Количественная оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности в модели сфероида опухоли: заявка на разработку лекарственного препарата

Многоклеточные опухолевые сфероиды (MCTS) представляют собой широко используемые трехмерные (3D) модели, которые формируются из-за тенденции адгезивных клеток к агрегации и представляют собой важный инструмент для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Они могут быть получены из широкого спектра типов клеток с помощью многочисленных методов, таких как 3D-культуры на основе жидкости и каркаса¹. Их основное преимущество перед монослойными 2D-моделями заключается в том, что они повторяют основные особенности опухолей in vivo, а именно структурную организацию и гипоксию, имитируя биологическое поведение опухолевых клеток, особенно механизмы, приводящие к терапевтическому бегству^{и лекарственной} устойчивости. Таким образом, поскольку MCTS могут улучшить предсказуемость токсичности и чувствительности к лекарственным препаратам, они широко используются для изучения рака в 3D и могут способствовать разработке эффективных лекарств для различных^{типов рака.}

Для изучения любого заболевания существует острая потребность в актуальных и удобных моделях. Создание моделей для иммунологических исследований рака является сложной задачей, поскольку иммунная система состоит из нескольких типов клеток. Каждый тип клеток имеет несколько подтипов и широкий спектр состояний активации. Эти различные типы иммунных клеток взаимодействуют с раковыми клетками и другими опухолевыми компонентами, в конечном итоге влияя на исход заболевания. Двухмерные методы культивирования клеток in vitro не позволяют повторить эти сложные клеточные взаимодействия, поскольку им не хватает транслятивности, и они не могут предсказать действие лекарственного препарата на системном уровне (например, в тканях)^4,5. Более того, мышиные модели также имеют серьезные ограничения из-за фундаментальных различий между иммунной системой человека и мыши. Таким образом, системы 3D-культивирования могут заполнить существующие пробелы в имеющихся моделях, предоставляя альтернативный метод и улучшая наше понимание иммунологии рака^. В частности, сфероидные модели могут быть использованы для тестирования иммунотерапии, главным образом для оценки эффективности скрининга лекарственных средств и терапевтических антител для усиления инфильтрации иммунных клеток и противоопухолевых эффектов в отношении сфероидных мишеней⁷. Кроме того, потенциал MCTS, состоящего из клеток, находящихся в различных метаболических и пролиферативных состояниях, для изучения взаимодействий между клетками стромы (например, лимфоцитами, макрофагами, фибробластами) и раковыми клетками, а также для разработки новых противоопухолевых стратегий⁸. Следовательно, существует насущная необходимость в подтверждении прогностических и точных платформ для ускорения процесса тестирования лекарственных средств с учетом патофизиологии микроокружения опухоли.

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее частым онкологическим заболеванием, диагностируемым у женщин во всем мире. Клиническая классификация этого гетерогенного заболевания основана на наличии трансмембранных рецепторов, например, рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) (в совокупности называемых рецепторами гормонов, HR), а также на гиперэкспрессии или амплификации белка/онкогена рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2). На основании иммуногистохимической экспрессии этих рецепторов обычно выделяют четыре подтипа: люминальный А (HR+/HER2-), люминальный B (HR+/HER2+), HER2-положительный (HR-/HER2+) и трижды негативный рак молочной железы (HR-/HER2-). Группа HER2+ составляет 10-15% случаев РМЖ и характеризуется высокой экспрессией HER2 при отсутствии ЭР и ПР, имеет худший прогноз по сравнению с люминальными опухолями и требует специфических препаратов, направленных против белка HER2/neu⁹.

Развитие РМЖ является многоступенчатым процессом, и ранняя диагностика имеет важное значение для успешного лечения заболевания¹⁰. Однако, несмотря на недавно появившиеся персонализированные варианты лечения РМЖ (например, эндокринная терапия и терапия антителами к HER2), РМЖ продолжает бросать вызов онкологам. Так же, как хирургия, химиотерапия и лучевая терапия, эти персонализированные методы лечения также могут иметь серьезные побочные эффекты, и у пациентов может развиться резистентность к этим препаратам, что делает определение наилучшей^{стратегии в} долгосрочной перспективе сложной ^{задачей.} Следовательно, улучшение понимания взаимодействия между опухолью и ее микроокружением имеет важное значение и, как ожидается, обеспечит новые направления для разработки новых методов лечения, учитывающих специфику различных подтипов РМЖ¹³. Новая волна иммунотерапии, такая как конъюгаты антител, адоптивная Т-клеточная терапия, вакцины и новые моноклональные антитела (мАТ), направленные на HER2, изучается в широкой популяции пациентов с опухолями, экспрессирующими HER2¹⁴.

Трастузумаб, например, представляет собой эффективный метод лечения HER2+ РМЖ. В рамках механизма действия трастузумаб опосредует фрагментарную кристаллизующийся гамма-рецептор (FcγR)-зависимую активность. FcγR отличаются своим сродством к Fc-фрагменту и иммунным ответом, который они инициируют. Активация FcγRIIIa (CD16A) на естественных клетках-киллерах (NK) имеет решающее значение для опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), в то время как активация FcγRIIa (CD32A) и FcγRIIIa на макрофагах индуцирует антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP)¹⁵. Исследования на животных моделях показали, что мыши, у которых отсутствовали рецепторы FcγRI (CD64) и FcγRIII (CD16), не могли инициировать защитный иммунный ответ против опухолеспецифических антигенов, что показало, что ADCC, вероятно, является основным механизмом действия mAb трастузумаба¹⁶.

Поскольку NK-клетки прибегают к связанным с опухолевыми клетками Abs для уничтожения раковых клеток с помощью ADCC, экспрессия Fc-рецепторов имеет решающее значение для эффективного лечения трастузумабом¹⁷ (рис. 1). Кроме того, их действие эффективно уравновешивается стимуляцией активирующих и тормозящих рецепторов, например, иммуноглобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров (KIR)¹⁸.

Рисунок 1. Механизм ADCC в контексте противоопухолевого ответа. Рецептор Fcγ естественной клетки-киллера (NK) распознает Fc-участок антитела, который ранее связывался с поверхностным антигеном на раковой клетке. Этот иммунологический синапс приводит к дегрануляции NK-клетки, которая высвобождает цитотоксические медиаторы, такие как гранзимы и перфорин. Эти молекулы способствуют образованию пор в клеточной мембране и активируют апоптотические пути, вызывая запрограммированную гибель клетки-мишени (изображение, созданное с помощью Biorender.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Разработка иммунотерапии HER2+ BC представляет собой развивающуюся область. При этом следует учитывать взаимодействия между различными компонентами иммунной системы. Кроме того, в предыдущих публикациях проводилось всестороннее тестирование комбинированной терапии, включающей все виды традиционной, иммунной или клеточной терапии, для выявления синергетических комбинаций¹⁹.

Несколько 3D-моделей HER2+ BC ранее использовались для разработки новых лекарственных препаратов. Например, Балалаева и др. использовали сфероиды SKBR-3, гиперэкспрессирующие HER2, для оценки цитотоксичности HER2-таргетного иммунотоксина 4D5scFv-PE40²⁰. В другом исследовании была создана 3D-система культивирования HER2+ BC на основе Matrigel для измерения роста клеток в ответ на трастузумаб и эндокринные агенты²¹. Эти исследования подчеркивают важность опухолевой сфероидной модели гиперэкспрессии раковых клеток HER2 в представлении эффективной стратегии клинического улучшения терапевтических ответов²².

Наша группа ранее идентифицировала сунитиниб, многоцелевой ингибитор тирозинкиназы, в качестве ингибитора трастузумаб-зависимого ADCC в клетках JIMT-1 HER2+ BC в 2D-культуральном анализе. Исследование показало, что сунитиниб индуцирует аутофагию и нарушает функцию уничтожения NK-клеток, подавляя экспрессию HER2 и усиливая поверхностное прикрепление клеток JIMT-1¹⁷.

Здесь мы создали новую 3D-модель сфероида ADCC (раковые клетки NK.92.CD16+Трастузумаб+JIMT-1-EGFP), которая будет использоваться для высокопроизводительного скрининга, а для подтверждения вышеупомянутых результатов в качестве модельного соединения был использован сунитиниб. Во-первых, мы сгенерировали EGFP, экспрессирующий клетки JIMT-1¹⁷ , и вырастили сфероиды из этих клеток. ADCC индуцировали NK-клетками вместе с трастузумабом, а сфероиды хранили в культуре в присутствии или отсутствии исследуемых соединений в течение 24 ч (рис. 2). Количественная оценка ADCC основана на выявлении апоптотической гибели раковых клеток (окрашивание Annexin V) с помощью системы High-Content Analysis.

Рисунок 2. ADCC в системе кокультивирования 3D сфероидов. Наши экспериментальные установки основаны на 3D-сфероидной системе, которая может более точно моделировать микроокружение in vivo по сравнению с 2D-моделями. Клетки рака молочной железы JIMT-1 EGFP были высеяны на вогнутое клеточное репеллентное дно, чтобы сформировать клеточный кластер круглой формы, называемый сфероидом. Затем был инициирован ADCC путем добавления NK92. CD16 естественные клетки-киллеры (соотношение E:T = 20:1) и моноклональное антитело против HER2, трастузумаб. Экспериментальная модель оказалась эффективной и легко применимой для идентификации ADCC-модифицирующих испытуемых соединений (изображение, полученное с помощью Biorender.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Мы продемонстрировали, что получение данных таким образом может быть выполнено в режиме реального времени и является статистически надежным для использования в скрининге с высоким содержанием при разработке лекарств от рака. Важно отметить, что эта модель позволяет проводить расширенную валидацию большего набора соединений и может быть применена к нескольким анализам, представляющим интерес.

1. Создание модели сфероида JIMT-1-усиленного флуоресцентного белка (EGFP)

1. Чтобы сформировать U-образное дно, отталкивающее клетки, покройте 96-луночную пластину 0,5% раствором агарозы-PBS (30 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при комнатной температуре примерно 30-45 мин.
2. Промыть клетки JIMT-1-EGFP дважды 2 мл стерильного PBS (о генерации клеточной линии JIMT1-EGFP сообщалось в предыдущей публикации¹⁷). Для культивирования клеток используют колбы для тканевых культур T25 и среду JIMT-1 (среда DMEM/F-12 с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), инсулина в дозе 0,3 ед/мл (100 МЕ/мл, Хумулин R) и 1% пенициллина-стрептомицина).
3. Добавьте в колбу 2 мл трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 10 мин в инкубаторе_СО2 .
4. Коснитесь колбы, чтобы проверить, отделились ли клетки JIMT-1 после инкубационного времени.
5. Используйте 2 мл среды JIMT-1, чтобы остановить пищеварение, и соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
6. Подсчитайте количество клеток в камере Бюркера с 0,4% трипановым синим (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии) и отрегулируйте количество клеток до 20 000 клеток/мл.
7. Пипетку 100 мкл клеточной суспензии (2000 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета (предварительно покрытого 0,5% раствором агарозы-PBS, как указано в 1.1).
8. Дайте клеткам слипаться в течение 3-дневного инкубационного периода при 37 °C в инкубаторе_CO2 .
9. Регулярно проверяйте размер и форму сфероидов с помощью инвертированного микроскопа.

2. Покрытие пластины HCS

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить прикрепление сфероидов JIMT-1-EGFP к стеклянной поверхности пластины, покрытие пластины с высоким содержанием (HCS) имеет решающее значение (в противном случае анализ с высоким содержанием был бы невозможен).

1. На 3-й день после индукции сфероидов покройте 96-луночный скрининговый планшет с высоким содержанием Pluronic-F127 (0,5% в ДМСО, 50 мкл/лунка) и инкубируйте планшет в течение 45 мин при комнатной температуре.
2. Отсасывайте раствор для покрытия и дважды промывают лунки свободной средой DMEM/F-12 (100 мкл/лунка).

3. Перенос сфероидов на пластину HCS

1. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите сфероиды в трех экземплярах на 96-луночную пластину HCS со стеклянным дном.

4. Предварительная обработка сфероидов JIMT-1 EGFP исследуемыми соединениями

1. Добавьте испытуемое соединение (например, сунитиниб, разбавленный в ДМСО в концентрации 40 мкМ) путем пипетирования 10 мкл/лунку и добавьте 10 мкл свежей среды JIMT-1 в контрольные лунки (CTL).
2. Инкубируют планшет в течение 1 ч в инкубаторе_СО2 при температуре 37 °C.

5. Индукция ADCC путем добавления эффекторных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD16.176V.NK92 (далее именуемые NK-клетки) культивировали в α-MEM с добавлением 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-пирувата, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 100 МЕ/мл IL-2.

1. Соберите NK-клетки в колбе в пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки с трипановым синим (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии) и отрегулируйте плотность клеток до соотношения эффектор-мишень (E:T) 20:1 (40 000 NK-клеток/лунка).
2. Окрасьте NK-клетки 10 мкМ Cell Tracker Blue (CTB, 1 мкл в 1 мл среды α-MEM NK) и поместите их в инкубатор CO₂ при 37 °C на 1 ч.
3. Центрифугируют NK-клетки при 150 х г в течение 3 мин при комнатной температуре дважды, чтобы смыть излишки красителя 1 мл среды α-MEM.
4. Ресуспендант гранулы NK-клеток в 1 мл свежей среды JIMT-1.
5. Добавляют окрашенные NK-клетки вместе с антителом к HER2 (Ab) (трастузумаб, растворенный в стерильном дистиллированном_H2O) к целевым сфероидам JIMT-1 путем пипетирования 55 мкл/лунку NK-клеток, окрашенных CTB, и 55 мкл/лунку 10 мкг/мл Ab в среде JIMT-1 (общий объем обработки, добавленной для ADCC, составляет 110 мкл/лунку, а конечная концентрация сунитиниба составляет 20 мкМ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для выбора концентрации Ab и соотношения E:T мы опирались на нашу предыдущую публикацию¹⁷. Предварительные эксперименты были проведены с различными соотношениями E:T и концентрациями трастузумаба, чтобы оценить, какой из них является наиболее эффективным в индуцировании ADCC в сфероидах (дополнительный рисунок S1).
6. Добавьте 110 мкл/лунку свежей среды JIMT-1 в контрольные лунки (CTL).
7. Инкубируйте планшет в течение 24 ч в инкубаторе CO₂ при температуре 37 °C.
   Примечание: Поскольку известно, что клетки NK92 выполняют неспецифические цитотоксические функции, для контроля используют клетки JIMT-1, инкубированные как с NK-клетками в отдельности, так и с контролем изотипа или F(ab'₎₂ Ab. Здесь F(ab'₎2-трастузумаб (TR-F(ab'₎₂) использовали в качестве отрицательного CTL. Фрагмент TR-F(ab'₎₂ готовили, как сообщают Tóth et ^al.19 , и добавляли в том же объеме, что и трастузумаб, вместе с NK-клетками, как описано в 5.5. Концентрацию доводили до 6,6 мкг/мл, что соответствует эквимолярной концентрации при применении трастузумаба²³.

6. Аннексин В-647 для окрашивания сфероидов

1. Для измерения апоптотической гибели клеток сфероиды окрашивают конъюгатом Annexin V-Alexa Fluor 647 в течение 1 ч в среде JIMT-1 (1:100) путем пипетирования 50 мкл/лунка.

7. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина визуализируется через 24 ч после добавления NK-эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Для визуализации используется анализатор высокого содержания и программное обеспечение для анализа изображений.

1. Выберите тип микропластины из списка пластин с помощью параметра «Тип пластины ». Используйте 96-луночный экранирующий планшет с высоким содержанием (HCS).
2. Выберите автофокусировку Two Peak, так как анализ проводится на планшетах с 10-кратным объективом с числовой апертурой 0,3 (NA) с использованием опций Autofocus и Objective соответственно. Выберите конфокальный режим с опцией Opt. Mode и примените Биннинг 2 с помощью параметра Биннинг .
3. Для получения изображений сфероидов выберите соответствующие каналы с помощью параметра «Выбор канала ». Для детектирования EGFP-трансдуцированных клеток JIMT-1 выберите EGFP (время интеграции 200 мс, мощность лазера 50%, высота стека 2,0 мкм; например: 488 нм em: 500-550 нм), а для обнаружения апоптотических клеток используйте Alexa 647 (время интеграции 100 мс, мощность лазера 50%, высота стека 10,0 мкм; например: 640 нм em: 650-760 нм). Для визуализации NK-клеток внутри сфероидов выберите следующий канал: DAPI (время интегрирования 100 мс, мощность лазера 50%, высота стека 2,0 мкм; например: 405 нм em: 435-480 нм).
4. В опции Layout Selection выберите Z-стеки, так как ячейки в сфероидах имеют тенденцию находиться в разных фокальных плоскостях микроскопа. 10 плоскостей (с расстоянием 10 мкм) достаточно, чтобы покрыть всю область сфероида. Установите значения первой и последней плоскостей на 0 мкм и 90 мкм соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом измерения можно сделать снимки образцов с помощью функции моментального снимка, чтобы проверить правильность настроек.
5. Задайте количество лунок и полей для визуализации с помощью параметра Определить компоновку .

8. Анализ высокого содержания (HCA)

ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения Harmony или экспортируйте изображения для анализа с помощью предпочтительного стороннего программного обеспечения. Для анализа эффективности ADCC измеряется интенсивность флуоресценции Annexin V 647. Клетки-мишени, убитые ADCC, появляются в периферической области сфероидов. Поэтому в этом сфероидном «кольце» измеряются положительные клетки Аннексина V. Для валидации этого метода был проведен анализ с различными параметрами, чтобы оценить, какой из них является наиболее надежным и дает наилучшие результаты (дополнительный рисунок S2). На видео показана скважина ADCC, чтобы продемонстрировать пошаговый процесс анализа изображений.

1. Идентификация сфероидов по флуоресценции EGFP клеток JIMT-1 с помощью опции Find Texture Regions и фильтрация по размеру (> 25 000 мкм2).
2. Удаление объектов границ с помощью параметра Выбрать население .
3. Поскольку на периферии сфероидов появляются положительные (апоптотические) клетки Annexin V, измерьте интенсивность Аннексина в этом апоптотическом «кольце», выбранном опцией Select Region (внешняя граница -90%), чтобы определить гибель апоптотических клеток.
4. Выразите значения интенсивности Annexin V как среднюю интенсивность.

Были получены EGFP, экспрессирующие клетки JIMT-1, и из этих клеток были выращены сфероиды. В качестве тестового соединения использовали сунитиниб, так как ранее было показано, что он влияет на течение ADCC¹⁷. Сфероидам было позволено слипаться в течение 72 ч. На 3-е сутки к сфероидам добавляли 10 мкг/мл трастузумаба (или эквимолярные 6,6 мкг/мл TR-F(ab'₎₂¹⁹) и NK-клетки (20:1) в присутствии или отсутствии 20 мкМ сунитиниба (1 ч до обработки) в течение общего времени 24 ч. В качестве CTL использовали только JIMT-1 и JIMT-1 совместно с NK-клетками (20:1). Сфероиды окрашивали Annexin V 647 в течение 1 ч для выявления гибели апоптотических клеток и затем были получены изображения с помощью анализатора высокого содержания.

Как показало окрашивание Аннексина V, добавление NK-клеток вместе с трастузумабом к клеткам JIMT-1 вызывало гибель клеток в опухолевых сфероидах. Аннексинпозитивные (апоптотические) клетки появились в периферической зоне сфероидов, как видно на рисунке 3А. С другой стороны, добавление NK-клеток само по себе не приводило к апоптозу опухолевых клеток. Чтобы дифференцировать способность трастузумаба рекрутировать ADCC и его прямой биологический эффект, TR-F(ab')₂ , не обладающий функциональной способностью связывания с FcR, использовали в качестве отрицательного контроля трастузумаба. Поскольку было показано, что TR-F(ab')₂ неэффективен в этой модели (рис. 3B), эффект, вероятно, опосредован через ADCC. Кроме того, предварительная обработка сунитинибом снижала окрашивание аннексина V в сфероидах, подтверждая индуцированную сунитинибом резистентность к ADCC и выявляя предотвращение апоптотической гибели клеток в сфероидах JIMT-1, инкубированных совместно с NK-клетками и трастузумабом.

Рисунок 3. Детектирование эффекторных соединений ADCC в 3D модели сфероида. Опухолевые сфероиды были получены с помощью клеток JIMT-1-EGFP. После инкубационного периода в 3 дня сфероиды переносили на пластину HCS, предварительно покрытую Pluronic F-127 для предотвращения прикрепления клеток. На следующий день 10 мкг/мл трастузумаба (TR) (или эквимолярного 6,6 мкг/мл TR-F(ab')₂ в качестве отрицательного CTL) и NK92. Клетки CD16 (предварительно окрашенные Cell Tracker Blue) добавляли в лунки (соотношение E:T 20:1) в отсутствие или в присутствии 20 мкМ сунитиниба (SUN). В качестве CTL использовали только сфероиды JIMT-1 и сфероиды JIMT-1, инкубированные совместно с NK-клетками (20:1). (A) После инкубационного времени в 24 ч Annexin V 647 (красный цвет) использовали для окрашивания сфероидов в течение 1 ч для визуализации апоптотических клеток. (B) Были получены изображения 3 сфероидов/состояния, которые были проанализированы на интенсивность флуоресценции Annexin V 647 в периферической области сфероидов (кольцевая область). Гистограмма показывает 4 независимых эксперимента (средний±SEM). Данные анализировали с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом Данна post-hoc (*p < 0,05, #p < 0,05, нс: не значимо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Эти данные подтверждают, что Сунитиниб ингибирует ADCC. Ожидается, что соединения, усиливающие ADCC, будут идентифицированы аналогичным образом. Таким образом, наш анализ HCS может быть подходящим для идентификации соединений, влияющих на ADCC.

Дополнительный рисунок S1. Оптимизация соотношения Е:Т и концентрации трастузумаба. Клетки JIMT-1-EGFP использовали для генерации сфероидов. На 3-й день сфероиды переносили на пластину HCS и добавляли NK-клетки в различных соотношениях E:T (20:1, 40:1 и 60:1) с 10, 20 и 50 мкг/мл трастузумаба (TR), чтобы увидеть, какое лечение является наиболее эффективным, которое может вызвать гибель клеток в сфероидах. Контрольную группу (JIMT-1-EGFP) обрабатывали питательной средой для клеток JIMT-1. (А) Через 24 ч клетки окрашивали Annexin V 647 (красный цвет) в течение 1 ч и измеряли апоптотическую гибель клеток с помощью HCA. Гистограммы показывают 3 независимых эксперимента (среднее±SEM). Столбцы представляют интенсивность Annexin V 647 вокруг сфероидов JIMT-1. (B) Изображения 3 сфероидов/состояния были проанализированы для интенсивности Annexin V 647 области кольца. Данные анализировали с помощью одностороннего ANOVA с последующим использованием post-hoc критерия Тьюки (*p < 0,05, **p < 0,01, нс: не значимо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S2. Оценка апоптоза клеток JIMT-1 в сфероидах. Клетки JIMT-1-EGFP использовали для генерации сфероидов. На 3-й день сфероиды переносили на планшет HCS и предварительно обрабатывали 20 мкМ сунитинибом (SUN) в течение 1 ч, затем добавляли NK-клетки в соотношении E:T 20:1 с 10 мкг/мл трастузумабом. Через 24 ч клетки окрашивали Аннексином V 647 в течение 1 ч и измеряли апоптотическую гибель клеток с помощью ГЦА. Были проанализированы изображения 3 сфероидов/состояние для интенсивности Annexin V 647 (контроль: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 NK-клетки + 10 мкг/мл трастузумаб, ADCC+SUN: 20 мкМ сунитиниб + 20:1 NK-клетки + 10 мкг/мл трастузумаб). Столбцы представляют интенсивность Annexin V 647 вокруг сфероидов JIMT-1 (кольцо) (A), во всем сфероиде (B) и во всей лунке (C). Гистограммы показывают 3 независимых эксперимента (среднее±SEM). Данные анализировали с помощью одностороннего ANOVA с последующим использованием post-hoc критерия Тьюки (*p < 0,05, **p < 0,01, нс: не значимо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Несмотря на значительные улучшения в лечении РМЖ за последние несколько десятилетий, у пациентов по-прежнему регулярно развивается лекарственная устойчивость или возникают негативные^{побочные} эффекты. Высокая заболеваемость и смертность, связанные с РМЖ, требуют продолжения изучения лежащих в их основе молекулярных механизмов, а также надежных скрининговых платформ для выявления новых молекул, пригодных для терапевтических разработок²⁵. Эти стратегии требуют трансляционных анализов на основе клеточных культур. Системы 3D-культивирования опухолей, такие как сфероиды и органоиды опухолей, в последнее время стали недорогими, простыми в реализации моделями, которые представляют ключевые аспекты патофизиологии опухоли более точно, чем обычные монослойные культуры. Одной из таких особенностей является пространственно скоординированное взаимодействие между различными опухоль-ассоциированными иммунными клетками и раковыми клетками. Это делает 3D-модели кокультур превосходными инструментами для скрининга лекарственных препаратов, ориентированных на модуляторы, действующие на иммунные клетки для лечения злокачественных новообразований²⁶.

В этой работе мы представили новую сфероидную модель для NK-клеточного трастузумаба-зависимого ADCC против клеток карциномы молочной железы JIMT-1 и описали автоматизированный рабочий процесс визуализации и анализа для оценки опосредованного NK-клетками уничтожения раковых клеток. Процедура была реализована для высокопроизводительного имидж-сканера и программного обеспечения для анализа изображений, позволяющего контролировать способность NK-клеток, связанных с заболеванием, индуцировать апоптоз раковых клеток. Ранее был идентифицирован многоцелевой ингибитор тирозинкиназы сунитиниб как соединение, индуцирующее резистентность к трастузумаб-зависимому ADCC в клетках JIMT-1 в 2D-анализах клеточных культур. Сунитиниб нарушает киллинговую функцию NK-клеток и индуцирует аутофагию, подавляет экспрессию HER2 и усиливает адгезию клеток JIMT-1¹⁷. Для того, чтобы проверить наш конвейер анализа сфероидов для идентификации соединений, мы протестировали сунитиниб в качестве модельного соединения и показали, что он может значительно затруднить способность NK-клеток убивать сфероиды раковых клеток, воспроизводя эффект, который он продемонстрировал в монослое.

Наш метод прост и включает в себя выращивание сфероидов в покрытых агарозой 96-луночных тканевых культуральных планшетах, однократный перенос сформированных сфероидов в микропланшет со стеклянным дном, подходящий для применения в HCS и HCA, добавление тестовых соединений и отдельно окрашенных NK-клеток, активированных для уничтожения при введении трастузумаба, одноэтапное окрашивание клеток и микроскопический анализ. После начала совместного культивирования двух типов клеток и медикаментозной обработки к лункам не применяются, чтобы избежать нарушения целостности сфероидов. Анализ занимает всего 4 дня. Покрытие нижней части 96-луночных планшетов для культуры тканей 1%-ной легкоплавкой агарозой в рамках процедуры является дешевой альтернативой использованию пластин со сверхнизким креплением, чтобы предотвратить прилипание клеток JIMT-1 к поверхности планшета и способствовать спонтанной организации опухолевых клеток в сфероиды. Поскольку захват изображения через агарозную подушку и U-образную пластиковую поверхность невозможен, сфероиды необходимо было перенести на визуализирующую пластину. Решающее значение имела пассивация стеклянной поверхности пластины HCS биоинертным поверхностно-активным веществом Pluronic-F127 перед переносом сфероида. Без этого шага сфероиды расползаются по дну лунок, что затрудняет визуализацию и анализ.

Для образования сфероидов использовали линию опухолевых клеток человека, стабильно экспрессирующую EGFP¹⁷. Генетически кодируемый маркер обеспечивает устойчивую флуоресценцию на протяжении всего протокола вместо окрашивания клеток. Неконтролируемый текстурный анализ сигнала EGFP дает основу для распознавания компактного ядра сфероидов, которое включает в себя весь сфероид без индукции клеточной гибели. При добавлении NK-ячеек и индуцировании ADCC заметный распад контуров иногда представлял собой проблему для алгоритма анализа изображений, чтобы очертить контур сфероида. Поскольку V-положительные клетки аннексина были обнаружены в основном на периферии сфероидов, эту проблему можно было обойти, оценив гибель клеток в периферической кольцевой области, сгенерированной встроенным модулем сегментации изображений программного обеспечения, путем расширения четко определенного ядра сфероида. Коэффициент расширения, определяющий внешнюю границу этой области, был выбран таким образом, чтобы охватить полутень умирающих, измельченных и рассеянных клеток во всех случаях после визуального отбора сотен изображений сфероидов. Определение суммарной флуоресценции области апоптотического кольца в максимальных проекциях изображений Z-стека дало меньшие экспериментальные ошибки и более выраженный эффект ADCC, чем измерение всей площади сфероида или всей площади лунки (дополнительный рисунок S2). Флуоресцентные метки были выбраны для маркировки клеток БК (EGFP) и обнаружения гибели клеток (Alexa 647), чтобы исключить необходимость разделения каналов. Было выбрано считывание конечной точки на основе флуоресцентного мечения экспонированного фосфатидилсерина, маркера апоптоза, в отличие от мониторинга снижения флуоресценции EGFP для определения жизнеспособности сфероидов с течением времени, что может быть еще одним вариантом. Окрашивание аннексином позволило более точно и чувствительно идентифицировать гибель клеток. В принципе, можно усовершенствовать существующий одномерный подход к окрашиванию, дополнив его дополнительными, более точными маркерами клеточной гибели, которые могут идентифицировать модальность клеточной гибели (например, флуоресцентные субстраты каспазы) и тип погибшей клетки.

Этот метод может быть дополнен минимальными изменениями для изучения других типов эффекторных иммунных клеток (макрофагов, Т-клеток и иммунных клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы [CAR]) и молекул-активаторов (например, цитокины, интерлейкины). Стремясь к простоте, надежности и короткому времени обработки, мы не исчерпали возможности, которые HCA может предложить для этого анализа. Протоколы визуализации и анализа допускают добавление дополнительных флуоресцентных меток. Этот анализ может быть адаптирован для изучения более сложных сфероидов путем добавления различных типов клеток и использования мультиплексированных флуоресцентных зондов для различения этих типов клеток и специфических флуоресцентных маркеров, чтобы связать их с текущими клеточными событиями ^4,5. Протокол может быть адаптирован к любому HC-сканеру, а изображения могут быть проанализированы с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений, включающего модуль анализа текстур.

Ключевым аспектом важности этого протокола является использование сфероидов. Следовательно, необходимо учитывать ряд параметров. Известно, что клетки в 3D-культуре демонстрируют ослабленную реакцию на соединения по сравнению с клетками^, выращенными в монослоях^21,22. Использование 2D клеточных культур не позволяет спрогнозировать эффективный диапазон концентраций испытуемого агента во всем организме. При создании нашей 3D-модели мы протестировали более высокие концентрации соединений и соотношение E:T, чем те, которые были указаны в 2D. Например, протокол был оптимизирован путем увеличения соотношения E:T с 2:1, используемого в нашем 2D-анализе ADCC¹⁷, до 20:1 для раковых сфероидов. Причиной этого может быть то, что препараты не способны эффективно проникать в ядро сфероидов и в основном воздействуют на клетки внешних слоев. С другой стороны, увеличение концентрации трастузумаба не способствовало дальнейшему усилению ответа ADCC (дополнительный рисунок S1). Этот выбор может отличаться в зависимости от клеточной линии и мишени. Таким образом, было бы интересно протестировать этот протокол на других клеточных линиях, например, на клеточной линии, не относящейся к HER2 BC, принимая во внимание, что уровень экспрессии HER2 является важным фактором, определяющим реакцию ADCC²⁰.

Таким образом, наш новый метод представляет собой быструю и надежную платформу для анализа влияния соединений в 3D-модели иммунного рака, которая может быть использована для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов. Это подчеркивает актуальность использования сфероидов HER2+ BC и NK92. CD16 в дальнейшем улучшении понимания молекулярных механизмов трастузумаба, что дает возможность предвидеть эффективность трастузумаб-зависимого ADCC в терапевтическом потенциале in vivo²⁷. Поиск новых противоопухолевых иммуномодуляторов может принести большую пользу от этого анализа. Метод может быть расширен до персонализированного тестирования химиочувствительности культур опухолевых клеток, полученных от пациентов. Мы продемонстрировали, что традиционные 2D-кокультуры, используемые в тестах на уничтожение иммунных клеток и ADCC, могут быть преобразованы в 3D-спектроидные анализы, что потенциально повышает их трансляционную значимость.