색에 표시됩니다. 녹색 형광으로 염색된 유핵 세포는 살아있는 세포이고 적색 형광으로 염색된 세포는 죽은 세포입니다. 척도 막대 = 100μm. (B) 2단계 세포 분해 후 경동맥 세포의 세포 형태 및 세포 생존율은 명시야 보기 및 AOPI 염색에 표시됩니다. 녹색 형광으로 염색된 유핵 세포는 살아있는 세포이고 적색 형광으로 염색된 세포는 죽은 세포입니다. 척도 막대 = 100 μm. (C) 세포 생존율, 총 세포 수, 생존 가능한 세포 수 및 평균 세포 직경은 2단계 세포 분해 후 측정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: scRNA-seq 및 경동맥의 세포 경관에 대한 표준 품질 관리(QC) 지표. (A) scRNA-seq 데이터에 대한 세포당 유전자 분포(nFeature RNA), (B) 세포당 UMI(nCount_RNA) 및 (C) 세포당 미토콘드리아 판독(percent mt)을 보여주는 바이올린 플롯. (D) 경동맥의 확인된 4가지 세포 유형을 보여주는 UMAP(Uniform Manifold approximation and projection) 플롯. (E) 패널 D에서 각 유형의 셀 클러스터를 정의하는 마커를 보여주는 점도표. 각 원의 크기는 각 전사체를 표현하는 그룹 내의 세포 비율을 나타냅니다. 파란색 점은 발현이 많은 유전자를 나타내고 회색 점은 발현이 낮은 유전자를 나타냅니다. (F) 야생형 마우스(WT)의 scRNA-seq에 의해 검출된 4가지 세포 유형의 상대적 존재량을 보여주는 누적 막대 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 야생형 마우스의 경동맥에서 콜라겐분해효소/DNase 및 트립신의 소화 과정을 통합하는 2단계 소화 방법을 구축한 고품질 단세포 현탁액을 제조하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 품질 검사 후, 우리는 그것이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족한다는 것을 발견했습니다. 또한 VSMC, 섬유아세포, EC 및 Mφ/DC를 포함한 경동맥의 다양한 세포 유형이 단일 세포 데이터 처리 후 성공적으로 검출되었습니다.
경동맥 단세포 현탁액을 준비하는 현재의 방법은 여전히 부족합니다. Depuydt et al.은 37°C에서 30분 동안 콜라겐분해효소, DNase, 인간 알부민 분획 V 및 플라보피리돌을 결합하여 인간 경동맥 플라크로부터 단세포 현탁액을 얻었다15. 형광 활성화 세포 분류 후 내피 세포, 평활근 세포, 비만 세포, B 세포, 골수성 세포 및 T 세포를 포함한 14개의 뚜렷한 세포 집단을 식별했습니다15. 또한, 연구진은 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA와 0.1% 콜라겐분해효소를 사용하여 쥐의 총경동맥을 소화하고 단세포 RNA 염기서열분석을 성공적으로 수행했습니다16. VSMC, 섬유아세포, EC, 전이 세포 및 대식세포를 포함한 5가지 세포 유형이 정상 및 실험 경동맥 모두에서 확인되었습니다16. 또한, 경동맥의 EC-농축 단세포 제제를 얻기 위한 프로토콜도 확립되었다17. 발광 효소 분해를 완료한 후 경동맥 플러싱은 scRNAseq 및 scATACseq17에 충분한 단세포 펠릿을 얻습니다. 소화 시간을 유연하게 제어하기 위해 쥐 경동맥에 대한 2단계 분해 방법을 개발하여 조직 해리 단계와 단세포 현탁액 준비 단계를 분리했습니다. 이 과정은 1시간 동안 125 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 60 U/mL DNase I로 시작되며, 5분 동안 EDTA가 없는 트립신이 뒤따릅니다. 의미심장하게도, 우리는 혈관의 특성에 기초하여 다른 혈관 조직의 소화를 위한 방법의 모든 단계를 적절하게 수정할 수 있다.
설명된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 방법을 시험관 내 1차 세포 배양에 사용할 수 있는지 여부는 알 수 없습니다. 경동맥 벽은 더 얇고 세포가 적기 때문에 체외에서 배양하고 확장하는 방법이 어렵습니다. 둘째, 다른 분해 방법과 달리 이 프로토콜은 분해 중에 세포를 해리하기 위해 부드러운 피펫팅이 필요합니다. 흔들리는 수조는 또한 좋은 품질의 단세포 현탁액을 생성할 수 있습니다. 셋째, 본 방법은 정상 경동맥에 적용할 수 있기 때문에 경동맥 플라크의 소화에 적합한지 여부는 아직 연구되어야 한다.
결론적으로, 우리는 야생형 마우스의 경동맥에서 고품질 단세포 현탁액을 얻기 위해 2단계 소화 방법을 설계했습니다. 이 프로토콜은 경미한 변형이 있는 다른 혈관에 대한 단세포 현탁액을 준비하는 데 사용할 수 있어 심혈관 연구에 매우 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 자연과학재단(82070450 to C.T.and 82170466 to L.Z.)과 중국 박사후 과학 재단(China Postdoctoral Science Foundation)의 펠로우십(7121102223 to F.L.)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
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