Summary
نصف هنا بروتوكول هضم الخلايا المكون من خطوتين لإعداد تعليق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر.
Abstract
الشرايين السباتية هي أوعية دموية رئيسية في الرقبة تمد الدماغ بالدم والأكسجين، ولكن يحدث تضيق الشريان السباتي عندما تكون الشرايين السباتية مسدودة باللويحات. يعد الكشف عن التركيب الخلوي للشريان السباتي على مستوى الخلية الواحدة أمرا ضروريا لعلاج تصلب الشرايين السباتي. ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول جاهز للاستخدام لإعداد معلقات أحادية الخلية من الشرايين السباتية. للحصول على بروتوكول مناسب لتفكك الشرايين السباتية الطبيعية على مستوى الخلية الواحدة مع ضرر أقل للخلايا ، قمنا بتصميم طريقة هضم من خطوتين من خلال دمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتريبسين. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم الكشف عن متوسط ~ 2500 نسخة لكل خلية في كل خلية شريان سباتي. والجدير بالذكر أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي الطبيعي ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، كانت قابلة للاكتشاف في وقت واحد. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإعداد تعليق خلية واحدة للأوعية الدموية من الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.
Introduction
تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يرتبط بعوامل الخطر مثل ارتفاع ضغط الدم وفرط شحميات الدم وديناميكا الدم1. تشعبات الشريان السباتي عرضة للتغيرات الديناميكية الدموية وتؤدي إلى تكوين اللويحات السباتية. يمكن أن يكون العرض السريري لتصلب الشرايين السباتي حادا مثل السكتة الدماغية ونقص التروية الدماغية العابرة ، أو مزمنا مثل نقص التروية الدماغية العابر المتكرر والخرف الوعائي2. ميكانيكيا ، اللويحة السباتية هي نتيجة التفاعل بين خلايا جدار الأوعية الدموية المختلفة وخلايا الدم المختلفة في ظل الظروف المرضية. لذلك ، فإن الكشف عن أطلس الخلية الواحدة للأوعية السباتية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية مهم بشكل خاص لمنع وعلاج تطور البلاك السباتي.
يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أحد أقوى تقنيات البحث البيولوجي بسبب دقته الفائقة والكشف عن عدم تجانس الخلية من نفس نوع الخلية من الكائنات الحية 3,4. استخدم الباحثون تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإجراء البحوث في العديد من المجالات ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية5 والسرطان6. ومع ذلك ، لا يزال فصل الأنسجة بسرعة ودقة إلى خلايا مفردة أحد التحديات الرئيسية. التفكك الأنزيمي هو طريقة شائعة الاستخدام تشمل في الغالب كولاجيناز ، غراء ، تربسين ، DNase ، وهيالورونيداز. على وجه التحديد ، الكولاجين هي أنواع الإنزيمات الرئيسية لعملية الهضم أحادية الخلية ، وخاصة مكونات الكولاجين المائية في الأنسجة الضامة. أنواع مختلفة من الكولاجين قابلة للتطبيق لتفكك الأنسجة المختلفة ، مثل الغدة الثديية7 ، الكبيبة8 ، زاوية القزحيةالقرنية 9 ، مفصل الركبة 10 ، الشريان الأورطي11 ، والرئة12. نظرا للخصائص الفسيولوجية الفريدة للأنسجة المختلفة ، قد يسبب التفكك باستخدام نفس الطريقة العديد من المشاكل في الحصول على خلايا مفردة ، مثل انخفاض صلاحية الخلية ، وانخفاض عدد الخلايا ، وحطام الخلايا الكبيرة. لذلك ، فإن اختراع طرق الهضم للأنسجة المختلفة أمر ضروري لإعداد معلقات أحادية الخلية عالية الجودة.
يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة هضم خلوية من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشريان السباتي للفئران البرية. وفقا لخصائص الشريان السباتي ، قمنا بدمج كولاجيناز / إنزيم مع التربسين للحصول على معلق أحادي الخلية عالي الجودة للشريان السباتي للفأر لأن كولاجيناز يمكن أن يتحلل الكولاجين في الأنسجة السباتية ، والذي تم هضمه بواسطة التربسين في معلق أحادي الخلية. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم تحديد أربعة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، في الشرايين السباتية الطبيعية للفأر بعد الهضم. مزايا هذا البروتوكول هي: 1) يمكن تحديد أنواع متعددة من الخلايا في الشريان السباتي ، 2) يتم الحفاظ على صلاحية الخلية بشكل جيد ، و 3) يمكن تكرارها بسهولة بدون معدات خاصة. هذا البروتوكول مناسب للباحثين المهتمين بدراسة تعدد الخلايا أحادية الخلية للشرايين السباتية للفأر. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا في تفكك الأوعية الدموية الأخرى مع التعديلات المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سوشو.
1. الكواشف وإعداد المواد
- استخدم 1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم و 2.5 وحدة / مل من ملح الصوديوم الهيبارين لتحضير محلول التروية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويبرد مسبقا على الثلج عند استخدامه.
- تحضير كاشف التفكك A الذي يحتوي على 125 CDU / mL كولاجيناز II و 60 U / mL DNase I عن طريق تخفيف 1250 CDU / mL كولاجيناز II و 3000 U / mL DNase I مع HBSS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تحضير كاشف التفكك B الذي يحتوي على تركيز نهائي قدره 0.12٪ تربسين عن طريق تخفيف 1 مل من التربسين الخالي من EDTA بنسبة 0.25٪ (بدون الفينول الأحمر) إلى 1 مل من 1x PBS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تحضير 10 مل من 1.5٪ FBS و 10 مل من 5٪ FBS في 1x PBS. استخدم 1.5٪ FBS لتجميع الشرايين السباتية والاحتفاظ بها على الثلج قبل الاستخدام. استخدم 5٪ FBS لتحييد الهضم وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
- احصل على المواد التجريبية ، بما في ذلك محاقن 1 مل ، ومحاقن 20 مل مع إبر 26-G ، وألواح زراعة الخلايا الستة ، وأنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، ومصافي الخلايا المعقمة 40 ميكرومتر ، وحاويات الثلج.
2. إعداد المعدات
- تعقيم جميع المعدات الجراحية ، بما في ذلك المجهر المجسم ، ومقص التشريح ، ومقص التشريح الدقيق ، والملقط ذي الأطراف الدقيقة.
- قم بتشغيل عداد الخلايا الآلي واحتفظ به في RT.
- قم بتشغيل الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية مقدما.
- قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الدقيق إلى 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
3. عزل الشريان السباتي الفأر
- تخدير الفأر باستخدام 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول عن طريق الحقن داخل الصفاق (0.24 مل لكل 10 جم من وزن الجسم) واقلب الماوس للتحقق مما إذا كان هناك رد فعل تصحيح بعد 3 دقائق. ثم ، القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم ووضعه على ظهره. رش جلد الفأر بنسبة 75٪ كحول.
- استخدم مقص تشريح معقم لفتح الجلد وكشف تجويف الصدر. قطع فتح الحجاب الحاجز.
- استمر في القطع لأعلى إلى الفك السفلي وقم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون بعناية ، مما يعرض الشريان السباتي.
- قطع الوريد الأجوف السفلي للفأر لجعل الدم يتدفق من الدورة الدموية المغلقة.
- حقن 20 مل من محلول التروية المبرد مسبقا في البطين الأيسر باستخدام حقنة ببطء وبشكل مستمر.
ملاحظة: إذا نجح التروية ، فإن الأعضاء الغنية بالدم مثل الكبد والطحال والكلى ستتحول إلى اللون الرمادي والأبيض. - انزع جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة حول الشريان السباتي بمقص تشريح دقيق تحت مجهر مجسم.
ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة ببطء وحذر لمنع تلف الشريان السباتي. - اعزل الشريان السباتي عن الفأر ، واغسله باستخدام 1x PBS لطرد الدم مرة أخرى ، وانقله إلى ستة ألواح تحتوي على 1.5٪ FBS على الجليد.
4. هضم الشريان السباتي في تعليق خلية واحدة
- استخدم مقص التشريح الدقيق لتشريح الشريان السباتي طوليا ووضعه بشكل مسطح في لوحة أخرى لزراعة الخلايا مكونة من 6 آبار تحتوي على 1 مل من 1.5٪ FBS على الجليد.
- اغسل البطانة بعناية باستخدام 1.5٪ FBS لإزالة الدم المتبقي.
ملاحظة: يجب أن يكون التنظيف لطيفا وبطيئا لتجنب إصابة الخلايا البطانية. - قطع كل الشريان السباتي إلى ما يقرب من 2 مم2 قطعة الأنسجة باستخدام مقص التشريح المجهري في 1.5٪ FBS.
- انقل قطع الأنسجة هذه إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مع أطراف تجويف عريضة سعة 1 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإغراق الأنسجة في القاع.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 500 ميكرولتر من كاشف التفكك A.
- ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ماصة بلطف مع ماصة 1 مل كل 10 دقائق.
- أضف 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في الأنبوب واخلطه جيدا مع ماصة 1 مل.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من كاشف التفكك B.
- ضعيها في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية واخلطيها لمدة 5 دقائق إضافية. ماصة بلطف كل 2 دقيقة أثناء الهضم لتنفصل تماما إلى تعليق خلية واحدة.
- استخدم 200 ميكرولتر من 5٪ FBS لإنهاء تفاعل الهضم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1x PBS على الجليد.
5. فحص تعليق الخلية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية
- أضف 10 ميكرولتر من محلول AO / PI إلى 10 ميكرولتر من التعليق أحادي الخلية واخلطه برفق باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
- ماصة 20 ميكرولتر من الخليط في شريحة الغرفة وانتظر لمدة 1 دقيقة.
- قم بتحميل الشريحة في أداة عداد الخلايا الآلية.
- حدد مقايسة جدوى AO / PI ، ثم انتظر تقرير الجودة.
- استخدم مجموعة كاشف أحادية الخلية 3 بوصة لتوليد حبات هلام أحادية الخلية في المستحلب على وحدة تحكم أحادية الخلية وتضخيم cDNA المشفر في دورة حرارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجموعات كاشف الكروم أحادي الخلية 3ʹ v3. - قم بإجراء التسلسل على جهاز التسلسل باستخدام إستراتيجية قراءة مزدوجة النهاية 150 bp (PE150). استخدم تطبيقا برمجيا (Cell Ranger) لتحويل ملفات المكالمات الأساسية الأولية إلى ملفات fastq باستخدام خط أنابيب mkfastq . بعد ذلك ، استخدم خط أنابيب العد ل Cell Ranger لإجراء المحاذاة والتصفية وعد الباركود وعد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) لإنشاء مصفوفات الباركود للمعالم13.
- قم بإجراء تقليل أبعاد البيانات والتصور باستخدام حزمة R Seurat14.
- أولا ، تقرأ الدالة Read10X () ل Seurat في إخراج خط أنابيب Cell Ranger ثم تستخدم مصفوفة العد لإنشاء كائن Seurat. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا التي تحتوي على تعبير عن <200 أو >4000 جين أو نسبة جين الميتوكوندريا التي كانت أكثر من 10٪ بواسطة وظيفة subset () ل Seurat.
- استخدم NormalizeData () و FindVariableFeatures() لتسوية البيانات وتحديد 2000 معلم متغير للغاية، على التوالي.
- قم بإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) على البيانات المقاسة ، وقم بتجميع الخلايا ذات الخافتات = 30 والدقة = 0.5. أخيرا ، استخدم الدالة RunUMAP () لتصور مجموعات البيانات أحادية الخلية و FindAllMarkers () للعثور على كل علامة حيوية للمجموعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر (الشكل 1). تجمع طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين بين كولاجيناز / DNase مع التربسين لفصل جدار الأوعية الدموية السباتي للفأر بشكل فعال للحصول على معلقات أحادية الخلية عالية الجودة لتسلسل الخلية الواحدة. بعد التفكك ، تم حساب تركيز الخلية وصلاحيتها بواسطة عداد خلية آلي. أظهر الحقل اللامع مورفولوجيا الخلايا الوعائية السباتية بعد الهضم ، وكشف تلطيخ AOPI المزدوج في وقت واحد عن صلاحية الخلية (الشكل 2 أ ، ب). والجدير بالذكر أنه بالمقارنة مع استخدام كاشف التفكك A وحده ، يمكن فصل أنسجة الشريان السباتي بشكل أكثر شمولا عند دمجها مع كاشف التفكك B. وجدنا كذلك عدد خلايا قابل للحياة من تسعة شرايين ، ومتوسط قطر الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة بعد هضم الخلية بخطوتين (الشكل 2C). وفي الوقت نفسه ، تم جمع ما مجموعه 176000 خلية مفردة من تسعة سباتيات يسرى ، وتم فصل معظم الأوعية الوعائية إلى خلايا مفردة ذات قابلية عالية للحياة (الشكل 2C).
بعد المحاذاة والتصفية وعد الباركود وعد UMI ، تم تحليل البيانات الأولية لتسلسل الخلية الواحدة باستخدام حزمة R Seurat. يظهر توزيع الجينات لكل خلية ، و UMI لكل خلية ، وقراءات الميتوكوندريا لكل خلية في مخططات الكمان (الشكل 3A-C). والجدير بالذكر أنه تم الكشف عن متوسط ~ 2500 نسخة لكل خلية في كل خلية شريان سباتي. بعد إزالة الخلايا منخفضة الجودة ، تم اكتشاف 14580 خلية واستخدامها لتحليل RNA-seq أحادي الخلية النهائي. باستخدام 2000 جين متغير مع ملفات تعريف مماثلة ، أظهر التجميع القائم على Seurat غير الخاضع للإشراف أربعة أنواع رئيسية من الخلايا ، بما في ذلك VSMCs (74.0٪) ، والخلايا الليفية (16.5٪) ، ECs (6.5٪) ، و Mφ / DCs (3.0٪) ، في الشرايين السباتية الطبيعية للفأر بعد الهضم (الشكل 3D-F).
الشكل 1: رسم تخطيطي لهضم الشريان السباتي للفأر. بعد عزل الشريان السباتي للفأر وقطعه ، تمت إضافة 500 ميكرولتر من كاشف التفكك A لفصل الشريان السباتي للفأر. عندما تم ترشيح تعليق الخلية والطرد المركزي ، تمت إضافة 200 ميكرولتر من كاشف التفكك B لمزيد من التفكك للحصول على تعليق أحادي الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحضير معلق وحيد الخلية من الشريان السباتي للفأر. (أ) يظهر مورفولوجيا الخلية وصلاحية خلايا الشريان السباتي بعد 1 ساعة من الهضم مع كاشف التفكك A في منظر المجال الساطع وتلطيخ AOPI. الخلايا النواة الملطخة بالتألق الأخضر هي خلايا حية ، في حين أن تلك الملطخة بالتألق الأحمر هي خلايا ميتة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) يظهر مورفولوجيا الخلية وصلاحية خلايا الشريان السباتي بعد هضم الخلايا على خطوتين في منظر المجال الساطع وتلطيخ AOPI. الخلايا النواة الملطخة بالتألق الأخضر هي خلايا حية ، في حين أن تلك الملطخة بالتألق الأحمر هي خلايا ميتة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) تم قياس صلاحية الخلية ، وإجمالي عدد الخلايا ، وعدد الخلايا القابلة للحياة ، ومتوسط قطر الخلية بعد هضم الخلية من خطوتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المقاييس القياسية لمراقبة الجودة (QC) ل scRNA-seq والمشهد الخلوي للشريان السباتي . (أ) مخططات الكمان التي توضح توزيع الجينات لكل خلية (nFeature RNA) ، (ب) UMI لكل خلية (nCount_RNA) ، (ج) قراءات الميتوكوندريا لكل خلية (النسبة المئوية mt) لبيانات scRNA-seq . (د) مخطط التقريب والإسقاط المتشعب المنتظم (UMAP) الذي يوضح أنواع الخلايا الأربعة المحددة للشريان السباتي. (ه) مخطط نقطي يوضح العلامات التي تحدد كل نوع من أنواع مجموعات الخلايا في اللوحة D. يشير حجم كل دائرة إلى نسبة الخلية داخل المجموعة التي تعبر عن كل نسخة. تشير النقاط الزرقاء إلى جينات عالية التعبير وتشير النقاط الرمادية إلى جينات ذات تعبير منخفض. (F) مخطط شريط مكدس يعرض الوفرة النسبية لأنواع الخلايا الأربعة التي تم اكتشافها بواسطة scRNA-seq للفئران البرية (WT). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من الشريان السباتي للفئران البرية ، حيث تم إنشاء طريقة هضم من خطوتين تدمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتربسين. بعد فحص جودة التعليق أحادي الخلية ، وجدنا أنه يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز خلية مرتفع. علاوة على ذلك ، تم اكتشاف مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي ، بما في ذلك VSMCs ، والخلايا الليفية ، و ECs ، و Mφ / DCs ، بنجاح بعد معالجة البيانات أحادية الخلية.
لا تزال الطرق الحالية لإعداد معلقات الشريان السباتي أحادية الخلية نادرة. حصل Depuydt et al. على تعليق أحادي الخلية من لويحات السباتي البشرية عن طريق الجمع بين كولاجيناز و DNase وجزء الألبومين البشري الخامس وفلافوبيريدول عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة15. بعد فرز الخلايا المنشطة بالتألق ، حددوا 14 مجموعة خلايا متميزة ، بما في ذلك الخلايا البطانية ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا البدينة ، والخلايا البائية ، والخلايا النخاعية ، والخلايا التائية15. علاوة على ذلك ، هضم الباحثون الشرايين السباتية الشائعة للفئران باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA و 0.1٪ كولاجيناز عند 37 درجة مئوية ونجحوا في إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية16. تم تحديد خمسة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك VSMCs ، والخلايا الليفية ، و ECs ، والخلايا الانتقالية ، والبلاعم ، في كل من الشرايين السباتية الطبيعية والتجريبية16. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا وضع بروتوكول للحصول على مستحضرات الخلية المفردة المخصبة EC للشريان السباتي17. بعد الانتهاء من الهضم الأنزيمي اللمعي ، سيحصل تدفق الشريان السباتي على ما يكفي من الكريات أحادية الخلية ل scRNAseq و scATACseq17. للتحكم بمرونة في وقت الهضم ، قمنا بتطوير طريقة هضم من خطوتين للشرايين السباتية للفأر ، تفصل بين خطوات تفكك الأنسجة وإعداد تعليق الخلية الواحدة. تبدأ العملية ب 125 CDU / mL كولاجيناز II و 60 وحدة / مل DNase I لمدة 1 ساعة ، يليه التربسين الخالي من EDTA لمدة 5 دقائق. بشكل ملحوظ ، يمكننا تعديل أي خطوة من طريقة هضم أنسجة الأوعية الدموية الأخرى بشكل مناسب بناء على خصائص الأوعية الدموية.
هناك بعض القيود على الطريقة الموصوفة. أولا، لا نعرف ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لزراعة الخلايا الأولية في المختبر. نظرا لأن جدار الشريان السباتي أرق ويحتوي على عدد أقل من الخلايا ، فإن كيفية الزراعة والتوسع في المختبر أمر صعب. ثانيا ، على عكس طرق الهضم الأخرى ، يتطلب هذا البروتوكول ماصة لطيفة لفصل الخلايا أثناء الهضم. قد يؤدي الحمام المائي المهتز أيضا إلى تعليق خلية واحدة عالي الجودة. ثالثا ، نظرا لأن طريقتنا قابلة للتطبيق على الشرايين السباتية الطبيعية ، فلا يزال يتعين دراسة ما إذا كانت مناسبة لهضم البلاك السباتي.
في الختام ، قمنا بتصميم طريقة هضم من خطوتين للحصول على تعليق أحادي الخلية عالي الجودة من الشريان السباتي للفئران البرية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإعداد معلقات أحادية الخلية للأوعية الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعله مفيدا جدا في أبحاث القلب والأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070450 إلى CT و 82170466 إلى L.Z.) وزمالة مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (7121102223 إلى F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al.
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al.
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
