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Cancer Research

एक ट्यूमर गोलाकार मॉडल में एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर Cytotoxicity quantifying : दवा की खोज के लिए आवेदन

Published: April 26, 2024 doi: 10.3791/65922
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 1, 1,4, 1,4
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, 4HUN-REN-DE Cell Biology and Signaling Research Group

Summary

यहां, हम यौगिकों की पहचान करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो एडीसीसी तंत्र को संशोधित करते हैं, एंटीट्यूमर एंटीबॉडी का एक महत्वपूर्ण कैंसर सेल-हत्या तंत्र। एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक प्रभाव को Trastuzumab की उपस्थिति में स्तन कैंसर सेल स्फेरॉइड में मापा जाता है। छवि विश्लेषण जीवित और मृत हत्यारे और स्फेरॉइड में लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान करता है।

Abstract

ट्यूमर एंटीजन को लक्षित करने वाली मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोथेरेपी अब कैंसर उपचार का एक मुख्य आधार है। एंटीबॉडी की कार्रवाई के नैदानिक रूप से प्रासंगिक तंत्रों में से एक एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) है, जहां एंटीबॉडी कैंसर कोशिकाओं को बांधता है और ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर घटक, जैसे, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं को संलग्न करता है। इन उपचारों की प्रभावशीलता को सहायक यौगिकों की पहचान करके सुधार किया जा सकता है जो कैंसर कोशिकाओं की संवेदनशीलता या प्रतिरक्षा कोशिकाओं की शक्ति को बढ़ाते हैं। इसके अलावा, पिछली स्थितियों या कैंसर से जुड़े लक्षणों के लिए सह-औषधीय कैंसर रोगियों में अनदेखा दवा बातचीत एंटीबॉडी थेरेपी की सफलता निर्धारित कर सकती है; इसलिए, इस तरह की अवांछित दवा बातचीत को समाप्त करने की आवश्यकता है। इन लक्ष्यों को ध्यान में रखते हुए, हमने एक कैंसर एडीसीसी मॉडल बनाया और एडीसीसी-मॉड्यूलेटिंग दवाओं को खोजने के लिए यहां एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन किया। चूंकि कैंसर सेल स्फेरॉइड जैसे 3 डी मॉडल एंटीकैंसर थेरेपी के लिए ट्यूमर के विवो प्रतिक्रियाओं में भविष्यवाणी करने में 2 डी संस्कृतियों से बेहतर हैं, ईजीएफपी-व्यक्त एचईआर 2 + जेआईएमटी -1 स्तन कैंसर कोशिकाओं और एनके 92 के स्फेरॉइड सह-संस्कृतियां। सीडी 16 सेल लाइनों को स्थापित किया गया था और ट्रास्टुज़ुमाब के साथ प्रेरित किया गया था, जो एचईआर 2-पॉजिटिव स्तन कैंसर के खिलाफ नैदानिक रूप से अनुमोदित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है। JIMT-1 spheroids सेल से बचाने वाली क्रीम यू-नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेटों में फार्म करने के लिए अनुमति दी गई थी. 3 दिन, एनके कोशिकाओं और Trastuzumab जोड़ा गया. स्फेरॉइड को तब एपोप्टोटिक सेल डेथ को मापने के लिए एनेक्सिन वी-एलेक्सा 647 के साथ दाग दिया गया था, जिसे स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ स्फेरॉइड के परिधीय क्षेत्र में मात्राबद्ध किया गया था। एडीसीसी-मॉड्यूलेटिंग अणुओं की पहचान करने के लिए हमारे परख की प्रयोज्यता को यह दिखाकर प्रदर्शित किया जाता है कि मेटास्टैटिक कैंसर के खिलाफ एफडीए द्वारा अनुमोदित एक रिसेप्टर टाइरोसिन किनसे अवरोधक, लगभग पूरी तरह से एडीसीसी को समाप्त कर देता है। स्फेरॉइड और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइनों की पीढ़ी कैंसर सेल स्फेरॉइड में एडीसीसी-मॉड्यूलेटिंग यौगिकों के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के साथ संगत है।

Introduction

बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड (एमसीटीएस) व्यापक रूप से तीन आयामी (3 डी) मॉडल का उपयोग किया जाता है जो कैंसर कोशिका जीव विज्ञान में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करने और प्रतिनिधित्व करने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं की प्रवृत्ति के कारण बनते हैं। वे कई तकनीकों द्वारा सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला से उत्पन्न किया जा सकता है, जैसे तरल-आधारित और मचान-आधारित 3 डी संस्कृतियां1. मोनोलेयर 2 डी मॉडल पर उनका मुख्य लाभ यह है कि वे ट्यूमर कोशिकाओं के जैविक व्यवहार की नकल करके, अर्थात् संरचनात्मक संगठन और हाइपोक्सिया में विवो ट्यूमर की मुख्य विशेषताओं को पुन: व्यवस्थित करते हैं, विशेष रूप से चिकित्सीय पलायन और दवा प्रतिरोध2 के लिए अग्रणी तंत्र। इस प्रकार, चूंकि एमसीटीएस विषाक्तता और दवा संवेदनशीलता की भविष्यवाणी में सुधार कर सकता है, इसलिए वे व्यापक रूप से 3 डी में कैंसर का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं और विभिन्न प्रकारके कैंसर के लिए प्रभावी दवाओं के विकास को बढ़ा सकते हैं।

किसी भी बीमारी का अध्ययन करने के लिए, प्रासंगिक और सुविधाजनक मॉडल की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। कैंसर इम्यूनोलॉजी अध्ययन के लिए मॉडल स्थापित करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि प्रतिरक्षा प्रणाली में कई सेल प्रकार होते हैं। प्रत्येक सेल प्रकार में कई उपप्रकार और सक्रियण राज्यों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम होता है। ये विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार कैंसर कोशिकाओं और अन्य ट्यूमर घटकों के साथ बातचीत करते हैं, अंततः रोग के परिणाम को प्रभावित करते हैं। इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों में 2 डी इन जटिल सेलुलर इंटरैक्शन recapitulate करने में विफल, के रूप में वे अनुवाद क्षमता की कमी है और सिस्टम स्तर (जैसे, ऊतकों में)4,5 पर एक दवा की कार्रवाई की भविष्यवाणी करने में असमर्थ हैं. इसके अलावा, माउस मॉडल भी मानव और murine प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच मूलभूत अंतर के कारण गंभीर सीमाएं है. इसलिए, 3 डी संस्कृति प्रणाली उपलब्ध मॉडलों में मौजूदा अंतराल को भर सकती है, एक वैकल्पिक विधि प्रदान कर सकती है और कैंसर इम्यूनोलॉजी6 की हमारी समझ में सुधार कर सकती है। विशेष रूप से, अंडाकार आकृति मॉडल immunotherapies परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मुख्य रूप से प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और अंडाकार आकृति लक्ष्य7 के खिलाफ विरोधी tumoral प्रभाव को बढ़ाने के लिए दवा स्क्रीनिंग और चिकित्सीय एंटीबॉडी की दक्षता का आकलन करने के लिए. इसके अलावा, स्ट्रोमा कोशिकाओं (जैसे, लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज, फाइब्रोब्लास्ट्स) और कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए और नई एंटीकैंसर रणनीतियों के विकास के लिए विभिन्न चयापचय और प्रोलिफेरेटिव राज्यों में कोशिकाओं से बना एमसीटीएस की क्षमताका पर्याप्त प्रदर्शन किया गया है। इसलिए, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के पैथोफिज़ियोलॉजी को ध्यान में रखते हुए, दवा-परीक्षण प्रक्रिया को बढ़ावा देने के लिए भविष्य कहनेवाला और सटीक प्लेटफार्मों की पुष्टि करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।

स्तन कैंसर (बीसी) महिलाओं में दुनिया भर में सबसे अधिक पाया जाने वाला कैंसर है। इस विषम बीमारी का नैदानिक वर्गीकरण ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स की उपस्थिति पर आधारित है, उदाहरण के लिए, एस्ट्रोजन (ईआर) और प्रोजेस्टेरोन (पीआर) रिसेप्टर्स (सामूहिक रूप से हार्मोन रिसेप्टर्स, एचआर) के साथ-साथ मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (एचईआर 2) प्रोटीन / ऑन्कोजीन के अतिअभिव्यक्ति या प्रवर्धन के साथ। इन रिसेप्टर्स की इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिव्यक्ति के आधार पर, चार उपप्रकारों को आमतौर पर पहचाना जाता है: ल्यूमिनल ए (एचआर + / एचईआर 2-), ल्यूमिनल बी (एचआर + / एचईआर 2 +), एचईआर 2-पॉजिटिव (एचआर / एचईआर 2 +) और ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर (एचआर / एचईआर 2-)। HER2+ समूह BC मामलों के 10-15% का गठन करता है और ER और PR की अनुपस्थिति के साथ उच्च HER2 अभिव्यक्ति की विशेषता है, ल्यूमिनल ट्यूमर की तुलना में बदतर रोग का निदान होता है, और HER2/neu प्रोटीन9 के खिलाफ निर्देशित विशिष्ट दवाओं की आवश्यकता होती है।

बीसी विकास एक बहु-चरण प्रक्रिया है, और रोग10 के सफल उपचार के लिए एक प्रारंभिक निदान आवश्यक है। हालांकि, हाल ही में उभरे व्यक्तिगत बीसी उपचार विकल्प (जैसे, अंतःस्रावी और एंटी-एचईआर 2 एंटीबॉडी थेरेपी) के बावजूद, बीसी ऑन्कोलॉजिस्ट को चुनौती देना जारी रखता है। बस सर्जरी की तरह, कीमोथेरेपी, और रेडियोथेरेपी, इन व्यक्तिगत उपचारों भी गंभीर प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है और रोगियों को इन एजेंटों के प्रतिरोध विकसित कर सकते हैं, यह सबसे अच्छा रणनीति11,12 निर्धारित करने के लिए एक दीर्घकालिक चुनौती बनाने. इसलिए, ट्यूमर और उसके माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच परस्पर क्रिया की बेहतर समझ आवश्यक है और उपन्यास उपचार के विकास के लिए नई दिशाएं प्रदान करने की उम्मीद है जो विभिन्न बीसी उपप्रकारों की विशिष्टताओं को ध्यान में रख रहे हैं13. इम्यूनोथेरेपी की एक नई लहर, जैसे एंटीबॉडी दवा संयुग्म, दत्तक टी-सेल थेरेपी, टीके और उपन्यास एचईआर 2-निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) का अध्ययन एचईआर 2-व्यक्त ट्यूमर14 वाले रोगियों की एक व्यापक आबादी में किया जा रहा है।

उदाहरण के लिए, Trastuzumab, HER2+ BC के लिए एक कुशल उपचार पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है। अपनी क्रिया के तरीके के हिस्से के रूप में, Trastuzumab टुकड़ा क्रिस्टलीकृत गामा रिसेप्टर (FcγR) -निर्भर गतिविधियों की मध्यस्थता करता है। FcγR Fc टुकड़े के लिए उनकी आत्मीयता और उनके द्वारा शुरू की गई प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से प्रतिष्ठित हैं। प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं पर FcγRIIIa (CD16A) को सक्रिय करना एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी (ADCC) की मध्यस्थता के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि मैक्रोफेज पर FcγRIIa (CD32A) और FcγRIIIa को ट्रिगर करना एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर फागोसाइटोसिस (ADCP)15को प्रेरित करता है। पशु मॉडल पर अध्ययन से पता चला है कि FcγRI की कमी चूहों (CD64) और FcγRIII (CD16) रिसेप्टर्स ट्यूमर-विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को शुरू करने में असमर्थ थे, जिससे पता चलता है कि ADCC संभवतः mAb Trastuzumab16 के लिए कार्रवाई का एक प्रमुख तंत्र है।

चूंकि एनके कोशिकाएं एडीसीसी द्वारा कैंसर सेल की हत्या के लिए ट्यूमर सेल-बाउंड एबीएस का सहारा लेती हैं, इसलिए एफसी रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति ट्रास्टुज़ुमाब17 (चित्रा 1)के साथ एक कुशल उपचार के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, उनकी कार्रवाई कुशलता से सक्रिय और निरोधात्मक रिसेप्टर्स, जैसे, हत्यारा सेल immunoglobulin की तरह (केआईआर) रिसेप्टर्स18 की उत्तेजना द्वारा संतुलित है.

Figure 1
चित्र 1. एक एंटीट्यूमर प्रतिक्रिया के संदर्भ में एडीसीसी का तंत्र। एक प्राकृतिक हत्यारा (एनके) सेल का एफसीγ रिसेप्टर एक एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र को पहचानता है, जो पहले एक कैंसर सेल पर सतह एंटीजन से बंधा था। यह प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन एनके सेल के क्षरण की ओर जाता है जो ग्रैनजाइम और पेरफोरिन जैसे साइटोटोक्सिक मध्यस्थों को जारी करता है। ये अणु कोशिका झिल्ली में ताकना गठन में योगदान करते हैं और लक्ष्य कोशिका की क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (Biorender.com के साथ बनाई गई छवि) के कारण एपोप्टोटिक मार्गों को सक्रिय करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

HER2+ BC के लिए इम्यूनोथेरेपी विकास एक विकसित क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। इस मामले में, किसी को प्रतिरक्षा प्रणाली के विभिन्न घटकों के बीच बातचीत पर विचार करना चाहिए। इसके अलावा, पिछले प्रकाशनों बड़े पैमाने पर संयोजन चिकित्सा पारंपरिक के सभी प्रकार शामिल परीक्षण किया है, प्रतिरक्षा या सेल चिकित्सा synergizing संयोजन19 की पहचान करने के लिए.

HER2+ BC के कई 3D मॉडल पहले दवा की खोज के लिए उपयोग किए गए हैं। उदाहरण के लिए, Balalaeva एट अल SKBR-3 spheroids HER2 लक्षित immunotoxin 4D5scFv-PE4020 के cytotoxicity का आकलन करने के लिए HER2 overexpress इस्तेमाल किया. एक अन्य अध्ययन में, एक 3 डी Matrigel आधारित HER2 + बीसी संस्कृति प्रणाली Trastuzumab और अंतःस्रावी एजेंटों21 के जवाब में सेल वृद्धि को मापने के लिए स्थापित किया गया था. ये अध्ययन चिकित्सकीय चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं22 में सुधार करने के लिए एक प्रभावी रणनीति का प्रतिनिधित्व करने में एचईआर 2 overexpress कैंसर कोशिकाओं के ट्यूमर अंडाकार मॉडल के महत्व पर प्रकाश डाला.

हमारे समूह ने पहले सुनिटिनिब, एक बहुलक्षित टाइरोसिन किनसे अवरोधक की पहचान की, जो 2 डी संस्कृति परख में JIMT-1 HER2+ BC कोशिकाओं में Trastuzumab-निर्भर ADCC के अवरोधक के रूप में था। अध्ययन से पता चला है कि Sunitinib autophagy लाती है और एनके कोशिकाओं की हत्या समारोह impairs, HER2 अभिव्यक्ति downregulation और JIMT-1 कोशिकाओं17 की सतह लगाव को बढ़ाने.

यहां हमने उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले एक उपन्यास 3 डी, गोलाकार एडीसीसी मॉडल (एनके.92.सीडी 16 + ट्रास्टुज़ुमाब + जेआईएमटी-1-ईजीएफपी कैंसर कोशिकाओं) की स्थापना की और उपर्युक्त निष्कर्षों को मान्य करने के लिए, सुनीतिनिब का उपयोग एक मॉडल यौगिक के रूप में किया गया था। सबसे पहले, हम JIMT-1 कोशिकाओं17 व्यक्त EGFP उत्पन्न और इन कोशिकाओं से spheroids वृद्धि हुई. ADCC Trastuzumab के साथ एक साथ एनके कोशिकाओं द्वारा प्रेरित किया गया था, और spheroids उपस्थिति या 24 घंटे (चित्रा 2) के लिए परीक्षण यौगिकों की अनुपस्थिति में संस्कृति में रखा गया था. एडीसीसी की मात्रा का ठहराव एक उच्च-सामग्री विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके एपोप्टोटिक कैंसर कोशिका मृत्यु (एनेक्सिन वी धुंधला) का पता लगाने पर आधारित है।

Figure 2
चित्र 2. एक 3 डी गोलाकार सह-संस्कृति प्रणाली में ADCC. हमारी प्रयोगात्मक सेटिंग्स एक 3 डी स्फेरॉइड प्रणाली पर आधारित हैं जो 2 डी मॉडल की तुलना में विवो माइक्रोएन्वायरमेंट में अधिक सटीक रूप से मॉडल कर सकती हैं। JIMT-1 EGFP स्तन कैंसर कोशिकाओं को एक गोल आकार के सेलुलर क्लस्टर बनाने के लिए अवतल कोशिका विकर्षक तल पर वरीयता दी गई थी, जिसे स्फेरॉइड कहा जाता है। ADCC को तब NK92 जोड़कर शुरू किया गया था। CD16 प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं (E: T अनुपात = 20: 1) और एक एंटी-HER2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, Trastuzumab। प्रयोगात्मक मॉडल एडीसीसी संशोधित परीक्षण यौगिकों (Biorender.com के साथ बनाई गई छवि) की पहचान के लिए कुशल और आसानी से लागू साबित हुआ है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हमने प्रदर्शित किया कि इस तरह से डेटा प्राप्त करना वास्तविक समय में किया जा सकता है और कैंसर की दवा की खोज में उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग में उपयोग के लिए सांख्यिकीय रूप से मजबूत है। महत्वपूर्ण रूप से, यह मॉडल यौगिकों के एक बड़े सेट के विस्तारित सत्यापन की अनुमति देता है, और इसे ब्याज के कई परखों पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. JIMT-1-एन्हांस्ड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) स्फेरॉइड मॉडल की स्थापना

  1. एक यू के आकार की सेल से बचाने वाली क्रीम नीचे फार्म करने के लिए, 0.5% agarose-पीबीएस समाधान (30 μL/अच्छी तरह से) के साथ 96 अच्छी तरह से थाली कोट. लगभग 30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं.
  2. JIMT-1-EGFP कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस के 2 एमएल के साथ दो बार धोएं (JIMT1-EGFP सेल लाइन की पीढ़ी पिछले प्रकाशन17में रिपोर्ट की गई थी)। सेल कल्चर के लिए T25 टिशू कल्चर फ्लास्क और JIMT-1 मीडिया (DMEM/F-12 माध्यम 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 0.3 U/mL इंसुलिन (100 IU/mL, Humulin R), और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) का उपयोग करें।
  3. फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें और इसे सीओ2 इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. यह जांचने के लिए फ्लास्क टैप करें कि क्या इनक्यूबेशन समय के बाद JIMT-1 कोशिकाएं अलग हो गई हैं।
  5. पाचन को रोकने और सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए JIMT-1 माध्यम के 2 एमएल का उपयोग करें।
  6. 0.4% ट्राइपैन ब्लू (डाई के 80 माइक्रोन + सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोन) के साथ एक बर्कर कक्ष में कोशिकाओं की गणना करें और सेल नंबर को 20,000 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
  7. सेल निलंबन के पिपेट 100 माइक्रोन (2000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए (1.1 में संकेत के रूप में 0.5% agarose-पीबीएस समाधान के साथ पूर्व लेपित)।
  8. कोशिकाओं को एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 3 दिन के इनक्यूबेशन समय के दौरान एक साथ टकराने की अनुमति दें.
  9. नियमित रूप से एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ spheroids के आकार और आकार की जाँच करें.

2. एचसीएस प्लेट की कोटिंग

नोट: प्लेट की कांच की सतह पर JIMT-1-EGFP स्फेरॉइड के लगाव को रोकने के लिए, उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) प्लेट को कोटिंग करना महत्वपूर्ण है (अन्यथा उच्च-सामग्री विश्लेषण संभव नहीं होगा)।

  1. स्फेरॉइड के प्रेरण के बाद 3 दिन, प्लूरोनिक-एफ 127 (डीएमएसओ में 0.5%, 50 माइक्रोन/अच्छी तरह से) के साथ 96-अच्छी तरह से उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग प्लेट को कोट करें और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. कोटिंग समाधान महाप्राण और DMEM/F-12-सीरम मुक्त माध्यम (100 μL/अच्छी तरह से) के साथ दो बार कुओं धो लें.

3. एचसीएस प्लेट में स्फेरॉइड का स्थानांतरण

  1. एक 1 एमएल विंदुक का प्रयोग, कांच नीचे 96 अच्छी तरह से एचसीएस प्लेट के लिए triplicates में spheroids हस्तांतरण.

4. परीक्षण यौगिकों के साथ JIMT-1 EGFP spheroids का पूर्व उपचार

  1. 10 μL/अच्छी तरह से pipetting द्वारा परीक्षण यौगिक (जैसे, 40 माइक्रोन की एकाग्रता पर DMSO में पतला Sunitinib जोड़ें) और नियंत्रण (CTL) कुओं के लिए ताजा JIMT-1 माध्यम के 10 माइक्रोन जोड़ें.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए प्लेट सेते हैं.

5. प्रभावक कोशिकाओं को जोड़कर एडीसीसी का प्रेरण

नोट: CD16.176V.NK92 कोशिकाओं (बाद में NK कोशिकाओं के रूप में संदर्भित) को α-MEM में 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvate, 1% ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और IL-2 के 100 IU/mL के साथ पूरक किया गया था।

  1. फ्लास्क में एनके कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। ट्रिपैन ब्लू (डाई के 80 माइक्रोन + सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोन) के साथ कोशिकाओं की गणना करें और सेल घनत्व को 20: 1 प्रभावकार-से-लक्ष्य (ई: टी) अनुपात (40,000 एनके कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में समायोजित करें।
  2. 10 माइक्रोन सेल ट्रैकर ब्लू (सीटीबी के साथ एनके कोशिकाओं को दाग दें, α-एमईएम एनके माध्यम के 1 एमएल में 1 माइक्रोन) और उन्हें 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर एनके कोशिकाओं को दो बार α-एमईएम माध्यम के 1 एमएल के साथ डाई की अधिकता को धोने के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. ताजा JIMT-1 माध्यम के 1 एमएल में एनके सेल गोली resuspension.
  5. एंटी-एचईआर 2 एंटीबॉडी (एबी) (ट्रास्टुज़ुमाब, बाँझ आसुत एच2ओ में भंग) के साथ सना हुआ एनके कोशिकाओं को सीटीबी-सना हुआ एनके कोशिकाओं के 55 माइक्रोन/अच्छी तरह से पाइपिंग करके लक्ष्य जेआईएमटी -1 स्फेरॉइड में जोड़ें और जेआईएमटी -1 माध्यम में 10 माइक्रोग्राम / एमएल एबी के 55 माइक्रोन / अच्छी तरह से पाइप करके (एडीसीसी के लिए जोड़ा गया उपचार की कुल मात्रा 110 माइक्रोन / अच्छी तरह से और अंतिम सुनीटिनिब एकाग्रता 20 माइक्रोन है)।
    नोट: एबी एकाग्रता और ई: टी अनुपात के चयन के लिए, हमने अपने पिछले प्रकाशन17 पर भरोसा किया। प्रारंभिक प्रयोगों अलग ई: टी अनुपात और Trastuzumab की सांद्रता के साथ प्रदर्शन किया गया आकलन करने के लिए जो spheroids (अनुपूरक चित्रा एस 1) में ADCC उत्प्रेरण में सबसे प्रभावी था.
  6. (सीटीएल) कुओं को नियंत्रित करने के लिए ताजा JIMT-1 माध्यम के 110 μL/अच्छी तरह से जोड़ें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए थाली सेते हैं.
    नोट: चूंकि एनके 92 कोशिकाओं को गैर-विशिष्ट साइटोटोक्सिक कार्यों को लागू करने के लिए जाना जाता है, नियंत्रण के लिए जेआईएमटी -1 कोशिकाओं को अकेले एनके कोशिकाओं के साथ सह-ऊष्मायन किया जाता है और एक आइसोटाइप नियंत्रण या एफ (एबी') 2 एबी के साथ। यहां एफ (एबी ') 2-ट्रास्टुज़ुमाब (टीआर-एफ (एबी') 2) का उपयोग नकारात्मक सीटीएल के रूप में किया गया था। TR-F (ab')2 टुकड़ा Tóth et al.19 द्वारा रिपोर्ट के रूप में तैयार किया गया था और 5.5 में वर्णित के रूप में NK कोशिकाओं के साथ Trastuzumab के रूप में एक ही मात्रा में जोड़ा गया था। एकाग्रता को Trastuzumab23 के साथ एक समतुल्य एकाग्रता के अनुरूप 6.6 μg/mL पर समायोजित किया गया था।

6. एनेक्सिन V-647 स्फेरॉइड का धुंधला हो जाना

  1. एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को मापने के लिए, 50 माइक्रोन/अच्छी तरह से पाइपिंग करके जेआईएमटी -1 मध्यम (1:100) में 1 घंटे के लिए एनेक्सिन वी-एलेक्सा फ्लोर 647 संयुग्म के साथ स्फेरॉइड को दाग दें।

7. इमेजिंग

नोट: लक्ष्य कोशिकाओं में एनके प्रभावक कोशिकाओं के अलावा के बाद प्लेट को 24 घंटे में imaged किया जाता है। इमेजिंग के लिए, एक उच्च-सामग्री विश्लेषक और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।

  1. प्लेट प्रकार विकल्प का उपयोग करके प्लेटों की सूची से माइक्रोप्लेट के प्रकार का चयन करें। 96 अच्छी तरह से उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) प्लेट का प्रयोग करें.
  2. दो पीक ऑटोफोकस का चयन करें क्योंकि परख क्रमशः ऑटोफोकस और ऑब्जेक्टिव विकल्पों का उपयोग करके 0.3 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ 10x उद्देश्य के साथ प्लेटों में की जाती है। ऑप्ट मोड विकल्प के साथ कॉन्फोकल मोड चुनें और बिनिंग विकल्प का उपयोग करके बिनिंग 2 लागू करें।
  3. इमेजिंग spheroids के लिए, चैनल चयन विकल्प का उपयोग कर उपयुक्त चैनलों का चयन करें. ईजीएफपी-ट्रांसड्यूड जेआईएमटी -1 कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ईजीएफपी (एकीकरण समय 200 एमएस, लेजर पावर 50%, स्टैक ऊंचाई 2.0 माइक्रोन; उदा: 488 एनएम ईएम: 500-550 एनएम) का पता लगाने के लिए, और एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एलेक्सा 647 (एकीकरण समय 100 एमएस, लेजर पावर 50%, स्टैक ऊंचाई 10.0 माइक्रोन; उदा: 640 एनएम ईएम: 650-760 एनएम) का उपयोग करें। स्फेरॉइड के भीतर एनके कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, निम्न चैनल चुनें: DAPI (एकीकरण समय 100 ms, लेजर पावर 50%, ढेर ऊंचाई 2.0 माइक्रोन; उदा: 405 एनएम em: 435-480 एनएम)।
  4. लेआउट चयन विकल्प में, Z ढेर का चयन करें क्योंकि स्फेरॉइड में कोशिकाएं माइक्रोस्कोप के विभिन्न फोकल विमानों पर होती हैं। 10 विमानों (10 माइक्रोन की दूरी के साथ) पूरे गोलाकार आकृति क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त हैं. पहले विमान और अंतिम विमान के मूल्यों को क्रमशः 0 माइक्रोन और 90 माइक्रोन पर सेट करें।
    नोट: माप शुरू करने से पहले, सही सेटिंग्स की जांच करने के लिए नमूना छवियों को स्नैपशॉट फ़ंक्शन के साथ लिया जा सकता है।
  5. लेआउट परिभाषित करें विकल्प का उपयोग करके इमेजिंग के लिए कुओं और फ़ील्ड्स की संख्या सेट करें ।

8. उच्च सामग्री विश्लेषण (एचसीए)

नोट: हार्मनी सॉफ़्टवेयर के साथ छवियों का विश्लेषण करें या पसंदीदा तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण के लिए छवियों का निर्यात करें। एडीसीसी दक्षता के विश्लेषण के लिए, अनुलग्नक वी 647 की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा जाता है। ADCC द्वारा मारे गए लक्ष्य कोशिकाएं स्फेरॉइड के परिधीय क्षेत्र में दिखाई देती हैं। इसलिए, एनेक्सिन वी पॉजिटिव कोशिकाओं को इस गोलाकार "रिंग" में मापा जाता है। इस पद्धति को मान्य करने के लिए, विश्लेषण विभिन्न मापदंडों के साथ किया गया था ताकि यह आकलन किया जा सके कि कौन सा सबसे विश्वसनीय था और सर्वोत्तम परिणाम (पूरक चित्रा एस 2) का उत्पादन कर रहा था। छवि विश्लेषण प्रक्रिया को चरण-दर-चरण प्रदर्शित करने के लिए वीडियो में एक एडीसीसी अच्छी तरह से दिखाया गया है।

  1. बनावट क्षेत्र खोजें विकल्प का उपयोग कर JIMT-1 कोशिकाओं के EGFP प्रतिदीप्ति द्वारा spheroids की पहचान करें और उन्हें आकार (> 25,000 माइक्रोन2) से बाहर फ़िल्टर.
  2. Select Population विकल्प द्वारा बॉर्डर ऑब्जेक्ट्स निकालें।
  3. चूंकि एनेक्सिन वी पॉजिटिव (एपोप्टोटिक) कोशिकाएं स्फेरॉइड की परिधि पर दिखाई देती हैं, इस एपोप्टोटिक 'रिंग' में एनेक्सिन तीव्रता को मापती हैं, जिसे एपोप्टोटिक सेल मौत निर्धारित करने के लिए चयन क्षेत्र विकल्प (बाहरी सीमा -90%) द्वारा चुना जाता है।
  4. एनेक्सिन वी तीव्रता मूल्यों को माध्य तीव्रता के रूप में व्यक्त करें।

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Representative Results

जेआईएमटी -1 कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले ईजीएफपी उत्पन्न हुए थे, और इन कोशिकाओं से स्फेरॉइड उगाए गए थे। सुनीटिनिब का उपयोग एक परीक्षण यौगिक के रूप में किया गया था क्योंकि इसे पहले एडीसीसी17 के पाठ्यक्रम को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। स्फेरॉइड को 72 घंटे के लिए क्लंप करने की अनुमति दी गई थी। 3 दिन, Trastuzumab के 10 μg/mL (या equimolar 6.6 μg/mL TR-F(ab')219) और NK कोशिकाओं (20:1) उपस्थिति या 20 माइक्रोन Sunitinib (1 घंटे पूर्व उपचार) की अनुपस्थिति में spheroids के लिए जोड़ा गया, 24 घंटे के कुल समय के लिए. JIMT-1 अकेले और JIMT-1 NK कोशिकाओं (20:1) के साथ सह-ऊष्मायन CTL के रूप में इस्तेमाल किया गया. स्फेरॉइड को एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए 1 घंटे के लिए एनेक्सिन वी 647 के साथ दाग दिया गया था और फिर एक उच्च-सामग्री विश्लेषक के साथ छवि बनाई गई थी।

जैसा कि एनेक्सिन वी धुंधला होने से संकेत मिलता है, जेआईएमटी -1 कोशिकाओं में ट्रास्टुज़ुमाब के साथ एनके कोशिकाओं के अलावा ट्यूमर स्फेरॉइड में कोशिका मृत्यु का कारण बना। एनेक्सिन पॉजिटिव (एपोप्टोटिक) कोशिकाएं चित्रा 3 ए में दिखाई देने के रूप में स्फेरॉइड के परिधीय क्षेत्र में उभरीं। दूसरी ओर, अकेले एनके कोशिकाओं के अलावा ट्यूमर सेल एपोप्टोसिस का परिणाम नहीं हुआ। ADCC और इसके प्रत्यक्ष जैविक प्रभाव की भर्ती के लिए Trastuzumab की क्षमता के बीच अंतर करने के लिए, TR-F (ab')2 कार्यात्मक FcR बाध्यकारी क्षमता की कमी Trastuzumab के एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. चूंकि टीआर-एफ (एबी') 2 को इस मॉडल (चित्रा 3 बी) में अप्रभावी दिखाया गया था, इसलिए प्रभाव एडीसीसी के माध्यम से मध्यस्थता होने की संभावना है। इसके अलावा, Sunitinib के साथ pretreatment spheroids में अनुलग्नक वी धुंधला कम हो जाना, Sunitinib प्रेरित ADCC प्रतिरोध की पुष्टि और NK कोशिकाओं और Trastuzumab के साथ सह ऊष्मायन JIMT-1 spheroids में एपोप्टोटिक सेल मौत की रोकथाम का खुलासा.

Figure 3
चित्र 3. एक 3 डी अंडाकार मॉडल में एडीसीसी प्रभावक यौगिकों का पता लगाना. ट्यूमर spheroids JIMT-1-EGFP कोशिकाओं के साथ उत्पन्न किए गए थे. 3 दिनों के इनक्यूबेशन समय के बाद, स्फेरॉइड को एचसीएस प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया, जो पहले सेल अटैचमेंट को रोकने के लिए प्लूरोनिक एफ -127 के साथ लेपित था। अगले दिन, 10 μg/mL Trastuzumab (TR) (या इक्विमोलर 6.6 μg/mL TR-F(ab')2 नकारात्मक CTL के रूप में) और NK92। सीडी 16 कोशिकाओं (सेल ट्रैकर ब्लू के साथ पूर्व दाग) अनुपस्थिति या 20 माइक्रोन Sunitinib (सूर्य) की उपस्थिति में, कुओं (20: 1 के ई: टी अनुपात) में जोड़ा गया. अकेले JIMT-1 spheroids और NK कोशिकाओं (20:1) के साथ सह ऊष्मायन JIMT-1 spheroids CTL के रूप में इस्तेमाल किया गया. (ए) 24 घंटे के इनक्यूबेशन समय के बाद, एनेक्सिन वी 647 (लाल रंग) का उपयोग एपोप्टोटिक कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए 1 घंटे के लिए स्फेरॉइड को दागने के लिए किया गया था। (बी)3 spheroids/हालत की छवियों लिया और spheroids (अंगूठी क्षेत्र) के परिधीय क्षेत्र में अनुलग्नक वी 647 की प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए विश्लेषण किया गया. हिस्टोग्राम 4 स्वतंत्र प्रयोगों (साधन±एसईएम) से पता चलता है. डेटा का विश्लेषण क्रुस्कल-वालिस परीक्षण के साथ किया गया था, जिसके बाद डन के पोस्ट-हॉक टेस्ट (* पी < 0.05, # पी < 0.05, एनएस: महत्वपूर्ण नहीं) थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ये डेटा पुष्टि करते हैं कि सुनीटिनिब एडीसीसी को रोकता है। एडीसीसी बढ़ाने वाले यौगिकों को इसी तरह से पहचाने जाने की उम्मीद है। सारांश में, हमारे एचसीएस परख एडीसीसी को प्रभावित करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए उपयुक्त हो सकते हैं।

अनुपूरक चित्र S1. ई: टी अनुपात और Trastuzumab एकाग्रता का अनुकूलन। JIMT-1-EGFP कोशिकाओं spheroids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. 3 दिन, स्फेरॉइड को एचसीएस प्लेट में स्थानांतरित किया गया था और एनके कोशिकाओं को अलग-अलग ई: टी अनुपात (20: 1, 40: 1 और 60: 1) में 10, 20 और 50 माइक्रोग्राम / एमएल ट्रास्टुज़ुमाब (टीआर) के साथ जोड़ा गया था, यह देखने के लिए कि सबसे प्रभावी उपचार जो स्फेरॉइड में कोशिका मृत्यु को प्रेरित कर सकता था। नियंत्रण (JIMT-1-EGFP) JIMT-1 सेल संस्कृति मीडिया के साथ इलाज किया गया था. (ए) 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए एनेक्सिन वी 647 (लाल रंग) के साथ दाग दिया गया था और एचसीए के साथ एपोप्टोटिक सेल मृत्यु को मापा गया था। हिस्टोग्राम 3 स्वतंत्र प्रयोग (साधन±SEM) दिखाते हैं। कॉलम JIMT-647 स्फेरॉइड के आसपास एनेक्सिन V 1 की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) रिंग क्षेत्र के अनुलग्नक वी 647 तीव्रता के लिए 3 स्फेरॉइड/स्थिति की छवियों का विश्लेषण किया गया था। डेटा Tukey के बाद एक तरह से एनोवा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया (* 0.05 < पी, ** पी < 0.01, ns: महत्वपूर्ण नहीं). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र S2. स्फेरॉइड में JIMT-1 सेल एपोप्टोसिस का मूल्यांकन। JIMT-1-EGFP कोशिकाओं spheroids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. 3 दिन, spheroids एक एचसीएस थाली में स्थानांतरित कर रहे थे और 1 घंटे के लिए 20 माइक्रोन Sunitinib (सूर्य) के साथ पूर्व इलाज किया गया, तो NK कोशिकाओं 10 μg/एमएल Trastuzumab के साथ 20:1 ई: टी अनुपात में जोड़ा गया. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए एनेक्सिन वी 647 के साथ दाग दिया गया था और एचसीए के साथ एपोप्टोटिक सेल मौत को मापा गया था। एनेक्सिन वी 647 तीव्रता (नियंत्रण: जेआईएमटी-1-ईजीएफपी, एडीसीसी: 20: 1 एनके कोशिकाओं + 10 माइक्रोग्राम / एमएल ट्रास्टुज़ुमाब, एडीसीसी + सूर्य: 20 माइक्रोन सुनिटिनिब + 20: 1 एनके कोशिकाओं + 10 माइक्रोग्राम / एमएल ट्रास्टुज़ुमाब) के लिए 3 स्फेरॉइड / स्थिति की छवियों का विश्लेषण किया गया था। स्तंभ जेआईएमटी -1 स्फेरॉइड (रिंग) (ए) के आसपास एनेक्स वी 647 की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं, पूरे गोलाकार आकृति (बी) में, और पूरे कुएं (सी) में। हिस्टोग्राम 3 स्वतंत्र प्रयोग (साधन±SEM) दिखाते हैं। टुकी के पोस्ट-हॉक टेस्ट (* पी < 0.05, ** पी < 0.01, एनएस: महत्वपूर्ण नहीं) के बाद एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पिछले कई दशकों में बीसी के इलाज में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूद, रोगियों को अभी भी नियमित रूप से दवा प्रतिरोध विकसित या नकारात्मक पक्ष प्रभाव24. बीसी से जुड़ी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर अंतर्निहित आणविक तंत्र में निरंतर जांच की मांग करती है, जैसे कि चिकित्सीय विकास25 के लिए कार्रवाई योग्य नए अणुओं की पहचान करने के लिए मजबूत स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म। इन रणनीतियों के लिए सेल संस्कृति-आधारित ट्रांसलेशनल परख की आवश्यकता होती है। 3 डी ट्यूमर कल्चर सिस्टम, जैसे कि स्फेरॉइड और ट्यूमर ऑर्गेनोइड हाल ही में कम लागत वाले, आसान-से-लागू मॉडल के रूप में उभरे हैं जो पारंपरिक मोनोलेयर संस्कृतियों की तुलना में ट्यूमर पैथोफिज़ियोलॉजी के प्रमुख पहलुओं का अधिक बारीकी से प्रतिनिधित्व करते हैं। इन विशेषताओं में से एक विभिन्न ट्यूमर से जुड़े प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के बीच स्थानिक रूप से समन्वित बातचीत है। यह 3 डी सह-संस्कृति मॉडल बनाता है दवा स्क्रीनिंग के लिए बेहतर उपकरण दुर्दमताओं के इलाज के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अभिनय करने वाले मॉड्यूलेटर की ओर अग्रसर26.

इस काम में, हमने जेआईएमटी -1 स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के खिलाफ एनके-सेल-मध्यस्थता ट्रास्टुज़ुमैब-निर्भर एडीसीसी के लिए एक उपन्यास गोलाकार मॉडल पेश किया है और एनके सेल-मध्यस्थता कैंसर सेल हत्या के मूल्यांकन के लिए एक स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन किया है। प्रक्रिया को एक उच्च-सामग्री इमेजर और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए लागू किया गया था जो कैंसर सेल एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए एनके कोशिकाओं की रोग-प्रासंगिक क्षमता की निगरानी के लिए अनुमति देता है। 2 डी सेल संस्कृति परख में JIMT-1 कोशिकाओं में Trastuzumab पर निर्भर ADCC के लिए प्रतिरोध उत्प्रेरण एक यौगिक के रूप में बहुलक्षित tyrosine kinase अवरोध करनेवाला Sunitinib पहले पहचाना गया था. सुनीटिनिब एनके कोशिकाओं की हत्या समारोह को बाधित करता है और ऑटोफैगी को प्रेरित करता है, एचईआर 2 अभिव्यक्ति का डाउनरेग्यूलेशन करता है, और जेआईएमटी -1 कोशिकाओं17 के पालन को बढ़ाता है। यौगिक पहचान के लिए हमारी गोलाकार विश्लेषण पाइपलाइन को मान्य करने के लिए, हमने सुनीटिनिब को एक मॉडल यौगिक के रूप में परीक्षण किया और दिखा रहे हैं कि यह एनके कोशिकाओं की क्षमता में काफी बाधा डाल सकता है ताकि कैंसर सेल स्फेरॉइड को मारने के लिए मोनोलेयर में प्रदर्शित प्रभाव को पुन: उत्पन्न किया जा सके।

हमारी विधि सरल है, agarose-लेपित 96 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में spheroids के विकास शामिल, एचसीएस और एचसीए अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त एक गिलास नीचे microplate में गठन spheroids के एक बार हस्तांतरण, परीक्षण यौगिकों के अलावा और अलग से सना हुआ एनके-कोशिकाओं Trastuzumab के प्रशासन द्वारा मारने के लिए सक्रिय, एक एकल कदम सेल मौत धुंधला, और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण. कोई गंभीर जोड़तोड़ दो सेल प्रकार के सह-संवर्धन और दवा उपचार spheroids अखंडता समझौता से बचने के बाद कुओं के लिए लागू कर रहे हैं. परख को प्रदर्शन करने में केवल 4 दिन लगते हैं। प्रक्रिया के हिस्से के रूप में 1% कम पिघलने agarose के साथ 96 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों के नीचे कोटिंग अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों का उपयोग करने के क्रम में JIMT-1 कोशिकाओं को प्लेट की सतह का पालन करने से रोकने के लिए और सहज संगठन को बढ़ावा देने के लिए एक सस्ता विकल्प है spheroids में ट्यूमर कोशिकाओं. छवि पर कब्जा agarose कुशन और यू के आकार का प्लास्टिक की सतह भर में संभव नहीं है के बाद से, spheroids इमेजिंग प्लेट में स्थानांतरित किया जा करने की जरूरत. महत्वपूर्ण जैव-निष्क्रिय सर्फेक्टेंट, स्फेरॉइड हस्तांतरण से पहले प्लूरोनिक-एफ 127 के साथ एचसीएस प्लेट की कांच की सतह का निष्क्रियता था। इस कदम के बिना, spheroids कुओं के तल पर बाहर फैल, इमेजिंग और विश्लेषण मुश्किल बनाने.

एक मानव ट्यूमर सेल लाइन stably EGFP व्यक्त spheroids17 बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मार्कर सेल दाग के बजाय प्रोटोकॉल भर में निरंतर प्रतिदीप्ति प्रदान करता है. ईजीएफपी सिग्नल का असुरक्षित बनावट विश्लेषण स्फेरॉइड्स के कॉम्पैक्ट कर्नेल को पहचानने के लिए आधार प्रदान करता है, जिसमें कोशिका मृत्यु प्रेरण के बिना पूरे अंडाकार आकृति शामिल हैं। जब एनके कोशिकाओं को जोड़ा गया और एडीसीसी को प्रेरित किया गया, तो आकृति के चिह्नित विघटन ने कभी-कभी छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म के लिए अंडाकार की रूपरेखा को चित्रित करने के लिए एक चुनौती पेश की। क्योंकि एनेक्सिन वी पॉजिटिव कोशिकाओं spheroids की परिधि में मुख्य रूप से पाए गए थे, इस समस्या अच्छी तरह से परिभाषित अंडाकार कोर का विस्तार करके सॉफ्टवेयर के निर्मित छवि विभाजन मॉड्यूल द्वारा उत्पन्न एक परिधीय कुंडलाकार क्षेत्र में कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन करके दरकिनार किया गया था. इस क्षेत्र की बाहरी सीमा को परिभाषित करने वाले विस्तार कारक को सैकड़ों गोलाकार छवियों को नेत्रहीन रूप से क्यूरेट करने के बाद सभी मामलों में मरने, कटा हुआ और छितरी हुई कोशिकाओं के पेनम्ब्रा को शामिल करने के लिए चुना गया था। जेड स्टैक छवियों की अधिकतम अनुमानों में apoptotic अंगूठी क्षेत्र के कुल प्रतिदीप्ति का निर्धारण कम प्रयोगात्मक त्रुटियों और या तो पूरे अंडाकार क्षेत्र या पूरे अच्छी तरह से क्षेत्र (पूरक चित्रा S2) को मापने की तुलना में एक अधिक स्पष्ट ADCC प्रभाव उपज उपज है. फ्लोरोसेंट लेबल बीसी कोशिकाओं (ईजीएफपी) को चिह्नित करने और चैनल पृथक्करण की आवश्यकता को दूर करने के लिए सेल मौत (एलेक्सा 647) का पता लगाने के लिए चुना गया था। एक अंत-बिंदु रीडआउट को उजागर फॉस्फेटिडाइलेरिन के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आधार पर चुना गया था, एक एपोप्टोटिक मार्कर, समय के साथ स्फेरॉइड की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए ईजीएफपी प्रतिदीप्ति की कमी की निगरानी के विरोध में, जो एक और विकल्प हो सकता है। एनेक्सिन धुंधला कोशिका मृत्यु की अधिक सटीक और संवेदनशील पहचान के लिए अनुमति दी। सिद्धांत रूप में, यह अतिरिक्त, अधिक सटीक सेल मौत मार्करों है कि सेल मौत के तौर-तरीके (जैसे, फ्लोरोसेंट caspase सब्सट्रेट) और नष्ट सेल प्रकार की पहचान कर सकते हैं के साथ पूरक द्वारा वर्तमान एक आयामी धुंधला दृष्टिकोण में सुधार करने के लिए संभव है.

इस विधि को अन्य प्रभावकारी प्रतिरक्षा सेल प्रकारों (मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, और काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर [सीएआर]-व्यक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं) और उत्प्रेरक अणुओं (जैसे, साइटोकिन्स, इंटरल्यूकिन) का अध्ययन करने के लिए न्यूनतम परिवर्तनों के साथ संशोधित किया जा सकता है। सादगी, मजबूती और कम प्रसंस्करण समय के उद्देश्य से, हमने एचसीए इस परख के लिए पेश की जाने वाली संभावनाओं को समाप्त नहीं किया है। इमेजिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल आगे फ्लोरोसेंट लेबल के अलावा करने के लिए उत्तरदायी हैं. इस परख कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार को जोड़ने और मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके अधिक जटिल spheroids अध्ययन करने के लिए चल रहे सेलुलर घटनाओं 4,5 के लिए उन्हें लिंक करने के लिए उन सेल प्रकार और विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों भेद करने के लिए अनुकूल है. प्रोटोकॉल को किसी भी एचसी इमेजर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और छवियों का विश्लेषण किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है जिसमें बनावट विश्लेषण मॉड्यूल शामिल है।

इस प्रोटोकॉल के महत्व का मुख्य पहलू, स्फेरॉइड का उपयोग है। इसलिए, कई मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए। यह ज्ञात है कि 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं यौगिकों के लिए एक क्षीण प्रतिक्रिया प्रदर्शित जब मोनोलेयर्स21,22 में उगाया कोशिकाओं की तुलना में. 2 डी सेल संस्कृतियों का उपयोग पूरे जीव में एक परीक्षण एजेंट की सांद्रता की प्रभावी सीमा की भविष्यवाणी करने की अनुमति नहीं देता है। हमारे 3D मॉडल को सेट करते समय, हमने 2D में रिपोर्ट किए गए लोगों की तुलना में उच्च यौगिक सांद्रता और E: T अनुपात का परीक्षण किया। उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल को कैंसर स्फेरॉइड के लिए 20:1 तक हमारे 2डी एडीसीसी परख17 में इस्तेमाल किए गए 2:1 से ई: टी अनुपात बढ़ाकर अनुकूलित किया गया था। इसके पीछे तर्क यह हो सकता है कि दवाएं स्फेरॉइड के मूल में प्रभावी ढंग से प्रवेश करने में असमर्थ थीं और मुख्य रूप से बाहरी परतों की कोशिकाओं को प्रभावित करती थीं। दूसरी ओर, Trastuzumab की एकाग्रता में वृद्धि ने ADCC प्रतिक्रिया (पूरक चित्रा S1) को और नहीं बढ़ाया। यह चयन कक्ष रेखाओं और लक्ष्य के बीच भिन्न हो सकता है. इस प्रकार, यह अन्य सेल लाइनों, उदाहरण के लिए, एक गैर HER2 बीसी सेल लाइन पर इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए दिलचस्प होगा, खाते में ले रही है कि HER2 अभिव्यक्ति स्तर ADCC प्रतिक्रिया20 एक महत्वपूर्ण निर्धारक है.

सारांश में, हमारी नई विधि 3 डी प्रतिरक्षा-कैंसर मॉडल में यौगिकों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक तेज़ और मजबूत मंच का प्रतिनिधित्व करती है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग के लिए उपयोग की जाने वाली क्षमता होती है। यह HER2 + ईसा पूर्व spheroids और NK92 का उपयोग करने की प्रासंगिकता पर प्रकाश डाला गया. Trastuzumab के आणविक तंत्र की समझ में और सुधार करने में CD16 कोशिकाएं, इस प्रकार विवो27 में चिकित्सीय क्षमता में Trastuzumab पर निर्भर ADCC की प्रभावशीलता का अनुमान लगाने का अवसर प्रदान करती हैं। नए एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा मॉड्यूलेटर की खोज इस परख से बहुत लाभ उठा सकती है। विधि रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर सेल संस्कृतियों के व्यक्तिगत chemosensitivity परीक्षण के लिए बढ़ाया जा सकता है. हमने दिखाया है कि प्रतिरक्षा कोशिका हत्या और एडीसीसी परीक्षणों में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक 2 डी सह-संस्कृतियों को 3 डी स्फेरॉइड परख में परिवर्तित किया जा सकता है, संभावित रूप से उनकी अनुवाद संबंधी प्रासंगिकता बढ़ रही है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की।

Acknowledgments

LV को राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कार्यालय अनुदान GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 और K147482 से धन प्राप्त हुआ। इस परियोजना को एचयूएन-आरईएन हंगेरियन रिसर्च नेटवर्क से धन प्राप्त हुआ है। CD16.176V.NK-92 कोशिकाओं को ब्रिंक बायोलॉजिक्स, lnc की ओर से डॉ. केरी एस. कैंपबेल (फॉक्स चेस सेंटर, फिलाडेल्फिया, PA) से प्राप्त किया गया था। सैन डिएगो, सीए), दुनिया भर में पेटेंट द्वारा संरक्षित हैं, और नांटकवेस्ट, एलएनसी द्वारा लाइसेंस प्राप्त थे। (www.nantkwest.com)। लेखक NK-92 सेल लाइन और TR-F(ab')2 के उपयोग और तकनीकी सलाह के लिए उनकी मदद के लिए György Vereb और Árpád Szöőr के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates PerkinElmer, Waltham, MA, USA LLC 6055302 for spheroids measurements
96-well tissue culture plates TPP 92096 for cell seeding
α-MEM medium Sigma M8042 in NK medium
Agarose Sigma A9539 for spheroids seeding
Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate Invitrogen-ThermoFisher Scientific A23204 for apoptosis measurement with HCS
CD16.176 V.NK-92 cells Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) ATCC CRL-2407 for cell culture
Cell Tracker Blue Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) C2110 for staining of NK cells
DMEM/F-12 medium Sigma D8437 in JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418 for coating HCS plate before transfering the spheroids
Fetal bovine serum (FBS) Biosera FB-1090/500 JIMT-1-EGFP and NK medium
Glutamine Gibco 35,050–061 in NK medium
GraphPad Prism 8.0.1 GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA for statistical analysis
Harmony software PerkinElmer, Waltham, MA, USA for HCA
IL-2 Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary PHC0026 in NK medium
Insulin (Humulin R) Eli Lilly HI0219 JIMT-1-EGFP medium
JIMT-1 breast cancer cells for cell culture
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) Gibco 11,140–050 in NK medium
Na-pyruvate Lonza BE13-115E in NK medium
Opera Phenix High-Content Analysis equipment PerkinElmer, Waltham, MA, USA HH14001000 for HCA
PBS (Posphate buffered saline) Lonza BE17-517Q for washing the cells
Penicillin-Streptomycin Biosera LM-A4118 JIMT-1-EGFP and NK medium
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP Invitrogen, (Prof. József TEquation 1zsér, University of Debrecen) for JIMT-1-EGFP cell line
Pluronic-F127 Sigma P2443 for coating HCS plate before transfering the spheroids
Sunitinib malate SigmaAldrich PZ0012 for treatments
Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary NDC-63459-303-43 for treatments
Trastuzumab-F(ab')2 Gift from Prof. György Vereb and Árpád SzöEquation 1r  Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen for treatments
Trypan blue 0.4% solution Sigma T8154 for cell counting
Trypsin-EDTA 1X in PBS Biosera LM-T1706 for cells detachment

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 206
एक ट्यूमर गोलाकार मॉडल में एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर Cytotoxicity quantifying : दवा की खोज के लिए आवेदन
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Sturniolo, I., Váróczy, C., Bede, Á. M., Hegedűs, C., Demény, M. Á., Virág, L. Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (206), e65922, doi:10.3791/65922 (2024).

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