Herstellung einer Einzelzellsuspension aus den Halsschlagadern der Maus für die Einzelzellsequenzierung

Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die mit Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Hyperlipidämie und Hämodynamik einhergeht¹. Die Verzweigungen der Halsschlagader sind anfällig für hämodynamische Veränderungen und führen zur Bildung von Halsschlagadern. Das klinische Erscheinungsbild der Carotis-Atherosklerose kann akut wie Schlaganfall und vorübergehende zerebrale Ischämie oder chronisch wie rezidivierende transiente zerebrale Ischämie und vaskuläre Demenz^{sein 2}. Mechanisch gesehen ist die Halsschlagader das Ergebnis der Interaktion zwischen verschiedenen Gefäßwandzellen und verschiedenen Blutzellen unter pathologischen Bedingungen. Daher ist die Freilegung des einzelligen Atlas der Halsschlagader unter physiologischen und pathologischen Bedingungen besonders wichtig für die Vorbeugung und Behandlung der Entwicklung von Halsschlagadern.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist aufgrund ihrer ultrahohen Auflösung und des Nachweises der Zellheterogenität desselben Zelltyps von Organismen eine der leistungsfähigsten Technologien der biologischen Forschung ^3,4. Forscher haben die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet, um Forschung in vielen Bereichen durchzuführen, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen⁵ und Krebs⁶. Die schnelle und genaue Trennung von Geweben in einzelne Zellen ist jedoch immer noch eine der größten Herausforderungen. Die enzymatische Dissoziation ist eine häufig verwendete Methode, die hauptsächlich Kollagenase, Papain, Trypsin, DNase und Hyaluronidase umfasst. Insbesondere Kollagenasen sind die wichtigsten Enzymspezies für die Einzelzellverdauung, die hauptsächlich Kollagenkomponenten im Bindegewebe hydrolysiert. Verschiedene Kollagenasetypen sind für die Dissoziation verschiedener Gewebe geeignet, wie z. B. der Brustdrüse⁷, des Glomerulus⁸, des Iridokornealwinkels⁹, des Kniegelenks¹⁰, der Aorta 11 und der Lunge¹². Aufgrund der einzigartigen physiologischen Eigenschaften verschiedener Gewebe kann die Dissoziation mit der gleichen Methode viele Probleme bei der Erfassung einzelner Zellen verursachen, wie z. B. eine geringe Zelllebensfähigkeit, eine geringe Zellzahl und große Zelltrümmer. Daher ist die Erfindung von Aufschlussmethoden für verschiedene Gewebe für die Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen unerlässlich.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine zweistufige Zellverdauungsmethode zu entwickeln, um eine Einzelzellsuspension der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen herzustellen. Entsprechend den Eigenschaften der Halsschlagader kombinierten wir Kollagenase/DNase mit Trypsin, um eine hochwertige Einzelzellsuspension der Halsschlagader der Maus zu erhalten, da Kollagenase Kollagen des Halsschlagaders hydrolysieren kann, das durch Trypsin zu einer Einzelzellsuspension weiter verdaut wurde. Die duale Fluoreszenzzählung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen zu bestimmen, und es wurde festgestellt, dass die Einzelzellsuspension die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration. Nach der Verarbeitung von Einzelzelldaten wurden vier Zelltypen, darunter vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs), Fibroblasten, Endothelzellen (ECs) sowie Makrophagen und dendritische Zellen (Mφ/DCs), in normalen Halsschlagadern der Maus nach der Verdauung identifiziert. Die Vorteile dieses Protokolls sind: 1) mehrere Zelltypen in der Halsschlagader identifiziert werden können, 2) die Zelllebensfähigkeit gut erhalten bleibt und 3) es ohne spezielle Ausrüstung leicht wiederholt werden kann. Dieses Protokoll eignet sich für Forscher, die daran interessiert sind, Einzelzell-Multiomics der Halsschlagadern der Maus zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auch bei der Dissoziation anderer Blutgefäße mit entsprechenden Modifikationen hilfreich sein.

Alle unten beschriebenen Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Soochow University genehmigt.

1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien

1. Verwenden Sie 1x PBS ohne Kalzium und Magnesium und 2,5 U/ml Heparin-Natriumsalz, um die Perfusionslösung herzustellen. Bei 4 °C lagern und bei Gebrauch auf Eis vorkühlen.
2. Bereiten Sie das Dissoziationsreagenz A vor, das 125 CDU/ml Kollagenase II und 60 U/ml DNase I enthält, indem Sie 1250 CDU/ml Kollagenase II und 3000 U/ml DNase I mit HBSS verdünnen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
3. Bereiten Sie das Dissoziationsreagenz B vor, das eine Endkonzentration von 0,12 % Trypsin enthält, indem 1 ml 0,25 % EDTA-freies Trypsin (ohne Phenolrot) in 1 ml 1x PBS verdünnt werden. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
4. Bereiten Sie 10 ml 1,5 % FBS und 10 ml 5 % FBS in 1x PBS vor. Verwenden Sie 1,5 % FBS, um die Halsschlagadern zu poolen, und lassen Sie sie vor der Anwendung auf Eis. Verwenden Sie 5% FBS, um die Verdauung zu neutralisieren, und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
5. Holen Sie sich die Versuchsmaterialien, darunter 1-ml-Spritzen, 20-ml-Spritzen mit 26-G-Nadeln, Sechs-Well-Zellkulturplatten, 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, sterile 40-μm-Zellsiebe und Eisbehälter.

2. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte, einschließlich eines stereoskopischen Mikroskops, einer Präparierschere, einer Mikropräparierschere und einer Pinzette mit feiner Spitze.
2. Schalten Sie den automatischen Zellzähler ein und halten Sie ihn auf RT.
3. Schalten Sie das Wasserbad vorher auf 37 °C ein.
4. Die Mikrozentrifuge vor Gebrauch auf 4 °C vorkühlen.

3. Isolierung der Halsschlagader der Maus

1. Betäuben Sie die Maus mit 1,25% Tribromethanol durch intraperitoneale Injektion (0,24 ml pro 10 g Körpergewicht) und drehen Sie die Maus um, um zu überprüfen, ob nach 3 Minuten ein Aufrichtungsreflex vorliegt. Euthanasieren Sie dann die Maus durch Zervixluxation und legen Sie sie auf den Rücken. Besprühen Sie die Haut der Maus mit 75%igem Alkohol.
2. Verwenden Sie eine sterilisierte Präparierschere, um die Haut zu öffnen und die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie die Membran auf.
3. Schneiden Sie weiter nach oben bis zum Unterkiefer und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Bindegewebe und Fett, wobei die Halsschlagader freigelegt wird.
4. Durchtrennen Sie die untere Hohlvene der Maus, damit das Blut aus dem geschlossenen Kreislauf fließt.
5. Injizieren Sie 20 ml vorgekühlte Perfusionslösung mit einer Spritze langsam und kontinuierlich in die linke Herzkammer.
   HINWEIS: Wenn die Durchblutung erfolgreich ist, werden blutreiche Organe wie Leber, Milz und Nieren grau-weiß.
6. Ziehen Sie das gesamte Fett und Bindegewebe um die Halsschlagader herum mit einer Mikropräparierschere unter einem stereoskopischen Mikroskop ab.
   HINWEIS: Dieser Schritt sollte langsam und vorsichtig durchgeführt werden, um eine Schädigung der Halsschlagader zu vermeiden.
7. Isolieren Sie die Halsschlagader von der Maus, waschen Sie sie mit 1x PBS, um das Blut wieder zu spülen, und geben Sie es auf Sechs-Well-Platten mit 1,5 % FBS auf Eis.

4. Verdau der Halsschlagader zu Einzelzellsuspension

1. Verwenden Sie eine Mikropräparierschere, um die Halsschlagader in Längsrichtung zu präparieren, und legen Sie sie flach in eine weitere 6-Well-Zellkulturplatte, die 1 ml 1,5 % FBS auf Eis enthält.
2. Spülen Sie die Intima vorsichtig mit 1,5% FBS aus, um das Restblut zu entfernen.
   HINWEIS: Die Spülung sollte sanft und langsam erfolgen, um eine Verletzung der Endothelzellen zu vermeiden.
3. Schneiden Sie jede Halsschlagader mit einer Mikropräparierschere in 1,5 % FBS in ca.^{2 mm 2} Gewebestücke.
4. Diese Gewebestücke werden in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 mL-Spitze mit breiter Bohrung überführt, 5 Minuten lang bei 400 x g bei 4 °C zentrifugiert, um das Gewebe auf den Boden zu senken.
5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Gewebe in 500 μl Dissoziationsreagenz A.
6. Legen Sie das Röhrchen für 1 h in ein 37 °C warmes Wasserbad. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette alle 10 Minuten.
7. Geben Sie 500 μl 5% FBS in das Röhrchen und mischen Sie es gut mit einer 1-ml-Pipette.
8. Die Zellsuspension wird durch ein 40 μm steriles Zellsieb in ein neues 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen filtriert und bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
9. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Dissoziationsreagenz B.
10. In ein 37 °C warmes Wasserbad geben und weitere 5 Minuten verdauen. Während des Aufschlusses alle 2 Minuten vorsichtig pipettieren, um vollständig in eine einzellige Suspension zu dissoziieren.
11. Verwenden Sie 200 μl 5%ige FBS, um die Aufschlussreaktion zu beenden, und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
12. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl 1x PBS auf Eis.

5. Untersuchung der Zellsuspension und Einzelzell-RNA-Sequenzierung

1. 10 μl AO/PI-Lösung in 10 μl Einzelzellsuspension geben und vorsichtig mit einer 20-μl-Pipette mischen.
2. Pipettieren Sie 20 μl der Mischung in den Kammerschieber und warten Sie 1 Minute.
3. Laden Sie den Objektträger in das automatische Zellzählergerät.
4. Wählen Sie den AO/PI-Viabilitäts-Assay aus und warten Sie auf den Qualitätsbericht.
5. Verwenden Sie ein einzelliges 3-Zoll-Reagenzienkit, um einzellige Gelkügelkügelchen in der Emulsion auf einem Einzelzell-Controller zu erzeugen und die mit Barcode versehene cDNA in einem Thermocycler gemäß dem Protokoll des Herstellers zu amplifizieren.
   HINWEIS: Hier wurden Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 verwendet.
6. Führen Sie die Sequenzierung auf einem Sequenzer mit einer Paired-End-Lesestrategie von 150 bp (PE150) durch. Verwenden Sie eine Softwareanwendung (Cell Ranger), um unformatierte Basisaufrufdateien mithilfe der mkfastq-Pipeline in fastq-Dateien zu konvertieren. Verwenden Sie dann die Count-Pipeline von Cell Ranger für die Ausrichtung, Filterung, Barcode-Zählung und UMI-Zählung (Unique Molecular Identifier), um Merkmals-Barcode-Matrizen zu generieren¹³.
7. Führen Sie die Reduzierung der Datendimensionalität und Visualisierung mit dem R-Paket Seurat¹⁴ durch.
   1. Zuerst liest die Read10X()- Funktion von Seurat die Ausgabe der Cell Ranger-Pipeline ein und verwendet dann die Zählmatrix, um ein Seurat-Objekt zu erstellen. Filtern Sie dann die Zellen heraus, die <200 oder >4000 Gene oder ein mitochondriales Genverhältnis von mehr als 10% durch die subset()- Funktion von Seurat betrugen.
   2. Verwenden Sie NormalizeData() und FindVariableFeatures(), um die Daten zu normalisieren bzw. 2000 hochvariable Features zu identifizieren.
   3. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die skalierten Daten durch, und gruppieren Sie die Zellen mit Dims = 30 und Auflösung = 0,5. Verwenden Sie abschließend die Funktion RunUMAP (), um die Einzelzelldatensätze zu visualisieren, und FindAllMarkers(), um die einzelnen Cluster-Biomarker zu finden.

Dieses Protokoll beschreibt eine zweistufige Zellverdauungsmethode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension von Maus-Halsschlagadern (Abbildung 1). Diese zweistufige Zellverdauungsmethode kombiniert Kollagenase/DNase mit Trypsin, um die Gefäßwand der Halsschlagader der Maus effektiv zu dissoziieren und hochwertige Einzelzellsuspensionen für die Einzelzellsequenzierung zu erhalten. Nach der Dissoziation wurden die Zellkonzentration und die Zellviabilität mit einem automatisierten Zellzähler berechnet. Das helle Feld zeigte die Morphologie der Halsschlagader-Gefäßzellen nach der Verdauung, und die AOPI-Dual-Fluoreszenz-Färbung detektierte gleichzeitig die Zelllebensfähigkeit (Abbildung 2A,B). Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zur alleinigen Verwendung von Dissoziationsreagenz A das Gewebe der Halsschlagader gründlicher dissoziiert werden kann, wenn es mit Dissoziationsreagenz B kombiniert wird. Darüber hinaus fanden wir eine lebensfähige Zellzahl von neun Arterien, und der durchschnittliche Zelldurchmesser erfüllte die Anforderungen der Einzelzellsequenzierung nach zweistufigem Zellverdau (Abbildung 2C). In der Zwischenzeit wurden insgesamt 176.000 Einzelzellen aus neun linken Halsschlagaden entnommen, und die meisten Gefäßgefäße wurden in Einzelzellen mit hoher Lebensfähigkeit dissoziiert (Abbildung 2C).

Nach dem Alignment, der Filterung, der Barcode-Zählung und der UMI-Zählung wurden die Rohdaten der Einzelzellsequenzierung mit dem R-Paket Seurat analysiert. Die Verteilung der Gene pro Zelle, der UMI pro Zelle und der mitochondrialen Reads pro Zelle sind in Violindiagrammen dargestellt (Abbildung 3A-C). Bemerkenswert ist, dass ein Median von ~2500 Transkripten pro Zelle in jeder Zelle der Halsschlagader nachgewiesen wurde. Nach der Entfernung der minderwertigen Zellen wurden 14.580 Zellen detektiert und für die nachgeschaltete Einzelzell-RNA-seq-Analyse verwendet. Unter Verwendung von 2000 variablen Genen mit ähnlichen Profilen zeigte das unüberwachte Seurat-basierte Clustering vier Hauptzelltypen, darunter VSMCs (74,0 %), Fibroblasten (16,5 %), ECs (6,5 %) und Mφ/DCs (3,0 %) in normalen Karotisaterien der Maus nach der Verdauung (Abbildung 3D-F).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Verdauung der Halsschlagader der Maus. Nachdem die Halsschlagader der Maus isoliert und durchtrennt worden war, wurden 500 μl Dissoziationsreagenz A zugegeben, um die Halsschlagader der Maus zu dissoziieren. Wenn die Zellsuspension filtriert und zentrifugiert wurde, wurden 200 μl Dissoziationsreagenz B zur weiteren Dissoziation zugegeben, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Einzelzelliges Suspensionspräparat aus der Halsschlagader der Maus . (A) Die Zellmorphologie und Zelllebensfähigkeit von Halsschlagaderzellen nach 1 h Verdauung mit Dissoziationsreagenz A sind in der Hellfeldansicht und der AOPI-Färbung dargestellt. Kernhaltige Zellen, die mit grüner Fluoreszenz gefärbt sind, sind lebende Zellen, während diejenigen, die mit roter Fluoreszenz gefärbt sind, tote Zellen sind. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Die Zellmorphologie und Zelllebensfähigkeit von Halsschlagaderzellen nach zweistufigem Zellverdau sind in der Hellfeldansicht und der AOPI-Färbung dargestellt. Kernhaltige Zellen, die mit grüner Fluoreszenz gefärbt sind, sind lebende Zellen, während diejenigen, die mit roter Fluoreszenz gefärbt sind, tote Zellen sind. Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Die Zelllebensfähigkeit, die Gesamtzellzahl, die Anzahl lebensfähiger Zellen und der durchschnittliche Zelldurchmesser wurden nach zweistufigem Zellverdau gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Standard-Qualitätskontrollmetriken (QC) für scRNA-seq und die Zelllandschaft der Halsschlagader. (A) Violindiagramme, die die Verteilung der Gene pro Zelle (nFeature-RNA), (B) UMI pro Zelle (nCount_RNA) und (C) mitochondriale Reads pro Zelle (Prozent mt) für die scRNA-seq-Daten zeigen. (D) UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection), das die vier identifizierten Zelltypen der Halsschlagader zeigt. (E) Punktdiagramm mit den Markern, die jeden Typ von Zellhaufen in Feld D definieren. Die Größe jedes Kreises gibt den Zellanteil innerhalb der Gruppe an, die jedes Transkript ausdrückt. Die blauen Punkte stehen für stark exprimierte Gene und die grauen Punkte für Gene mit geringer Expression. (F) Gestapelter Balkenplot, der die relative Häufigkeit der vier Zelltypen zeigt, die durch scRNA-seq von Wildtyp-Mäusen (WT) nachgewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen zur Verfügung, in dem eine zweistufige Verdauungsmethode entwickelt wurde, die den Verdauungsprozess von Kollagenase/DNase und Trypsin integriert. Nach der Qualitätsprüfung der Einzelzellsuspension stellten wir fest, dass sie die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration. Darüber hinaus wurde eine Vielzahl von Zelltypen in der Halsschlagader, darunter VSMCs, Fibroblasten, ECs und Mφ/DCs, nach Einzelzell-Datenverarbeitung erfolgreich detektiert.

Derzeitige Methoden zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen der Halsschlagader sind noch rar. Depuydt et al. erhielten eine Einzelzellsuspension aus menschlichen Karotisplaques, indem sie Kollagenase, DNase, humane Albuminfraktion V und Flavopiridol bei 37 °C für 30 Minuten kombinierten¹⁵. Nach der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung identifizierten sie 14 verschiedene Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Mastzellen, B-Zellen, myeloische Zellen und T-Zellen¹⁵. Darüber hinaus verdauten die Forscher die gemeinsamen Halsschlagadern der Ratte mit 0,25 % Trypsin-EDTA und 0,1 % Kollagenase bei 37 °C und führten erfolgreich eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung durch¹⁶. Fünf Zelltypen, darunter VSMCs, Fibroblasten, ECs, Übergangszellen und Makrophagen, wurden sowohl in normalen als auch in experimentellen Halsschlagadern identifiziert¹⁶. Darüber hinaus wurde ein Protokoll zur Gewinnung von EC-angereicherten Einzelzellpräparaten der Halsschlagader erstellt¹⁷. Nach Abschluss der luminalen enzymatischen Verdauung erhält die Spülung der Halsschlagader genügend einzellige Pellets für scRNAseq und scATACseq¹⁷. Um die Verdauungszeit flexibel steuern zu können, haben wir eine zweistufige Verdauungsmethode für die Halsschlagadern von Mäusen entwickelt, die die Schritte der Gewebedissoziation und der Einzelzellsuspensionspräparation trennt. Der Prozess beginnt mit 125 CDU/mL Kollagenase II und 60 U/mL DNase I für 1 h, gefolgt von EDTA-freiem Trypsin für 5 min. Bezeichnenderweise können wir jeden Schritt der Methode zur Verdauung anderer Blutgefäßgewebe auf der Grundlage der Eigenschaften der Blutgefäße entsprechend modifizieren.

Es gibt einige Einschränkungen der beschriebenen Methode. Erstens wissen wir nicht, ob diese Methode für die primäre Zellkultur in vitro verwendet werden kann. Da die Wand der Halsschlagader dünner ist und weniger Zellen enthält, ist es schwierig, in vitro zu kultivieren und zu expandieren. Zweitens erfordert dieses Protokoll im Gegensatz zu anderen Verdauungsmethoden sanftes Pipettieren, um die Zellen während der Verdauung zu dissoziieren. Ein Schüttelwasserbad kann auch zu einer qualitativ hochwertigen Einzelzellsuspension führen. Drittens, da unsere Methode auf normale Halsschlagadern anwendbar ist, muss noch untersucht werden, ob sie für die Verdauung von Halsschlagadern geeignet ist.

Zusammenfassend haben wir eine zweistufige Verdauungsmethode entwickelt, um eine hochwertige Einzelzellsuspension aus der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen zu erhalten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Einzelzellsuspensionen für andere Gefäße mit geringfügigen Modifikationen herzustellen, was es in der kardiovaskulären Forschung sehr hilfreich macht.