Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Meercellige tumorsferoïden (MCTS) zijn veelgebruikte driedimensionale (3D) modellen die ontstaan als gevolg van de neiging van aanhangende cellen om te aggregeren en een belangrijk hulpmiddel vormen voor het verkrijgen van mechanistisch inzicht in de biologie van kankercellen. Ze kunnen worden gegenereerd uit een breed scala aan celtypen door middel van tal van technieken, zoals 3D-culturen op basis van vloeistof en steigers¹. Hun belangrijkste voordeel ten opzichte van monolayer 2D-modellen is dat ze de belangrijkste kenmerken van in vivo tumoren, namelijk structurele organisatie en hypoxie, samenvatten door het biologische gedrag van tumorcellen na te bootsen, met name de mechanismen die leiden tot therapeutische ontsnapping en resistentie tegen geneesmiddelen^. Aangezien MCTS de voorspelbaarheid van toxiciteit en gevoeligheid voor geneesmiddelen kan verbeteren, worden ze dus veel gebruikt om kankers in 3D te bestuderen en kunnen ze de ontwikkeling van effectieve geneesmiddelen voor verschillende soorten kanker verbeteren^.

Om elke ziekte te bestuderen, is er een kritieke behoefte aan relevante en handige modellen. Het opzetten van modellen voor kankerimmunologische studies is een uitdaging omdat het immuunsysteem uit meerdere celtypen bestaat. Elk celtype heeft verschillende subtypen en een breed spectrum aan activeringstoestanden. Deze verschillende immuunceltypen interageren met kankercellen en andere tumorcomponenten, wat uiteindelijk de uitkomst van de ziekte beïnvloedt. 2D in vitro celkweekmethoden slagen er niet in om deze complexe cellulaire interacties te recapituleren, omdat ze niet vertaalbaar zijn en niet in staat zijn om de werking van een geneesmiddel op systeemniveau (bijv. in weefsels) te ^{voorspellen4,5}. Bovendien hebben muismodellen ook ernstige beperkingen vanwege de fundamentele verschillen tussen het immuunsysteem van mensen en muizen. 3D-kweeksystemen kunnen daarom de huidige hiaten in de beschikbare modellen opvullen, een alternatieve methode bieden en ons begrip van kankerimmunologie verbeteren⁶. In het bijzonder kunnen sferoïde modellen worden gebruikt voor het testen van immunotherapieën, voornamelijk om de efficiëntie van geneesmiddelenscreening en therapeutische antilichamen te beoordelen voor het versterken van de infiltratie van immuuncellen en antitumorale effecten tegen de sferoïde doelen⁷. Bovendien is het potentieel van MCTS, samengesteld uit cellen in verschillende metabole en proliferatieve toestanden, om de interacties tussen stromacellen (bijv. lymfocyten, macrofagen, fibroblasten) en kankercellen te bestuderen en voor de ontwikkeling van nieuwe antikankerstrategieën ruimschoots aangetoond⁸. Daarom is het van vitaal belang om voorspellende en nauwkeurige platforms te bevestigen om het testproces van geneesmiddelen te stimuleren, rekening houdend met de pathofysiologie van de micro-omgeving van de tumor.

Borstkanker (BC) is wereldwijd de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen. De klinische classificatie van deze heterogene ziekte is gebaseerd op de aanwezigheid van transmembraanreceptoren, zoals oestrogeen (ER) en progesteron (PR) receptoren (gezamenlijk hormoonreceptoren genoemd, HR), samen met de overexpressie of amplificatie van het humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2) eiwit/oncogen. Op basis van de immunohistochemische expressie van deze receptoren worden vier subtypes algemeen herkend: luminaal A (HR+/HER2-), luminaal B (HR+/HER2+), HER2-positief (HR-/HER2+) en triple-negatief borstkanker (HR-/HER2-). De HER2+-groep vormt 10-15% van de BC-gevallen en wordt gekenmerkt door een hoge HER2-expressie met afwezigheid van ER en PR, met een slechtere prognose in vergelijking met luminale tumoren en waarvoor specifieke geneesmiddelen nodig zijn die gericht zijn tegen het HER2/neu-eiwit⁹.

De ontwikkeling van BC is een proces dat uit meerdere stappen bestaat en een vroege diagnose is essentieel voor een succesvolle behandeling van de ziekte^. Ondanks recent naar voren gekomen gepersonaliseerde BC-behandelingsopties (bijv. endocriene en anti-HER2-antilichaamtherapieën), blijft BC oncologen uitdagen. Net als chirurgie, chemotherapie en radiotherapie kunnen deze gepersonaliseerde therapieën ook ernstige bijwerkingen hebben en kunnen patiënten resistentie tegen deze middelen ontwikkelen, waardoor het een uitdaging op lange termijn is om de beste strategie te bepalen^11,12. Daarom is een beter begrip van de wisselwerking tussen de tumor en zijn micro-omgeving essentieel en zal dit naar verwachting nieuwe richtingen bieden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen die rekening houden met de specifieke kenmerken van de verschillende BC-subtypes¹³. Een nieuwe golf van immunotherapieën, zoals antilichaamgeneesmiddelconjugaten, adoptieve T-celtherapieën, vaccins en nieuwe HER2-gerichte monoklonale antilichamen (mAbs) wordt bestudeerd in een brede populatie van patiënten met tumoren die HER2 tot expressie brengen¹⁴.

Trastuzumab vertegenwoordigt bijvoorbeeld een efficiënte behandelingsmodaliteit voor HER2+ BC. Als onderdeel van zijn werkingsmechanisme bemiddelt Trastuzumab fragmentkristalliseerbare gammareceptor (FcγR)-afhankelijke activiteiten. FcγR's onderscheiden zich door hun affiniteit voor het Fc-fragment en de immuunrespons die ze initiëren. Het activeren van FcγRIIIa (CD16A) op natural killer (NK)-cellen is cruciaal voor het mediëren van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC), terwijl het activeren van FcγRIIa (CD32A) en FcγRIIIa op macrofagen antilichaamafhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) ^induceert15. Studies op diermodellen toonden aan dat muizen zonder FcγRI (CD64) en FcγRIII (CD16) receptoren niet in staat waren om beschermende immuunresponsen tegen tumorspecifieke antigenen te initiëren, wat aantoont dat ADCC waarschijnlijk een belangrijk werkingsmechanisme is voor de mAb Trastuzumab¹⁶.

Aangezien NK-cellen hun toevlucht nemen tot tumorcelgebonden Abs voor het doden van kankercellen door ADCC, is expressie van Fc-receptoren van cruciaal belang voor een efficiënte behandeling met Trastuzumab¹⁷ (Figuur 1). Bovendien wordt hun werking efficiënt in evenwicht gehouden door een stimulatie van activerende en remmende receptoren, b.v. Killer-cell immunoglobuline-achtige (KIR) receptoren¹⁸.

Figuur 1. Mechanisme van ADCC in de context van een antitumorrespons. De Fcγ-receptor van een natural killer (NK)-cel herkent het Fc-gebied van een antilichaam, dat eerder was gebonden aan een oppervlakte-antigeen op een kankercel. Deze immunologische synaps leidt tot de degranulatie van de NK-cel, waarbij cytotoxische mediatoren zoals granzymen en perforine vrijkomen. Deze moleculen dragen bij aan de porievorming in het celmembraan en activeren apoptotische routes die geprogrammeerde celdood van de doelcel veroorzaken (afbeelding gemaakt met Biorender.com). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De ontwikkeling van immunotherapie voor HER2+ BC vertegenwoordigt een evoluerend veld. In dit geval moet rekening worden gehouden met interacties tussen verschillende componenten van het immuunsysteem. Bovendien zijn in eerdere publicaties combinatietherapieën met alle soorten traditionele, immuun- of celtherapieën uitgebreid getest om synergetische combinaties te^{identificeren19}.

Verschillende 3D-modellen van HER2+ BC zijn eerder gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen. Balalaeva et al. gebruikten bijvoorbeeld SKBR-3-sferoïden die HER2 tot overexpressie brachten om de cytotoxiciteit van het HER2-gerichte immunotoxine 4D5scFv-PE40²⁰ te beoordelen. In een andere studie werd een op 3D Matrigel gebaseerd HER2+ BC-kweeksysteem opgezet om de celgroei te meten als reactie op trastuzumab en endocriene^middelen21. Deze studies benadrukken het belang van tumorsferoïde modellen van HER2 die kankercellen tot overexpressie brengen bij het vertegenwoordigen van een effectieve strategie om therapeutische responsen klinisch te verbeteren²².

Onze groep identificeerde eerder Sunitinib, een multitargeted tyrosinekinaseremmer, als een remmer van Trastuzumab-afhankelijke ADCC in JIMT-1 HER2+ BC-cellen in een 2D-kweektest. Uit de studie bleek dat Sunitinib autofagie induceert en de dodende functie van NK-cellen schaadt, waardoor de HER2-expressie wordt verlaagd en de oppervlaktehechting van JIMT-1-cellen wordt verbeterd¹⁷.

Hier hebben we een nieuw 3D, sferoïde ADCC-model (NK.92.CD16 + Trastuzumab + JIMT-1-EGFP-kankercellen) opgesteld dat kan worden gebruikt voor screeningstoepassingen met hoge doorvoer en, om de bovengenoemde bevindingen te valideren, werd Sunitinib gebruikt als modelverbinding. Eerst genereerden we EGFP die JIMT-1-cellen tot expressie bracht¹⁷ en kweekten we sferoïden uit deze cellen. ADCC werd geïnduceerd door NK-cellen samen met Trastuzumab, en sferoïden werden gedurende 24 uur in kweek gehouden in de aan- of afwezigheid van testverbindingen (figuur 2). De kwantificering van ADCC is gebaseerd op de detectie van apoptotische kankerceldood (Annexine V-kleuring) met behulp van een High-Content Analysis-systeem.

Figuur 2. ADCC in een 3D sferoïde co-cultuur systeem. Onze experimentele instellingen zijn gebaseerd op een 3D-sferoïde systeem dat de in vivo micro-omgeving nauwkeuriger kan modelleren in vergelijking met 2D-modellen. JIMT-1 EGFP-borstkankercellen werden gezaaid op een concave celafstotende bodem om een ronde cellulaire cluster te vormen, sferoïde genaamd. ADCC werd vervolgens geïnitieerd door NK92 toe te voegen. CD16 natural killer-cellen (E:T-verhouding = 20:1) en een anti-HER2 monoklonaal antilichaam, Trastuzumab. Het experimentele model is efficiënt en gemakkelijk toepasbaar gebleken voor de identificatie van ADCC-modificerende testverbindingen (afbeelding gemaakt met Biorender.com). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

We hebben aangetoond dat het op deze manier verwerven van gegevens in realtime kan worden gedaan en statistisch robuust is voor gebruik bij screening met een hoog gehalte bij de ontdekking van kankergeneesmiddelen. Belangrijk is dat dit model een uitgebreide validatie van een grotere reeks verbindingen mogelijk maakt en kan worden toegepast op verschillende interessante tests.

1. Opzetten van het JIMT-1-enhanced fluorescent protein (EGFP) sferoïde model

1. Om een U-vormige celafstotende bodem te vormen, smeert u de plaat met 96 putjes in met 0,5% agarose-PBS-oplossing (30 μL/putje). Incubeer de plaat ongeveer 30-45 minuten bij kamertemperatuur.
2. Was de JIMT-1-EGFP-cellen twee keer met 2 ml steriele PBS (het genereren van een JIMT1-EGFP-cellijn werd gerapporteerd in een eerdere publicatie¹⁷). Gebruik T25-weefselkweekkolven en JIMT-1-media (DMEM/F-12-medium aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS), 0,3 E/ml insuline (100 IE/ml, humuline R) en 1% penicilline-streptomycine) voor de celkweek.
3. Voeg 2 ml trypsine-EDTA toe aan de kolf en incubeer het gedurende 10 minuten in een CO_{2 -} incubator.
4. Tik op de kolf om te controleren of JIMT-1-cellen na de incubatietijd zijn losgekomen.
5. Gebruik 2 ml JIMT-1 medium om de spijsvertering te stoppen en vang de celsuspensie op in een buisje van 15 ml.
6. Tel de cellen in een Bürker-kamer met 0,4% trypanblauw (80 μL van de kleurstof + 20 μL van de celsuspensie) en pas het celaantal aan tot 20.000 cellen/ml.
7. Pipetteer 100 μl van de celsuspensie (2000 cellen/putje) op elk putje van de plaat met 96 putjes (vooraf gecoat met 0,5% agarose-PBS-oplossing zoals aangegeven in punt 1.1).
8. Laat de cellen samenklonteren gedurende een incubatietijd van 3 dagen bij 37 °C in een CO₂ -incubator.
9. Controleer regelmatig de grootte en vorm van sferoïden met een omgekeerde microscoop.

2. Coating van de HCS-plaat

OPMERKING: Om te voorkomen dat JIMT-1-EGFP-sferoïden aan het glasoppervlak van de plaat worden bevestigd, is het van cruciaal belang om de High-Content Screening (HCS)-plaat te coaten (anders zou een analyse met een hoog gehalte niet mogelijk zijn).

1. Smeer op dag 3 na inductie van sferoïden de zeefplaat met 96 putjes met een hoog gehalte in met Pluronic-F127 (0,5% in DMSO, 50 μL/putje) en incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
2. Zuig de coatingoplossing op en was de putjes twee keer met DMEM/F-12-serumvrij medium (100 μL/putje).

3. Overdracht van sferoïden naar de HCS-plaat

1. Breng de sferoïden met behulp van een pipet van 1 ml in drievoud over op de HCS-plaat met 96 putjes aan de glazen bodem.

4. Voorbehandeling van JIMT-1 EGFP-sferoïden met teststoffen

1. Voeg de teststof toe (bv. Sunitinib verdund in DMSO in een concentratie van 40 μM) door 10 μl/putje te pipetteren en voeg 10 μl vers JIMT-1-medium toe aan de controleputjes (CTL).
2. Incubeer de plaat gedurende 1 uur in een CO₂ -incubator bij 37 °C.

5. Inductie van ADCC door toevoeging van de effectorcellen

OPMERKING: CD16.176V.NK92-cellen (hierna NK-cellen genoemd) werden gekweekt in α-MEM aangevuld met 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvaat, 1% glutamine, 1% penicilline-streptomycine en 100 IE/ml IL-2.

1. Verzamel de NK-cellen in de kolf in een buisje van 15 ml. Tel de cellen met trypanblauw (80 μL van de kleurstof + 20 μL van de celsuspensie) en pas de celdichtheid aan tot een effector-tot-doel (E:T)-verhouding van 20:1 (40.000 NK-cellen/putje).
2. Kleur de NK-cellen met 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL in 1 ml α-MEM NK-medium) en plaats ze gedurende 1 uur in een CO₂ -incubator bij 37 °C.
3. Centrifugeer de NK-cellen tweemaal bij 150 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om het teveel aan kleurstof te wassen met 1 ml α-MEM-medium.
4. Resuspendeer de NK-celpellet in 1 ml vers JIMT-1-medium.
5. Voeg de gekleurde NK-cellen samen met het anti-HER2-antilichaam (Ab) (Trastuzumab, opgelost in steriel gedestilleerd H₂O) toe aan de beoogde JIMT-1-sferoïden door 55 μL/putje CTB-gekleurde NK-cellen en 55 μL/putje van 10 μg/ml Ab in JIMT-1-medium te pipetteren (het totale volume van de behandeling dat voor de ADCC wordt toegevoegd, is 110 μL/putje en de uiteindelijke Sunitinib-concentratie is 20 μM).
   OPMERKING: Voor de selectie van Ab-concentratie en E:T-ratio hebben we ons gebaseerd op onze vorige publicatie¹⁷. Voorbereidende experimenten werden uitgevoerd met verschillende E:T-verhoudingen en concentraties van Trastuzumab om te beoordelen welke het meest effectief was bij het induceren van ADCC in sferoïden (aanvullende figuur S1).
6. Voeg 110 μL/putje vers JIMT-1-medium toe aan controleputjes (CTL).
7. Incubeer de plaat gedurende 24 uur in een CO₂ -incubator bij 37 °C.
   OPMERKING: Aangezien bekend is dat NK92-cellen niet-specifieke cytotoxische functies uitoefenen, worden voor controle JIMT-1-cellen gebruikt die gelijktijdig zijn geïncubeerd met zowel NK-cellen alleen als met een isotypecontrole of een F(ab')₂ Ab. Hier werd F(ab')2-Trastuzumab (TR-F(ab')₂) gebruikt als een negatieve CTL. TR-F(ab')_2-fragment werd bereid zoals gerapporteerd door Tóth et ^al.19 en toegevoegd in hetzelfde volume als Trastuzumab samen met NK-cellen zoals beschreven in 5.5. De concentratie werd aangepast naar 6,6 μg/ml, wat overeenkomt met een equimolaire concentratie met Trastuzumab²³.

6. Bijlage V-647 kleuring van sferoïden

1. Om apoptotische celdood te meten, kleurt u de sferoïden gedurende 1 uur met Annexin V-Alexa Fluor 647-conjugaat in JIMT-1-medium (1:100) door 50 μL/putje te pipetteren.

7. Beeldvorming

OPMERKING: De plaat wordt 24 uur na de toevoeging van de NK-effectorcellen aan de doelcellen afgebeeld. Voor beeldvorming wordt gebruik gemaakt van een High-Content Analyzer en beeldanalysesoftware.

1. Selecteer het type microplaat in de lijst met platen met behulp van de optie Plaattype . Gebruik een HCS-plaat (High-Content Screening) met 96 putjes.
2. Selecteer Two Peak-autofocus terwijl de test wordt uitgevoerd in platen met 10x objectief met 0.3 numerieke apertuur (NA), met behulp van respectievelijk de opties Autofocus en Objectief . Kies de confocale modus met de optie Opt. Mode en pas Binning 2 toe met behulp van de Binning-optie .
3. Voor beeldvorming van sferoïden selecteert u de juiste kanalen met behulp van de optie Kanaalselectie . Om de EGFP-getransduceerde JIMT-1-cellen te detecteren, kiest u EGFP (integratietijd 200 ms, laservermogen 50%, stapelhoogte 2,0 μm; bijv.: 488 nm em: 500-550 nm) en om apoptotische cellen te detecteren gebruikt u Alexa 647 (integratietijd 100 ms, laservermogen 50%, stapelhoogte 10,0 μm; bijv.: 640 nm em: 650-760 nm). Om de NK-cellen in de sferoïden te visualiseren, kiest u het volgende kanaal: DAPI (integratietijd 100 ms, laservermogen 50%, stapelhoogte 2,0 μm; bijv.: 405 nm em: 435-480 nm).
4. Selecteer in de optie Lay-outselectie Z-stapels, aangezien cellen in de sferoïden zich meestal op verschillende brandpuntsvlakken van de microscoop bevinden. 10 vlakken (met een afstand van 10 μm) zijn voldoende om het hele sferoïde gebied te bestrijken. Stel de waarden van het eerste vlak en het laatste vlak in op respectievelijk 0 μm en 90 μm.
   OPMERKING: Voordat met de meting wordt begonnen, kunnen voorbeeldfoto's worden gemaakt met de snapshot-functie om de juiste instellingen te controleren.
5. Stel het aantal putten en velden in voor beeldvorming met behulp van de optie Lay-out definiëren .

8. Analyse met hoog gehalte (HCA)

OPMERKING: Analyseer de afbeeldingen met de Harmony-software of exporteer afbeeldingen voor analyse met behulp van voorkeurssoftware van derden. Voor de analyse van de ADCC-efficiëntie wordt de fluorescentie-intensiteit van Annexine V 647 gemeten. Doelcellen die door ADCC zijn gedood, verschijnen in het perifere gebied van de sferoïden. Daarom worden de Annexine V-positieve cellen gemeten in deze sferoïde "ring". Om deze methode te valideren, werden analyses uitgevoerd met verschillende parameters om te beoordelen welke het meest betrouwbaar was en de beste resultaten opleverde (aanvullende figuur S2). In de video wordt een ADCC-put getoond om het beeldanalyseproces stap voor stap te demonstreren.

1. Identificeer de sferoïden aan de hand van de EGFP-fluorescentie van JIMT-1-cellen met behulp van de optie Textuurregio's zoeken en filter ze uit op grootte (> 25.000 μm²).
2. Verwijder randobjecten door de optie Populatie selecteren .
3. Aangezien Annexine V-positieve (apoptotische) cellen aan de periferie van sferoïden verschijnen, meet u de Annexine-intensiteit in deze apoptotische 'ring', geselecteerd door de optie Regio selecteren (buitengrens -90%) om de apoptotische celdood te bepalen.
4. Druk de intensiteitswaarden van bijlage V uit als gemiddelde intensiteit.

EGFP-expressie van JIMT-1-cellen werden gegenereerd en uit deze cellen werden sferoïden gekweekt. Sunitinib werd gebruikt als teststof omdat eerder was aangetoond dat het het beloop van ADCC¹⁷ beïnvloedde. Sferoïden mochten 72 uur samenklonteren. Op dag 3 werden 10 μg/ml Trastuzumab (of equimolair 6,6 μg/ml TR-F(ab')₂¹⁹) en NK-cellen (20:1) aan de sferoïden toegevoegd in aanwezigheid of afwezigheid van 20 μM Sunitinib (1 uur voorbehandeling), gedurende een totale tijd van 24 uur. JIMT-1 alleen en JIMT-1 gecoördineerd met NK-cellen (20:1) werden gebruikt als CTL's. Sferoïden werden gedurende 1 uur gekleurd met Annexine V 647 om apoptotische celdood te detecteren en werden vervolgens in beeld gebracht met een High-Content Analyzer.

Zoals aangegeven door Annexine V-kleuring, veroorzaakte toevoeging van NK-cellen samen met Trastuzumab aan de JIMT-1-cellen celdood in de tumorsferoïden. Annexine-positieve (apoptotische) cellen ontstonden in de perifere zone van de sferoïden, zoals zichtbaar in figuur 3A. Aan de andere kant resulteerde de toevoeging van NK-cellen alleen niet in apoptose van tumorcellen. Om onderscheid te maken tussen het vermogen van Trastuzumab om ADCC te rekruteren en het directe biologische effect ervan, werd TR-F(ab')₂ zonder functioneel FcR-bindend vermogen gebruikt als een negatieve controle van Trastuzumab. Aangezien TR-F(ab')₂ in dit model niet effectief bleek te zijn (Figuur 3B), wordt het effect waarschijnlijk gemedieerd via ADCC. Bovendien verminderde voorbehandeling met Sunitinib de kleuring van Annexine V in de sferoïden, wat de door Sunitinib geïnduceerde ADCC-resistentie bevestigde en de preventie van apoptotische celdood in JIMT-1-sferoïden die samen met NK-cellen en Trastuzumab waren geïncubeerd, aan het licht bracht.

Figuur 3. Detectie van ADCC-effectorverbindingen in een 3D-sferoïde model. Tumorsferoïden werden gegenereerd met JIMT-1-EGFP-cellen. Na een incubatietijd van 3 dagen werden sferoïden overgebracht naar een HCS-plaat, eerder gecoat met Pluronic F-127 om celhechting te voorkomen. De volgende dag 10 μg/ml Trastuzumab (TR) (of equimolair 6,6 μg/ml TR-F(ab')₂ als negatieve CTL) en NK92. CD16-cellen (vooraf gekleurd met Cell Tracker Blue) werden aan de putjes toegevoegd (E:T-verhouding van 20:1), in afwezigheid of aanwezigheid van 20 μM Sunitinib (SUN). Alleen JIMT-1-sferoïden en JIMT-1-sferoïden die samen met NK-cellen (20:1) waren geïncubeerd, werden gebruikt als CTL's. (A) Na een incubatietijd van 24 uur werd Annexine V 647 (rode kleur) gebruikt om de sferoïden gedurende 1 uur te kleuren om apoptotische cellen zichtbaar te maken. (B) Beelden van 3 sferoïden/conditie werden genomen en geanalyseerd op de fluorescentie-intensiteit van annexine V 647 in het perifere gebied van de sferoïden (ringgebied). Histogram toont 4 onafhankelijke experimenten (gemiddelden±SEM). Gegevens werden geanalyseerd met de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de post-hoctest van Dunn (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: niet significant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze gegevens bevestigen dat Sunitinib ADCC remt. Verwacht wordt dat ADCC-versterkende verbindingen op een vergelijkbare manier zullen worden geïdentificeerd. Samenvattend kan onze HCS-test geschikt zijn voor de identificatie van verbindingen die ADCC beïnvloeden.

Aanvullende figuur S1. Optimalisatie van de E:T-verhouding en de Trastuzumab-concentratie. JIMT-1-EGFP-cellen werden gebruikt om sferoïden te genereren. Op dag 3 werden sferoïden overgebracht naar een HCS-plaat en werden NK-cellen toegevoegd in verschillende E:T-verhoudingen (20:1, 40:1 en 60:1) met 10, 20 en 50 μg/ml Trastuzumab (TR) om te zien wat de meest effectieve behandeling was die celdood in de sferoïden kon induceren. Controle (JIMT-1-EGFP) werd behandeld met JIMT-1 celkweekmedia. (A) Na 24 uur werden cellen gedurende 1 uur gekleurd met Annexine V 647 (rode kleur) en werd apoptotische celdood gemeten met HCA. Histogrammen tonen 3 onafhankelijke experimenten (gemiddelden±SEM). De kolommen geven de intensiteit weer van Annexine V 647 rond de JIMT-1 sferoïden. (B) Beelden van 3 sferoïden/conditie werden geanalyseerd voor de Annexine V 647-intensiteit van het ringgebied. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoctest (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: niet significant). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2. Evaluatie van JIMT-1-celapoptose in de sferoïden. JIMT-1-EGFP-cellen werden gebruikt om sferoïden te genereren. Op dag 3 werden sferoïden overgebracht naar een HCS-plaat en werden ze gedurende 1 uur voorbehandeld met 20 μM Sunitinib (SUN), waarna NK-cellen werden toegevoegd in een E:T-verhouding van 20:1 met 10 μg/ml Trastuzumab. Na 24 uur werden de cellen gedurende 1 uur gekleurd met Annexine V 647 en werd apoptotische celdood gemeten met HCA. Beelden van 3 sferoïden/aandoening werden geanalyseerd voor de intensiteit van Annexine V 647 (controle: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 NK-cellen+10 μg/ml Trastuzumab, ADCC+SUN: 20 μM Sunitinib+20:1 NK-cellen+10 μg/ml Trastuzumab). De kolommen vertegenwoordigen de intensiteit van Annexine V 647 rond de JIMT-1 sferoïden (ring) (A), in de hele sferoïde (B) en in de hele put (C). Histogrammen tonen 3 onafhankelijke experimenten (gemiddelden±SEM). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoctest (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: niet significant). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Ondanks aanzienlijke verbeteringen in de behandeling van BC in de afgelopen decennia, ontwikkelen patiënten nog steeds regelmatig medicatieresistentie of ervaren ze negatieve^{bijwerkingen24}. De hoge morbiditeit en mortaliteit die verband houden met BC vereisen een voortdurend onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen, net als robuuste screeningplatforms om nieuwe moleculen te identificeren die bruikbaar zijn voor therapeutische ontwikkeling²⁵. Deze strategieën vereisen op celkweek gebaseerde translationele assays. 3D-tumorkweeksystemen, zoals sferoïden en tumororganoïden, zijn onlangs naar voren gekomen als goedkope, eenvoudig te implementeren modellen die de belangrijkste aspecten van de pathofysiologie van tumoren beter weergeven dan conventionele monolaagculturen. Een van deze kenmerken is de ruimtelijk gecoördineerde interactie tussen verschillende tumor-geassocieerde immuuncellen en kankercellen. Dit maakt 3D-cocultuurmodellen tot superieure hulpmiddelen voor het screenen van geneesmiddelen, gericht op modulatoren die inwerken op immuuncellen om maligniteiten te behandelen^.

In dit werk hebben we een nieuw sferoïde model geïntroduceerd voor NK-cel-gemedieerde Trastuzumab-afhankelijke ADCC tegen JIMT-1 borstcarcinoomcellen en een geautomatiseerde beeldvormings- en analyseworkflow beschreven voor de evaluatie van NK-cel-gemedieerde kankerceldoding. De procedure werd geïmplementeerd voor een high-content imager en beeldanalysesoftware waarmee het ziekterelevante vermogen van de NK-cellen om apoptose van kankercellen te induceren, kan worden gecontroleerd. De multitargeted tyrosinekinaseremmer Sunitinib als een stof die resistentie induceert tegen Trastuzumab-afhankelijke ADCC in JIMT-1-cellen in 2D-celkweektesten werd eerder geïdentificeerd. Sunitinib schaadt de dodende functie van NK-cellen en induceert autofagie, neerwaartse regulatie van HER2-expressie en verbetert de hechting van JIMT-1-cellen¹⁷. Om onze sferoïde analysepijplijn voor de identificatie van verbindingen te valideren, hebben we Sunitinib getest als een modelverbinding en laten we zien dat het het vermogen van NK-cellen om de sferoïden van kankercellen te doden aanzienlijk kan belemmeren door het effect te reproduceren dat het in monolaag heeft aangetoond.

Onze methode is eenvoudig en bestaat uit de groei van sferoïden in met agarose beklede weefselkweekplaten met 96 putjes, een eenmalige overdracht van de gevormde sferoïden in een microplaat met glazen bodem die geschikt is voor HCS- en HCA-toepassingen, de toevoeging van testverbindingen en de afzonderlijk gekleurde NK-cellen die worden geactiveerd om te doden door toediening van Trastuzumab, een celdoodkleuring in één stap en de microscopieanalyse. Er worden geen ernstige manipulaties toegepast op de putten na het begin van de co-kweek van de twee celtypen en de medicamenteuze behandeling om te voorkomen dat de integriteit van de sferoïden in gevaar komt. De test duurt slechts 4 dagen om uit te voeren. Het coaten van de onderkant van weefselkweekplaten met 96 putjes met 1% laagsmeltende agarose als onderdeel van de procedure is een goedkoop alternatief voor het gebruik van ultralage bevestigingsplaten om te voorkomen dat JIMT-1-cellen zich aan het oppervlak van de plaat hechten en om de spontane organisatie van de tumorcellen in sferoïden te bevorderen. Omdat het niet mogelijk is om beelden vast te leggen over het agarosekussen en het U-vormige plastic oppervlak, moesten de sferoïden worden overgebracht naar de beeldplaat. Cruciaal was de passivering van het glasoppervlak van de HCS-plaat met de bio-inerte oppervlakteactieve stof, Pluronic-F127 vóór de overdracht van sferoïden. Zonder deze stap verspreiden sferoïden zich over de bodem van de putten, waardoor de beeldvorming en analyse moeilijk worden.

Een menselijke tumorcellijn die stabiel EGFP tot expressie brengt, werd gebruikt voor het vormen van sferoïden¹⁷. De genetisch gecodeerde marker biedt gedurende het hele protocol aanhoudende fluorescentie in plaats van celkleuringen. Ongecontroleerde textuuranalyse van het EGFP-signaal vormt de basis voor het herkennen van de compacte kern van de sferoïden, die de hele sferoïde omvat zonder celdoodinductie. Toen NK-cellen werden toegevoegd en ADCC werd geïnduceerd, vormde de duidelijke desintegratie van de contouren soms een uitdaging voor het beeldanalyse-algoritme om de omtrek van de sferoïde af te bakenen. Omdat Annexine V-positieve cellen voornamelijk aan de periferie van de sferoïden werden gevonden, werd dit probleem omzeild door celdood te evalueren in een perifeer ringvormig gebied dat werd gegenereerd door de ingebouwde beeldsegmentatiemodule van de software door de goed gedefinieerde sferoïde kern uit te breiden. De expansiefactor die de buitengrens van dit gebied definieert, werd gekozen om in alle gevallen de halfschaduw van stervende, versnipperde en verspreide cellen te omvatten na het visueel samenstellen van honderden sferoïde beelden. Het bepalen van de totale fluorescentie van het apoptotische ringgebied in de maximale projecties van Z-stack-beelden leverde lagere experimentele fouten en een meer uitgesproken ADCC-effect op dan het meten van het hele sferoïde gebied of het hele putgebied (aanvullende figuur S2). Er werd gekozen voor fluorescerende labels voor het markeren van de BC-cellen (EGFP) en het detecteren van celdood (Alexa 647) om de noodzaak van kanaalscheiding uit te sluiten. Er werd gekozen voor een eindpuntuitlezing op basis van fluorescerende etikettering voor blootgesteld fosfatidylserine, een apoptotische marker, in tegenstelling tot het monitoren van de afname van EGFP-fluorescentie om de levensvatbaarheid van sferoïden in de loop van de tijd te bepalen, wat een andere optie zou kunnen zijn. Annexinekleuring maakte een nauwkeurigere en gevoeligere identificatie van celdood mogelijk. In principe is het mogelijk om de huidige eendimensionale kleuringsbenadering te verbeteren door deze aan te vullen met aanvullende, preciezere celdoodmarkers die de celdoodmodaliteit (bijv. fluorescerende caspasesubstraten) en het afgestorven celtype kunnen identificeren.

Deze methode kan met minimale veranderingen worden aangepast om andere effector-immuunceltypen (macrofagen, T-cellen en chimere antigeenreceptor [CAR]-expressieve immuuncellen) en activatormoleculen (bijv. cytokines, interleukinen) te bestuderen. Met het oog op eenvoud, robuustheid en korte verwerkingstijd hebben we de mogelijkheden die HCA voor deze test kan bieden nog niet uitgeput. De beeldvormings- en analyseprotocollen zijn geschikt voor de toevoeging van verdere fluorescerende labels. Deze test is aanpasbaar om complexere sferoïden te bestuderen door verschillende soorten cellen toe te voegen en multiplexed fluorescerende sondes te gebruiken om die celtypen en specifieke fluorescerende markers te onderscheiden om ze te koppelen aan lopende cellulaire gebeurtenissen ^4,5. Het protocol kan worden aangepast aan elke HC-imager en de beelden kunnen worden geanalyseerd met elke beeldanalysesoftware met een textuuranalysemodule.

Belangrijk aspect van het belang van dit protocol is het gebruik van sferoïden. Er moet dus rekening worden gehouden met een aantal parameters. Het is bekend dat cellen in 3D-kweek een verzwakte respons op verbindingen vertonen in vergelijking met cellen die in monolagen worden gekweekt ^21,22. Het gebruik van 2D-celculturen maakt het niet mogelijk om het effectieve concentratiebereik van een getest middel in het hele organisme te voorspellen. Bij het opzetten van ons 3D-model hebben we hogere concentraties verbindingen en E:T-verhoudingen getest dan die in 2D worden gerapporteerd. Het protocol werd bijvoorbeeld geoptimaliseerd door de E:T-verhouding te verhogen van 2:1 die werd gebruikt in onze 2D ADCC-test¹⁷ tot 20:1 voor de kankersferoïden. De reden hierachter zou kunnen zijn dat de medicijnen niet in staat waren om effectief door te dringen in de kern van sferoïden en vooral de cellen van de buitenste lagen aantastten. Aan de andere kant zorgde het verhogen van de concentratie van Trastuzumab niet voor een verdere verbetering van de ADCC-respons (aanvullende figuur S1). Deze selectie kan verschillen tussen cellijnen en doellijnen. Het zou dus interessant zijn om dit protocol te testen op andere cellijnen, bijvoorbeeld een niet-HER2 BC-cellijn, rekening houdend met het feit dat het HER2-expressieniveau een belangrijke bepalende factor is voor de ADCC-respons²⁰.

Samengevat vertegenwoordigt onze nieuwe methode een snel en robuust platform om het effect van verbindingen in een 3D-immuunkankermodel te analyseren met het potentieel om te worden gebruikt voor high-throughput screening van geneesmiddelen. Dit benadrukt de relevantie van het gebruik van HER2+ BC-sferoïden en NK92. CD16-cellen bij het verder verbeteren van het begrip van de moleculaire mechanismen van Trastuzumab, waardoor de mogelijkheid wordt geboden om te anticiperen op de effectiviteit van Trastuzumab-afhankelijke ADCC in het therapeutisch potentieel in vivo²⁷. De zoektocht naar nieuwe anti-tumor immuunmodulatoren kan veel baat hebben bij deze test. De methode kan worden uitgebreid tot gepersonaliseerde chemosensitiviteitstesten van tumorcelculturen die afkomstig zijn van patiënten. We hebben aangetoond dat de traditionele 2D-coculturen die worden gebruikt bij het doden van immuuncellen en ADCC-tests kunnen worden omgezet in 3D-sferoïde assays, waardoor hun translationele relevantie mogelijk toeneemt.