Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca²⁺ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Herzrhythmusstörungen sind weit verbreitet und eine der größten Herausforderungen im Gesundheitswesen, da sie Millionen von Menschen weltweit betreffen. Herzrhythmusstörungen sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität assoziiert ^1,2 und stellen die zugrunde liegende Ursache für die Mehrzahl der plötzlichen Herztode^{dar 3}. Heutige Behandlungsoptionen haben das Überleben der Patienten verbessert, sind aber immer noch hauptsächlich symptomatische Behandlungen, anstatt auf die zugrunde liegenden Mechanismen abzuzielen. Daher sind diese Behandlungen nur begrenzt wirksam und können häufig schwere Nebenwirkungen verursachen ^4,5,6. Eine Verbesserung der derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten erfordert Einblicke in die zugrunde liegende Pathophysiologie, was die Notwendigkeit geeigneter Modelle für die Untersuchung schafft. Kleintiermodelle - und insbesondere Mausmodelle - spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung, da sie es ermöglichen, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen, z. B. den genetischen Einfluss auf die zelluläre Elektrophysiologie, die Funktion der Ionenkanäle oder den Umgang mit Kalzium ^7,8.

Zu diesem Zweck werden isolierte atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten in ausreichender Menge und Viabilität benötigt. Ein breites Spektrum unterschiedlicher Isolationsansätze zur Gewinnung von atrialen und ventrikulären Myozyten wurde bereits beschrieben 9,10,11,12,13, und einige Gruppen haben Daten aus gleichzeitigen Messungen von L-Typ-Strom und Kalziumstrom-induzierten Kalziumtransienten entweder aus dem Vorhof 14 oder dem Ventrikel ¹⁵ vorgelegt Kardiomyozyten der Maus. Unseres Wissens nach liegen jedoch keine Daten zu Vorhof- und Ventrikelmessungen eines Tieres vor. Die Forscher konzentrieren sich auf eine breite Palette von Themen, die von Elektrophysiologie über Proteomik, funktionelle Studien wie Zellkontraktilität oder Proteininteraktionen, mitochondriale Funktion bis hin zur Genetik reichen – alle benötigen isolierte Kardiomyozyten. Viele der veröffentlichten Protokolle wurden daher nicht speziell für Patch-Clamp-Studien entwickelt, was zu begrenzten Ausbeuten und unzureichender Zellqualität für Patch-Clamp-Studien führt. Daher können simultane Patch-Clamp- und Calcium-Transientenmessungen von Vorhof- und Ventrikelzellen, die aus einem Tier isoliert wurden, mit etablierten Protokollen nicht durchgeführt werden.

Die Isolierung von murinen – insbesondere atrialen – Myozyten für Patch-Clamp-Experimente ist nach wie vor eine Herausforderung. Dieser Artikel stellt eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion vor, die anschließend die gleichzeitige Messung von Nettomembranstrom und strominduzierten Kalziumtransienten von einem Tier ermöglicht. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit genetischen Mutationen ausgearbeitet. Dieses Protokoll kann sowohl für männliche als auch für weibliche Mäuse verwendet werden. Die Myozytenisolierung, die Bilder und die repräsentativen Ergebnisse, die unten beschrieben werden, wurden von Wildtyp-C57Bl/6-Mäusen im Alter von 6 (± 1) Monaten erhalten. Nichtsdestotrotz wurde dieses Protokoll erfolgreich bei Mäusen im Alter von 2 bis 24 Monaten mit unterschiedlichen Genotypen eingesetzt. Abbildung 1 zeigt den Isolationsaufbau und eine Nahaufnahme eines kanülierten Herzens während der Enzymperfusion.

Alle Tierverfahren wurden vom Niedersächsischen Tierprüfungsamt (LAVES, AZ-18/2900) genehmigt und in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für den Tierschutz durchgeführt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie 1 l 10x Perfusionspuffer (Tabelle 1), 500 ml 1x Perfusionspuffer (Tabelle 2), 50 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 3), 10 ml Stopppuffer (Tabelle 4), 1 l Tyrode-Lösung (Tabelle 5), 10 ml jeder Calcium-Stufenlösung (Tyrode-Lösung mit Glukose und entsprechender Menge an Calcium wie angegeben) vor. 1 l 4-AP-Lösung (Tabelle 5), 100 ml Pipettenlösung (Tabelle 6) und 5 ml Pluronsäure gemäß den bereitgestellten Rezepturen.
   HINWEIS: Badlösungen (Tyrode und 4-AP-Lösung) können (ohne Glukose) im Voraus zubereitet und bei +4 °C gelagert werden, Glukose wird am Versuchstag hinzugefügt. Die Pipettenlösung kann bei -20 °C gelagert werden, der Calciumindikator wird am Versuchstag zugegeben und die Lösung dann bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert. 10x Perfusionspuffer kann bei Raumtemperatur gelagert werden, 1x Perfusionspuffer, Verdauungspuffer und Stopppuffer sollten am Versuchstag frisch zubereitet werden.
2. Schalten Sie das Wasserbad und die Rollenpumpe ein.
3. Langendorff-Apparatur mit Perfusionspuffer vorfüllen; Stellen Sie sicher, dass es luftfrei ist.
4. Bereiten Sie die Aortenkanüle vor, indem Sie sie unter dem Präpariermikroskop fixieren, mit einer 1-ml-Spritze verbinden, die mit Perfusionspuffer gefüllt ist, und reinigen Sie die Kanüle, indem Sie die Kanüle ausspülen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, jegliche Luft im Perfusionssystem zu vermeiden, da dies die koronare Perfusion und damit die Verdauungseffektivität direkt beeinflusst. Bei Bedarf kann dem Setup eine Blasenfalle hinzugefügt werden, um Lufteinschlüsse sicher zu vermeiden.
5. Bereiten Sie Petrischalen mit ausreichend Perfusionspuffer für die Organentnahme und die Mikroskopie vor (Puffer sollte das gesamte Organ sicher bedecken, einige Milliliter – je nach verwendeter Petrischalegröße – sollten ausreichen).
6. Bereiten Sie 3 Petrischalen mit Verdauungspuffer für die Gewebedissoziation und Mikroskopie vor, der Puffer sollte das Organ für die Präparation unter dem Mikroskop in der jeweiligen Petrischale bedecken, die Menge hängt von der verwendeten Petrischalegröße ab. Für die Dissoziation verwenden Sie 3 ml für ventrikuläres Gewebe und 1,5 ml für Vorhofgewebe.

2. Organentnahme

1. Injizieren Sie der Maus 0,1 ml Heparin (1.000 U/ml) i.p. mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27-g-Kanüle und warten Sie 5-10 Minuten.
2. Legen Sie die Maus zusammen mit einem kleinen Gewebe, das mit ca. 500 μl Isofluran getränkt ist, in eine Induktionskammer. Das Tier sollte nicht mit dem Gewebe in Berührung kommen. Um dies zu vermeiden, kann man eine Biopsie-Einbettungskassette aus Kunststoff verwenden, um das Gewebe abzudecken. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, überprüfen Sie den Zehenquetschreflex und sobald er nicht mehr vorhanden ist, schläfern Sie die Maus schnell durch Zervixluxation ein.
3. Legen Sie die Maus auf eine Plattform auf dem Rücken (z. B. auf Styropor, das mit einem Papiertuch bedeckt ist) und fixieren Sie die Pfoten mit Kanülen, um sie an Ort und Stelle zu halten.
4. Entfernen Sie das Fell und die Haut, die die Brust und einen Teil des Bauches bedecken, mit einem deutlichen Schnitt vom Jugulum in Richtung Symphyse und öffnen Sie den Bauch direkt unter dem Xipoid, ohne eine Organstruktur mit einer Schere zu verletzen. Heben Sie das Brustbein mit einer chirurgischen Zange an und schneiden Sie das Zwerchfell mit einer Schere entlang der Rippenkante durch, schneiden Sie dann die Rippen in der medialen Achsellinie ab und entfernen Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
5. Entfernen Sie den Herzbeutel vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette und entfernen Sie das Herz schnell, indem Sie es mit einer stumpfen Pinzette von unten anheben und die großen Gefäße mit einem einzigen Schnitt mit einer Schere durchtrennen.
6. Geben Sie das Herz in einen Perfusionspuffer bei Raumtemperatur und kanülieren Sie die Aorta mit einer stumpfen Endnadel so schnell wie möglich unter dem Mikroskop.
   Anmerkungen: Entfernen Sie jegliches Lungengewebe und Fettgewebe, das mit dem Organ verbunden ist, ohne zu viel Zeit damit zu verlieren. Achten Sie bei der Kanülierung darauf, dass das Ende der Nadel nicht durch die Aortenklappe ragt, da dies die Ergebnisse beeinträchtigt, da Puffer nicht in die Koronararterien gelangen.
7. Binden Sie das Herz mit einem Stück Nahtseide fest an die Nadel und trennen Sie es von der Spritze.
   HINWEIS: Der gesamte Vorgang von der Gewinnung des Herzens (dem Moment, in dem die großen Gefäße durchtrennt werden) bis zum Nähen der Aorta an die Nadel sollte so wenig Zeit wie möglich in Anspruch nehmen. Es wird empfohlen, von der Entfernung des Herzens bis zum Beginn der Perfusion nicht länger als 90-180 s zu dauern.

3. Enzymatische Verdauung

1. Nach der Aortenkanülierung wird das kanülierte Herz sofort an den Langendorff-Apparat angeschlossen, um das Eindringen von Luft in das System zu vermeiden.
   Anmerkungen: Es kann hilfreich sein, einen hängenden Tropfen Perfusionspuffer an der Unterseite der Langendorff-Apparatur sowie einen Tropfen Perfusionspuffer auf der Oberseite der Nadel zu haben, um zu verhindern, dass Luft in das System eindringt.
2. Perfundieren Sie das Herz 1 min lang mit Perfusionspuffer bei einer Temperatur von exakt 37 °C und einer Perfusionsrate von exakt 4 mL/min.
   HINWEIS: Um eine Temperatur von 37 °C an der Spitze der Perfusionsnadel zu erreichen, muss die Wasserbadtemperatur leicht über ca. 40 °C eingestellt werden. Dies sollte regelmäßig durch Messung der Temperatur an der Perfusionsspitze überprüft werden.
3. Perfusion auf Aufschlusspuffer umschalten und für exakt 9 min bei einer Temperatur von exakt 37 °C und einer Perfusionsrate von exakt 4 mL/min perfundieren.
4. Übertragen Sie das verdaute Herz in eine Petrischale mit genügend Verdauungspuffer, um es vollständig bedeckt zu halten. Anschließend werden die Vorhöfe und Herzkammern unter dem Mikroskop sorgfältig präpariert.
5. Übertragen Sie die Vorhöfe in eine Petrischale mit 1,5 ml Verdauungspuffer und die Ventrikel in eine andere Petrischale mit 3 ml Verdauungspuffer.
6. Vorhofdissektion
   1. Ziehen Sie die Vorhöfe vorsichtig, aber ohne Zeitverlust mit einer stumpfen Pinzette in winzige Stücke auseinander.
   2. Lösen Sie das Gewebe auf, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, die zuvor geschnitten wurde, um die Spitzenöffnung zu erweitern, vorsichtig auf und ab pipettieren.
   3. Übertragen Sie die Lösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer (1,5 ml) hinzu, indem Sie vorsichtig an der Seite des Röhrchens nach unten pipettieren, um die Reaktion zu beenden.
   4. Führen Sie alle 3 ml Zell-/Gewebelösungen vorsichtig durch ein 200 μm Nylonnetz, um verbleibende größere Gewebestücke zu entfernen, die nicht vollständig verdaut wurden.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Verdauung hinterlässt fast keine festen Brocken.
7. Ventrikuläre Dissektion
   1. Hacken Sie das Ventrikelgewebe schnell mit einer Sezierschere in winzige Stücke und pipettieren Sie es auf und ab, um es aufzulösen. Verwenden Sie eine weitere 1.000-μl-Pipettenspitze zum Auf- und Abpipettieren, sie kann gekürzt werden, um die Öffnung zu erweitern.
   2. Übertragen Sie die Zell-/Gewebelösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer (3 ml) hinzu, indem Sie vorsichtig an der Seite des Röhrchens nach unten pipettieren, um die Reaktion zu beenden.
   3. Führen Sie alle 6 ml Zell-/Gewebelösung vorsichtig durch ein 200 μm Nylonnetz, um größere Gewebestücke zu entfernen, die noch nicht vollständig verdaut sind.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Verdauung hinterlässt fast keine festen Brocken.
8. Lassen Sie beide Röhrchen (Vorhof- und Ventrikelzellsuspension) 6 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank, damit sie sich absetzen können.
9. Zentrifugieren Sie beide 15-ml-Röhrchen bei 5 x g für 2 min.

4. Wiedereinführung von Kalzium

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind sowohl für Vorhof- als auch für Ventrikelzellen identisch (sofern nicht anders angegeben) und werden bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml kalziumfreier Tyrode-Lösung.
2. Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.
3. Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).
4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 100 μM.
5. Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.
6. Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).
7. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 400 μM.
8. Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.
9. Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).
10. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml (atrial)/5 ml (ventrikulär) Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 1 mM.

5. Beladung von Myozyten mit fluoreszierendem Calcium-Indikator Fluo-3 AM

HINWEIS: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Calciumindikators sollten die folgenden Schritte lichtgeschützt durchgeführt werden (z.B. durch Abdecken der Röhrchen mit Aluminiumfolie).

1. Bereiten Sie die Fluo-3 AM-Stammlösung vor, indem Sie 44 μl 20 % pluronisches F-127 in wasserfreiem DMSO zu 50 μg Fluo-3AM hinzufügen (kann bei -20 °C lichtgeschützt gelagert werden).
2. 10 μl Fluo-3 AM-Stammlösung zu 1 ml Zellsuspension geben und 10 min bei lichtgeschützter Raumtemperatur inkubieren.
3. Bei 5 x g 1 min zentrifugieren.
4. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie das Pellet in einer angemessenen Menge Badlösung, um eine gute Arbeitskonzentration zu erzielen (1-5 ml Badlösung, je nach Zelldichte).
5. 30 Minuten zur Entesterung einwirken lassen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.

6. Simultane Patch-Clamp- und epifluoreszierende^Ca2+-Transientenmessungen wie zuvor beschrieben¹⁶

HINWEIS: Patch-Clamp-Messungen sind nicht das Thema dieses Artikels, der interessierte Leser kann auf wichtige Publikationen verwiesen werden, die diese Methode ausführlich beschreiben 17,18,19,20,21,22. Nichtsdestotrotz wird zum besseren Gesamtverständnis eine Zusammenfassung eines Protokolls zur Messung von L-Typ-Kalziumströmen zusammen mit strominduzierten Kalziumtransienten bereitgestellt.

1. Die Myozyten werden in eine Zellkammer überführt und mit einer Badelösung bei 37 °C überflossen.
2. Blockieren Sie Kaliumströme, indem Sie der Badelösung 4-Aminopyridin und Bariumchlorid hinzufügen, wie in Tabelle 5 angegeben.
3. Stellen Sie sicher, dass Borosilikat-Mikroelektroden einen Spitzenwiderstand von 2-5 MΩ aufweisen, die mit Pipettenlösung gefüllt sind (Tabelle 6).
4. Setup-Messungen, um die gleichzeitige Aufzeichnung von elektrischen Signalen und Epifluoreszenz zu ermöglichen. Der Voltage-Clamp-Modus wird verwendet, um den L-Typ Ca²+-Strom mit einem Protokoll zu messen, das die Zelle bei -80 mV hält, und einem 600 ms Rampenimpuls auf -40 mV, um den schnellen Na⁺-Strom zu inaktivieren, gefolgt von einem 100 ms Testimpuls auf +10 mV bei 0,5 Hz (Abbildung 2).
5. Verwenden Sie Anregung bei 488 nm, emittiertes Licht bei <520 nm, um es zu detektieren und in [Ca²⁺]_I umzuwandeln, unter der Annahme, dass
   
   Dabei ist k_d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz; Fmax = Ca²⁺-gesättigte Fluoreszenz, die am Ende jedes Experiments¹⁹ erhalten wurde.

Die Isolationsausbeute wird nach der Wiedereinführung von Calcium bestimmt, indem 10 μl Zellsuspension auf einen Objektträger pipettiert werden. Mehr als 100 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung von Vorhofzellen und mehr als 1.000 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung ventrikulärer Zellen gelten als ausreichende Ausbeute und werden üblicherweise mit diesem Protokoll gewonnen. Vorhofzellen, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden, zeigten eine Vielzahl verschiedener Zelltypen, die Zellen des kardialen Reizleitungssystems, insbesondere des Sinusknotens, sowie verschiedene Myozyten aus dem rechten und linken Vorhof sowie den Vorhofohren enthielten. Da diese Regionen nicht separat präpariert werden, ergeben sich unterschiedliche Zellmorphologien. Alle Vorhofzellen sind klein, mit Zellkapazitäten von etwa 35 pF bis 100 pF, einige sind fadenförmiger als andere. Abbildung 3 Tafel A zeigt eine typische Zelle aus dem atrialen Arbeitsmyokard, die mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen ist und bereit für Messungen ist, die mit diesem Protokoll gewonnen werden. Ventrikuläre Myozyten sind stäbchenförmiger und größer mit Zellkapazitäten von 100 bis etwa 400 pF, Abbildung 3 Tafel B zeigt eine typische ventrikuläre Zelle aus dem arbeitenden Myokard, die mit kalziumempfindlichem Farbstoff beladen ist und bereit für Messungen ist, die mit diesem Protokoll erhalten wurden. Abbildung 4 zeigt repräsentative Beispiele für L-Typ-Kalziumstrommessungen mit gleichzeitigen zytosolischen Kalziumtransienten aus einem Vorhofmyozyten (Panel B und C) und einem ventrikulären Myozyten (Panel E und F).

Abbildung 1: Langendorff-Apparatur. (A) Foto des Isolationsaufbaus mit Blick auf den kundenspezifischen Wärmetauscher und die ummantelte Herzkammer. (B) Nahaufnahme einer ummantelten Herzkammer mit kanüliertem Herzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Stimulationsprotokoll. Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz) zur Messung des gesamten Netto-Membranstroms (I_M), der hauptsächlich den L-Typ Ca 2+ Strom und den Ca 2+ Strom induzierten Ca ²⁺ Transienten widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Isolierte murine Kardiomyozyten. (A) Ein Beispiel für eine mit Fluo-3 beladene atriale Kardiomyozyten, die für Patch-Clamp-Experimente bereit sind. (B) Ein Beispiel für eine ventrikuläre Kardiomyozyten, die mit Fluo-3 beladen ist und für Patch-Clamp-Experimente bereit ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative Aufzeichnungen. (A) Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz). (B) Gesamter Netto-Membranstrom (I_M), der überwiegend den L-Typ Ca²⁺ Strom in einem murinen Vorhofmyozyten widerspiegelt. (C) L-Typ Ca 2+ Strom ausgelöst Ca²⁺ transient in einem murinen atrialen Myozyten. (D) Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz). (E) Gesamter Netto-Membranstrom (I_M), der überwiegend den L-Typ Ca²⁺ Strom in einem murinen ventrikulären Myozyten widerspiegelt. (F) L-Typ Ca 2+ Strom ausgelöst Ca²⁺ transient in einem murinen ventrikulären Myozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: 10x Perfusionspuffer (1.000 ml).

Tabelle 2: 1x Perfusionspuffer (500 mL).

Tabelle 3: Aufschlusspuffer (50 ml).

Tabelle 4: Stopppuffer (10 ml).

Tabelle 5: Badlösungen.

Tabelle 6: Pipettenlösung.

Tabelle 7: Häufige Probleme und wie sie gelöst werden können.

Dieser Artikel bietet eine einfache und funktionelle Möglichkeit, qualitativ hochwertige atriale und ventrikuläre Myozyten von derselben Maus für Patch-Clamp-Studien mit gleichzeitigen transienten Kalziumableitungen zu erhalten. Die Qualität der gewonnenen Daten hängt stark von der Qualität der Zellisolierung ab. Wie oben erwähnt, wurden bereits viele Verfahren zur Isolierung von murinen Kardiomyozyten beschrieben 9,10,11,12. Die isolierten Zellen werden für verschiedene Analysen verwendet, die von Patch-Clamp-Experimenten bis hin zu Kontraktilitätsstudien, morphologischen Studien, Proteomik, mitochondrialer Funktionsforschung und vielem mehr reichen. Jeder einzelne Zweck erfordert isolierte Zellen, die unterschiedlich optimiert sind. Aus diesem Grund führte keines der Protokolle zu qualitativ hochwertigen Isolierungen, die für Patch-Clamp-Experimente mit gleichzeitiger Messung der Kalziumhandhabungseigenschaften von atrialen und ventrikulären Myozyten aus einer Maus geeignet waren. Um dies zu ändern, führte die Anpassung zahlreicher zuvor beschriebener Protokolle zur Entwicklung dieses Protokolls. Einige Schritte sind mechanisch anspruchsvoll, andere müssen auf eine bestimmte Art und Weise durchgeführt werden und einige sind einfach entscheidend für die Isolationsqualität. Diese Schritte werden im Folgenden erläutert.

Ausbeute und Qualität der Zellisolierung nehmen mit zunehmendem Alter der Tiere ab, möglicherweise aufgrund einer erhöhten Gewebefibrose 11,23,24, was eine individuelle Anpassung der Verdauungszeit und der Enzymmenge erforderlich macht. Je älter ein Tier ist, desto mehr fibrotisches Gewebe ist zu erwarten. Die angegebenen Verdauungszeiten und Enzymmengen sind ein guter Ausgangspunkt für normal große, gesunde Mäuse im Alter von 6 Monaten, müssen aber an die individuellen Bedürfnisse angepasst werden. Es wird empfohlen, mehr Enzyme und längere Verdauungszeiten anzuwenden, wenn ältere Mäuse oder transgene Mäuse verwendet werden, die die Fibrose begünstigen. Wie frühere Arbeiten gezeigt haben, sind eine schnelle und luftfreie Kanülierung sowie eine sofortige Durchblutung des Herzens absolut entscheidend für eine gute Zellqualität¹¹. Es wird empfohlen, nicht länger als 90-180 Sekunden von der Entnahme des Herzens und dem Einlegen in einen Perfusionspuffer bei Raumtemperatur zu benötigen, um mit der Perfusion zu beginnen – je schneller, desto besser. Es ist hilfreich, alle benötigten Geräte in einem Raum aufzustellen, um lange Wege zu vermeiden. Wenn eine weitere Verkürzung des ischämischen Intervalls gewünscht ist, ist es möglich, eine andere Methode der Narkose und anschließenden Euthanasie anzuwenden. Betäuben Sie das Tier wie oben beschrieben vollständig, tragen Sie eine ausreichende Menge Fentanyl (oder ein gleichwertiges Schmerzmittel gemäß Ihren Richtlinien für den Tierschutz) i.p. auf und bringen Sie das Tier auf eine Plattform mit einem Isofluran-Verdampfer und einer für Mäuse geeigneten Anästhesiemaske, die einen konstanten Isofluran- und Sauerstofffluss gewährleistet. Danach gehen Sie wie oben beschrieben vor. Da das Tier einen normalen Kreislauf hat, bis die großen Gefäße mit einem einzigen Schnitt getrennt werden, verkürzt diese Methode die No-Flow-Zeit erheblich und kann so bei Bedarf die Isolationsqualität verbessern.

Nach der Entnahme des Herzens ist es wichtig, die Aortenkanüle in der richtigen Tiefe zu platzieren, um die koronare Perfusion zu gewährleisten. Es ist daher notwendig, die Aorta am Aortenbogen oder an der absteigenden Aorta zu durchtrennen, wenn das Herz entfernt wird, um mindestens 5 mm der Aorta für die Kanülierung zu belassen, so dass die nahtende Seide distal von den Koronararterien, aber vor den ersten Aortenseitenästen, gebunden werden kann.

Während des Isolationsprozesses sind mehrere Zelltransfers erforderlich, und das Pipettieren mit kleinen Pipettenspitzen führt zu einer hohen Scherspannung der Zellen. Mögliche Lösungen zur Reduzierung der Scherspannung sind langsames und vorsichtiges Pipettieren sowie das Kürzen der Pipettenspitzen um einige Millimeter in einem 45°-Winkel, um die Spitzenöffnung zu erweitern. Eine weitere Reduzierung der Scherspannung kann durch Schmelzen der geschnittenen Pipettenspitzen erreicht werden, um die Kanten weicher zu machen. Die Isolationsausbeute der ventrikulären Isolierung ist in der Regel so hoch, dass eine Scherspannungsreduktion nicht zwingend erforderlich ist. Je nach individuellem Ziel kann es sogar sinnvoller sein, ventrikuläre Zellen einer Scherbelastung auszusetzen, um die "fittesten" Zellen auszuwählen. Für die Vorhofisolierung ist dieses Verfahren jedoch entscheidend, da Vorhofzellen nach der Verdauung besonders anfällig sind. Bei der Zugabe von Lösungen wird empfohlen, nicht direkt auf die Zellen zu pipettieren, sondern zu versuchen, langsam an der Röhrchenwand zu pipettieren.

Die Wahl der Kollagenase hat einen erheblichen Einfluss auf die Isolationsergebnisse. Da es nicht nur Unterschiede bei den Enzympräparaten gibt, sondern auch eine relevante Variation der Enzymaktivität von Charge zu Charge, ist eine Titration der Kollagenasemenge und der Verdauungszeit erforderlich, wenn man mit einer neuen Enzymcharge oder einem neuen Mäusestamm arbeitet. Der in den obigen Tabellen angegebene Umfang und die Zeit sind jedoch ein guter Ausgangspunkt für die individuelle Optimierung⁹. Die meisten Unternehmen stellen kleine Enzymproben zur Verfügung, um einzelne Chargen zu testen, was die Chargenauswahl erheblich erleichtert.

Calcium-Transienten mit typischen Amplituden und normalem monophasischem Zerfall können erhalten werden, wenn Zellen ohne die Verwendung von EGTA²⁵ isoliert werden, wie zuvor von Voigt et ^al.9,16 beschrieben. Dieses Protokoll verwendet daher niedrige Kalziumkonzentrationen und vermeidet EGTA während des Isolationsprozesses. Um die Zellen vor dem^{Ca2+-Paradoxon-Phänomen 26} zu schützen, wird Kalzium schrittweise und langsam bis zu einer Endkonzentration von 1 mM wieder zugeführt. Aufgrund höherer intrazellulärer Natriumkonzentrationen sind Kardiomyozyten von Nagetieren besonders anfällig für Kalziumüberladung, und eine langsame und schrittweise Wiedereinführung ist von entscheidender Bedeutung²⁷. Der Bedarf an kalziumfreien Lösungen stellt eine der Haupteinschränkungen aller Langendorff-basierten Kardiomyozyten-Isolierungen von Nagetieren dar. Die Wiedereinführung von Kalzium führt immer zu einem signifikanten Verlust lebensfähiger Zellen. Eine langsame und schrittweise Wiederansiedlung, wie hier beschrieben, führt jedoch zu einem ausreichenden Ertrag bei guter Qualität, um von jedem Tier zuverlässig Messungen zu erhalten.

Es ist wichtig, die Zellausbeute und -qualität direkt nach der Wiedereinführung von Kalzium zu beurteilen. Obwohl die abschließende Auswertung während des Patchens der isolierten Zellen stattfindet, kann man die Zellquantität und -qualität bereits beurteilen, indem man einen Blick unter das Mikroskop wirft, bevor die Zellen mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen werden. Zellen von guter Qualität sind deutlich stäbchenförmig, haben eine homogene Membran und ziehen sich nicht zusammen. Die Kontraktion ist ein Zeichen für eine geringe Zellqualität, da sie auf einen Verlust der Membranintegrität hinweist und durch Überverdauung oder hohe Scherspannung verursacht werden kann. Ein weiteres Anzeichen für eine Überverdauung ist – neben vielen Zellschatten im Verhältnis zu lebensfähigen Zellen – eine übermäßig gut aussehende Membran, die von vielen Oberflächenproteinen befreit wurde und extrem verletzlich ist, wenn man versucht, sich der Zelle mit der Pipettenspitze zur Siegelbildung zu nähern. Beispielhaft gesunde Zellen mit guter Qualität sind in Abbildung 3 dargestellt. (Panel A: Vorhofmyozyten, Panel B: ventrikuläre Myozyten). Isolierungen mit hohen Ausbeuten können dazu führen, dass Zellen immun gegen die Bildung von Siegeln sind und umgekehrt. Letztendlich ist der ultimative Qualitätstest, unabhängig vom Aussehen und der Ausbeute der Zelle, die Antwort auf eine einfache Frage: "Ist es möglich, die gewünschten Messungen mit qualitativ hochwertigen Ergebnissen in den isolierten Zellen jeder Isolierung durchzuführen?". Das oben bereitgestellte Protokoll ermöglicht eine positive Antwort.

Viele Isolationsprotokolle verwenden das Entkopplungsmittel Blebbistatin, um höhere Ausbeuten und eine bessere Qualität der Zellen zu erzielen. Dieses Protokoll verzichtet absichtlich auf Blebbistatin, unter Berücksichtigung der veröffentlichten Beweise für seinen Einfluss auf die kardiale Elektrophysiologie^28,29 in optischen Kartierungsexperimenten. Die Verwendung von Entkopplungsmitteln in elektrophysiologischen Studien ist mit Vorsicht zu genießen und sollte auf Umstände beschränkt werden, in denen eine Entkopplung obligatorisch ist.

Zellen, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden, können nach der Beladung mit Fluo-3 etwa sechs Stunden lang verwendet werden, wobei Vorhofzellen anfälliger für die Zeit sind. Daher wird empfohlen, Vorhofzellen vor ventrikulären Zellen zu untersuchen, wenn derselbe Forscher sie verarbeitet.

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht – wie bei den meisten Langendorff-basierten Isolationsprotokollen – darin, dass es technisch schwierig ist. Es ist klar, dass Mäuseherzen klein sind und alle technischen Aspekte viel Übung erfordern. Dies bedeutet, dass ein erfahrener Forscher bessere Ergebnisse erzielen wird. Einige Protokolle verwenden einen konstanten Druck, um das Herz zu durchbluten. Dies hat den Vorteil, dass durch die Verdauung und den anschließenden Verlust des Gewebewiderstands die Durchblutung beschleunigt wird, was dazu beiträgt, die optimale Verdauungszeit zu bestimmen, dennoch kann die Beschleunigung das Gewebe schädigen und die Zellqualität erheblich verringern. Bei einem Constant-Flow-Ansatz, wie er hier verwendet wird, gibt es keine klaren Richtwerte für die Verdauungszeiten und es kann oft schwierig sein, die Verdauung zu einem optimalen Zeitpunkt zu stoppen, was eine relevante Einschränkung darstellt. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass in diesem Protokoll isolierte Zellen nur auf ihre Eignung für die oben beschriebenen Experimente getestet wurden. Es ist wahrscheinlich, dass diese Zellen auch für verschiedene Analysen verwendet werden können, aber dies muss noch bewiesen werden. Ein erster Schritt in diese Richtung war die Verwendung dieser Zellen zur Visualisierung von Aktionspotentialen, indem sie mit VF2.1CI beladen wurden, einem kürzlich abgeleiteten Spannungsempfindlichkeitsfarbstoff mit einer überlegenen Kinetik gegenüber zuvor verwendeten spannungsempfindlichen Farbstoffen gemäß einem von Seibertz et ^al.30 veröffentlichten Protokoll. Um die Problembehandlung zu erleichtern, werden in Tabelle 7 häufige Isolationsprobleme und deren Behandlung angezeigt.

Zusammenfassend bietet das beschriebene Isolationsprotokoll einen funktionierenden Ansatz zur gleichzeitigen Isolierung von murinen atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten, der es dem Forscher ermöglicht, einen atrialen und ventrikulären elektrophysiologischen Phänotyp einer einzelnen Maus zu erhalten. Dies beseitigt statistische Hindernisse, die sich aus früheren Isolationsprotokollen ergeben, die nur entweder Vorhof- oder Ventrikelzellen in hoher Qualität isolieren, und trägt dazu bei, die Anzahl der für eine bestimmte Studie benötigten Tiere zu reduzieren. Dies kann besonders wichtig sein, wenn Interventionen wie z.B. die Implantation von osmotischen Minipumpen, die mit teuren Mitteln gefüllt sind, Teil der Experimente sind und ein wichtiger Faktor für Tierschutzüberlegungen sein können.