Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca²⁺ et du courant calcique de type L

Les arythmies cardiaques sont courantes et constituent l’un des principaux défis actuels en matière de soins de santé, car elles touchent des millions de personnes dans le monde. Les arythmies sont associées à une morbidité et une mortalité élevées ^1,2 et représentent la cause sous-jacente de la majorité des morts subites cardiaques³. Les options de traitement à jour ont amélioré la survie des patients, mais sont encore principalement des traitements symptomatiques plutôt que de cibler les mécanismes sous-jacents. Ainsi, ces traitements ont une efficacité limitée et peuvent fréquemment causer des effets secondaires graves ^4,5,6. Une amélioration des options de traitement actuelles nécessite un aperçu de la physiopathologie sous-jacente, ce qui crée le besoin de modèles appropriés à étudier. Les modèles de petits animaux - et en particulier les modèles murins - jouent un rôle crucial dans la recherche sur l’arythmie car ils permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse, par exemple l’impact génétique sur l’électrophysiologie cellulaire, la fonction des canaux ioniques ou la manipulation du calcium ^7,8.

À cette fin, des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires isolés en quantité et viabilité suffisantes sont nécessaires. Un large éventail d’approches d’isolement différentes pour obtenir des myocytes auriculaires et ventriculaires a déjà été décrit 9,10,11,12,13 et certains groupes ont présenté des données provenant de mesures simultanées du courant de type L et des transitoires de calcium induits par le courant de calcium à partir d’un courant auriculaire 14 ou ventriculaire ¹⁵ cardiomyocytes murins. Cependant, à notre connaissance, il n’existe aucune donnée disponible sur les mesures auriculaires et ventriculaires d’un animal. Les chercheurs se concentrent sur une grande variété de sujets allant de l’électrophysiologie à la protéomique, en passant par les études fonctionnelles telles que la contractilité cellulaire ou les interactions protéiques, la fonction mitochondriale ou la génétique – toutes nécessitant des cardiomyocytes isolés. De nombreux protocoles publiés n’ont donc pas été spécifiquement développés pour les études de patch clamp, ce qui a conduit à des rendements limités et à une qualité cellulaire insuffisante pour les études de patch clamp. Ainsi, les mesures simultanées de patch clamp et de calcium transitoires de cellules auriculaires et ventriculaires isolées d’un animal ne peuvent pas être effectuées avec des protocoles établis.

L’isolement des myocytes murins – en particulier auriculaires – pour les expériences de patch clamp reste difficile. Cet article fournit une méthode simple et rapide pour l’isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet ensuite des mesures simultanées du courant membranaire net et des transitoires de calcium induits par le courant d’un animal. Cet article élabore un protocole pour l’isolement des myocytes auriculaires et ventriculaires dérivés de souris de type sauvage et de souris porteuses de mutations génétiques. Ce protocole peut être utilisé pour les souris mâles et femelles. L’isolement des myocytes et les images et les résultats représentatifs décrits ci-dessous ont été obtenus à partir de souris sauvages de type C57Bl/6 à l’âge de 6 (± 1) mois. Néanmoins, ce protocole a été utilisé avec succès pour des souris de différents âges allant de 2 à 24 mois avec différents génotypes. La figure 1 montre la configuration de l’isolement et un gros plan d’un cœur canulé pendant la perfusion enzymatique.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Conseil d’examen des animaux de Basse-Saxe (LAVES, AZ-18/2900) et ont été menées conformément à toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être animal.

1. Préarrangements

1. Préparer 1 L de tampon de perfusion 10x (tableau 1), 500 mL de tampon de perfusion 1x (tableau 2), 50 mL de tampon de digestion (tableau 3), 10 mL de tampon stop (tableau 4), 1 L de solution Tyrode (tableau 5), 10 mL de chaque solution calcique (solution Tyrode avec glucose et quantité respective de calcium comme indiqué), 1 L de solution 4-AP (tableau 5), 100 mL de solution pour pipette (tableau 6) et 5 mL d’acide pluronique selon les recettes fournies.
   REMARQUE: Les solutions de bain (Tyrode et solution 4-AP) peuvent être préparées (sans glucose) à l’avance et stockées à +4 ° C, le glucose est ajouté le jour expérimental. La solution pour pipette peut être conservée à -20 °C, l’indicateur de calcium est ajouté le jour de l’expérimentation et la solution est ensuite stockée sur de la glace jusqu’à une utilisation ultérieure. Le tampon de perfusion 10x peut être stocké à température ambiante, le tampon de perfusion 1x, le tampon de digestion et le tampon d’arrêt doivent être fraîchement préparés le jour de l’expérience.
2. Allumez le bain-marie et la pompe à rouleaux.
3. Préremplir l’appareil Langendorff avec un tampon de perfusion; Assurez-vous qu’il est sans air.
4. Préparer la canule aortique en la fixant au microscope à dissection, la connecter avec une seringue de 1 mL remplie de tampon de perfusion et purifier l’air en rinçant la canule.
   REMARQUE: Il est crucial d’éviter tout air à l’intérieur du système de perfusion, car cela affectera directement la perfusion coronaire et donc l’efficacité de la digestion. Un piège à bulles peut être ajouté à la configuration si nécessaire, pour éviter en toute sécurité tout piégeage d’air.
5. Préparez des boîtes de Petri avec suffisamment de tampon de perfusion pour la collecte d’organes et la microscopie (le tampon doit couvrir solidement tout l’organe, quelques millilitres – en fonction de la taille de la boîte de Petri utilisée – devraient suffire).
6. Préparez 3 boîtes de Petri avec un tampon de digestion pour la dissociation des tissus et la microscopie, le tampon doit couvrir l’organe pour la dissection au microscope dans la boîte de Petri respective, la quantité dépend de la taille de la boîte de Petri utilisée. Pour la dissociation, utilisez 3 mL pour le tissu ventriculaire et 1,5 mL pour le tissu auriculaire.

2. Prélèvements d’organes

1. Injectez à la souris 0,1 mL d’héparine (1 000 U/mL) à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une canule de 27 G et attendez 5 à 10 minutes.
2. Placez la souris dans une chambre d’induction avec un petit tissu imbibé d’environ 500 μL d’isoflurane. L’animal ne doit pas être en contact avec le tissu. Pour éviter cela, on peut utiliser une cassette d’incorporation de biopsie plastique pour couvrir le tissu. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, vérifiez le réflexe de pincement des orteils et dès qu’il n’est plus présent, euthanasiez rapidement la souris par luxation cervicale.
3. Placez la souris sur une plate-forme sur le dos (par exemple, sur de la mousse de polystyrène recouverte d’une serviette en papier) et fixez les pattes avec des canules pour la maintenir en place.
4. Enlevez la fourrure et la peau recouvrant la poitrine et une partie de l’abdomen avec une coupe claire du jugulum vers la symphyse et ouvrez l’abdomen juste sous la xiphoïde sans blesser la structure de l’organe à l’aide de ciseaux. Soulevez le sternum avec une pince chirurgicale et coupez le diaphragme avec des ciseaux le long du bord des côtes, puis coupez les côtes en ligne axillaire médiale et retirez la cage thoracique pour exposer le cœur.
5. Retirez soigneusement le péricarde à l’aide d’une pince émoussée et retirez rapidement le cœur en le soulevant avec une pince émoussée par le bas et en coupant les gros vaisseaux d’une seule coupe à l’aide de ciseaux.
6. Placez le cœur dans un tampon de perfusion à température ambiante et canulez l’aorte avec une aiguille émoussée au microscope le plus rapidement possible.
   REMARQUE: Enlevez tout tissu pulmonaire et tissu adipeux attaché à l’organe sans perdre trop de temps dessus. Pendant la canulation, assurez-vous que l’extrémité de l’aiguille ne s’étend pas à travers la valve aortique, car cela nuirait aux résultats en empêchant les tampons de pénétrer dans les artères coronaires.
7. Attachez fermement le cœur avec un morceau de soie suturante à l’aiguille et débranchez-le de la seringue.
   REMARQUE: L’ensemble de la procédure depuis l’obtention du cœur (le moment où les gros vaisseaux sont coupés) jusqu’à la suture de l’aorte à l’aiguille devrait prendre le moins de temps possible. Il est recommandé de ne pas prendre plus de 90-180 s de retrait du cœur jusqu’au début de la perfusion.

3. Digestion enzymatique

1. Après la canulation aortique, connectez immédiatement le cœur canulé à l’appareil de Langendorff en évitant que de l’air ne pénètre dans le système.
   REMARQUE: Il peut être utile d’avoir une goutte suspendue de tampon de perfusion au bas de l’appareil Langendorff ainsi qu’une goutte de tampon de perfusion sur le dessus de l’aiguille afin d’éviter que de l’air ne pénètre dans le système.
2. Perfuser le cœur avec un tampon de perfusion pendant 1 min à une température d’exactement 37 °C et un taux de perfusion d’exactement 4 mL/min.
   NOTE: Pour avoir une température de 37 °C à l’extrémité de l’aiguille de perfusion, la température du bain-marie doit être réglée légèrement au-dessus à environ 40 °C. Cela doit être testé régulièrement en mesurant la température à l’extrémité de perfusion.
3. Basculer la perfusion vers le tampon de digestion et la perfusible pendant exactement 9 minutes à une température d’exactement 37 °C et un taux de perfusion d’exactement 4 mL/min.
4. Transférer le cœur digéré dans une boîte de Petri avec suffisamment de tampon de digestion pour le garder complètement couvert. Ensuite, disséquez soigneusement les oreillettes et les ventricules au microscope.
5. Transférer les oreillettes dans une boîte de Petri avec 1,5 mL de tampon de digestion et les ventricules dans une autre boîte de Petri avec 3 ml de tampon de digestion.
6. Dissection auriculaire
   1. Avec précaution, mais sans perte de temps, séparez les oreillettes en petits morceaux à l’aide de pinces émoussées.
   2. Dissoudre le tissu en pipetant soigneusement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, qui a déjà été coupée pour élargir l’ouverture de l’embout.
   3. Transférer la solution dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter une quantité équivalente de tampon stop (1,5 mL) en pipetant soigneusement sur le côté du tube pour mettre fin à la réaction.
   4. Passez soigneusement les 3 mL de solutions cellulaires ou tissulaires à travers un filet de nylon de 200 μm pour enlever les gros morceaux de tissu restants qui n’ont pas été complètement digérés.
      REMARQUE: Une digestion réussie ne laissera presque pas de morceaux solides.
7. Dissection ventriculaire
   1. Hacher rapidement le tissu ventriculaire en petits morceaux à l’aide de ciseaux à dissection et pipette de haut en bas pour le dissoudre. Utilisez une autre pointe de pipette de 1 000 μL pour pipeter de haut en bas, elle peut être raccourcie pour élargir l’ouverture.
   2. Transférer la solution cellulaire/tissulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter une quantité équivalente de tampon stop (3 mL) en pipetant soigneusement sur le côté du tube pour mettre fin à la réaction.
   3. Passez soigneusement les 6 mL de solution cellulaire ou tissulaire à travers un filet de nylon de 200 μm pour enlever les gros morceaux de tissu qui n’ont pas été complètement digérés.
      REMARQUE: Une digestion réussie ne laissera presque pas de morceaux solides.
8. Laisser reposer les deux tubes (suspension de cellules auriculaires et ventriculaires) sur le banc à température ambiante pendant 6 min pour se déposer.
9. Centrifuger les deux tubes de 15 mL à 5 x g pendant 2 min.

4. Réintroduction du calcium

REMARQUE: Les étapes suivantes sont identiques pour les cellules auriculaires et ventriculaires (sauf indication contraire) et sont effectuées à température ambiante.

1. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et remettre soigneusement en suspension la pastille dans 10 mL de solution de Tyrode sans calcium.
2. Laisser les cellules pendant 8 min pour la sédimentation.
3. Centrifuger à 5 x g pendant 1 min (uniquement les cellules auriculaires, la sédimentation suffit pour les cellules ventriculaires).
4. Jeter le surnageant et remettre soigneusement en suspension la pastille dans 10 mL de solution de Tyrode à concentration de calcium de 100 μM.
5. Laisser les cellules pendant 8 min pour la sédimentation.
6. Centrifuger à 5 x g pendant 1 min (uniquement les cellules auriculaires, la sédimentation suffit pour les cellules ventriculaires).
7. Jeter le surnageant et remettre soigneusement en suspension la pastille dans 10 mL de solution Tyrode à une concentration de calcium de 400 μM.
8. Laisser les cellules pendant 8 min pour la sédimentation.
9. Centrifuger à 5 x g pendant 1 min (uniquement les cellules auriculaires, la sédimentation suffit pour les cellules ventriculaires).
10. Jeter le surnageant et remettre délicatement la pastille en suspension dans 1 mL (auriculaire)/5 mL (ventrable) de solution Tyrode à concentration de calcium de 1 mM.

5. Charge des myocytes avec l’indicateur de calcium fluorescent Fluo-3 AM

REMARQUE : En raison de la sensibilité à la lumière de l’indicateur de calcium fluorescent, les étapes suivantes doivent être exécutées à l’abri de la lumière (p. ex., en recouvrant les tubes avec du papier d’aluminium).

1. Préparer la solution mère de Fluo-3 AM en ajoutant 44 μL de F-127 pluronique à 20 % dans du DMSO anhydre à 50 μg de Fluo-3AM (peut être conservé à -20 °C à l’abri de la lumière).
2. Ajouter 10 μL de solution mère de Fluo-3 AM à 1 mL de suspension cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.
3. Centrifuger à 5 x g pendant 1 min.
4. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et remettre en suspension la pastille dans une quantité raisonnable de solution de bain pour obtenir une bonne concentration de travail (1-5 mL de solution de bain selon la densité cellulaire).
5. Laisser reposer 30 min pour la disestérification avant de commencer les expériences.

6. Mesures simultanées de patch-clamp et d’épifluorescent Ca²⁺-transitoires comme décrit précédemment¹⁶

NOTE: Les mesures de pince patch ne sont pas le sujet de cet article, le lecteur intéressé peut être renvoyé aux principales publications fournissant des descriptions détaillées de cette méthode 17,18,19,20,21,22. Néanmoins, pour une meilleure compréhension globale, un résumé d’un protocole pour mesurer les courants de calcium de type L ainsi que les transitoires de calcium induits par le courant est fourni.

1. Transférer les myocytes dans une chambre cellulaire et superfuser avec une solution de bain à 37 °C.
2. Bloquer les courants de potassium en ajoutant de la 4-aminopyridine et du chlorure de baryum à la solution du bain, comme indiqué dans le tableau 5.
3. S’assurer que les microélectrodes borosilicatées ont une résistance à l’extrémité de 2 à 5 MΩ remplie de solution de pipette (tableau 6).
4. Configurez les mesures pour permettre l’enregistrement simultané des signaux électriques et de l’épifluorescence en même temps. Le mode de serrage de tension est utilisé pour mesurer le courant Ca²+ de type L avec un protocole maintenant la cellule à -80 mV et une impulsion rampe de 600 ms à -40 mV pour inactiver le courant Na⁺ rapide, suivi d’une impulsion d’essai de 100 ms à +10 mV à 0,5 Hz (Figure 2).
5. Utiliser l’excitation à 488 nm, la lumière émise à <520 nm pour détecter et convertir en [Ca²⁺]_I en supposant
   
   Où k_d = constante de dissociation de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescence Fluo-3; F_max = Fluorescence saturée en^Ca2+ obtenue à la fin de chaque expérience¹⁹.

Le rendement d’isolement est déterminé après la réintroduction du calcium en pipetant 10 μL de suspension cellulaire sur une lame de microscope. Plus de 100 cellules viables, en forme de bâtonnet, non contractantes/10 μL pour l’isolement de cellules auriculaires et plus de 1 000 cellules viables, en forme de bâtonnet, non contractantes/10 μL pour l’isolement des cellules ventriculaires sont considérées comme un rendement suffisant et sont couramment obtenues à l’aide de ce protocole. Les cellules auriculaires obtenues avec ce protocole ont montré une variété de différents types de cellules contenant des cellules du système de conduction cardiaque, en particulier le nœud sinusal, ainsi que différents myocytes de l’oreillette droite et gauche ainsi que les appendices auriculaires. Comme ces régions ne sont pas disséquées séparément, il en résulte différentes morphologies cellulaires. Toutes les cellules auriculaires sont petites, avec des capacités cellulaires allant d’environ 35 pF à 100 pF, certaines sont plus filiformes que d’autres. Le panneau A de la figure 3 montre une cellule typique du myocarde auriculaire chargé de colorant sensible au calcium, prêt pour les mesures obtenues avec ce protocole. Les myocytes ventriculaires sont plus en forme de bâtonnets et plus grands avec des capacités cellulaires allant de 100 à environ 400 pF, Figure 3 panneau B montre une cellule ventriculaire typique du myocarde de travail chargée de colorant sensible au calcium, prête pour les mesures obtenues avec ce protocole. La figure 4 montre des exemples représentatifs de mesures de courant calcique de type L avec des transitoires de calcium cytosoliques simultanés d’un myocyte auriculaire (panel B et C) et d’un myocyte ventriculaire (panel E et F).

Figure 1: Appareil de Langendorff. (A) Photographie de la configuration d’isolation avec vue de l’échangeur de chaleur conçu sur mesure et de la cavité cardiaque gainée. (B) Gros plan d’une cavité cardiaque gainée avec cœur canulé en place. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Protocole de stimulation. Protocole de pince de tension (0,5 Hz) utilisé pour mesurer le courant membranaire net total (I_M), reflétant principalement le courant Ca 2+ de type L et le courant Ca 2⁺ induit par Ca²⁺ transitoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Cardiomyocytes murins isolés. (A) Un exemple de cardiomyocyte auriculaire chargé de Fluo-3, prêt pour des expériences de patch-clamp. (B) Un exemple de cardiomyocyte ventriculaire chargé de Fluo-3, prêt pour des expériences de patch-clamp. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Enregistrements représentatifs. (A) Protocole de pince de tension (0,5 Hz). (B) Courant membranaire net total (I_M), reflétant principalement le courant Ca²⁺ de type L dans un myocyte auriculaire murin. (C) Le courant Ca 2⁺ de type L déclenché Ca²⁺ transitoire dans un myocyte auriculaire murin. (D) protocole tension-pince (0,5 Hz). (E) Courant membranaire net total (I_M), reflétant principalement le courant Ca²⁺ de type L dans un myocyte ventriculaire murin. (F) Le courant Ca 2⁺ de type L déclenché Ca²⁺ transitoire dans un myocyte ventriculaire murin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Tampon de perfusion 10x (1 000 mL).

Tableau 2 : 1x tampon de perfusion (500 mL).

Tableau 3 : Tampon de digestion (50 mL).

Tableau 4 : Tampon stop (10 mL).

Tableau 5 : Solutions pour le bain.

Tableau 6 : Solution pour pipette.

Tableau 7 : Problèmes courants et comment les résoudre.

Cet article fournit un moyen simple et fonctionnel d’obtenir des myocytes auriculaires et ventriculaires de haute qualité à partir de la même souris pour des études patch-clamp avec des enregistrements transitoires de calcium simultanés. La qualité des données obtenues dépend fortement de la qualité de l’isolement cellulaire. Comme mentionné ci-dessus, de nombreuses méthodes pour isoler les cardiomyocytes murins ont été décrites précédemment 9,10,11,12. Les cellules isolées sont utilisées pour diverses analyses allant des expériences de pince de patch aux études de contractilité, aux études morphologiques, à la protéomique, à la recherche sur la fonction mitochondriale et bien d’autres. Chaque objectif individuel nécessite des cellules isolées optimisées différemment. Pour cette raison, aucun des protocoles n’a conduit à des isolements de haute qualité adaptés aux expériences de patch-clamp avec mesure simultanée des propriétés de manipulation du calcium des myocytes auriculaires et ventriculaires d’une souris. Pour changer cela, l’adaptation de nombreux protocoles décrits précédemment a abouti au développement de ce protocole. Certaines étapes sont mécaniquement difficiles, d’autres doivent être effectuées d’une manière spécifique et certaines sont simplement cruciales pour la qualité de l’isolation. Ces étapes seront abordées ci-dessous.

Le rendement et la qualité de l’isolement cellulaire diminuent avec l’âge de l’animal, peut-être en raison de l’augmentation de la fibrose tissulaire 11,23,24 rendant nécessaires des ajustements individuels du temps de digestion et de la quantité d’enzymes. Plus un animal est âgé, plus il faut s’attendre à du tissu fibrotique. Les temps de digestion indiqués et les quantités d’enzymes sont un bon point de départ pour les souris saines de taille normale à l’âge de 6 mois, mais devront être adaptés aux besoins individuels. Il est suggéré d’appliquer plus d’enzymes et des temps de digestion plus longs lors de l’utilisation de souris plus âgées ou de souris transgéniques favorisant la fibrose. Comme l’ont souligné des travaux antérieurs, une canulation rapide et sans air ainsi qu’une perfusion immédiate du cœur sont absolument essentielles à une bonne qualité cellulaire¹¹. Il est recommandé de ne pas prendre plus de 90 à 180 secondes entre l’obtention du cœur et sa mise dans un tampon de perfusion à température ambiante pour commencer la perfusion – le plus vite sera le mieux. Il est utile de mettre en place tout l’équipement nécessaire dans une seule pièce pour éviter les longues distances. Si un raccourcissement supplémentaire de l’intervalle ischémique est souhaité, il est possible d’utiliser une autre méthode de narcose et d’euthanasie ultérieure. Anesthésiez complètement l’animal comme décrit ci-dessus, appliquez une quantité suffisante de fentanyl (ou un médicament analgésique équivalent conformément à vos lignes directrices pour le bien-être animal) et déplacez l’animal vers une plate-forme avec un vaporisateur d’isoflurane et un masque d’anesthésie adapté aux souris, fournissant un flux constant d’isoflurane et d’oxygène. Ensuite, procédez comme décrit ci-dessus. Étant donné que l’animal a une circulation normale jusqu’à ce que les gros vaisseaux soient déconnectés avec une seule coupe, cette méthode réduira considérablement le temps de non-écoulement et peut ainsi améliorer la qualité de l’isolement si nécessaire.

Après avoir récolté le cœur, il est essentiel de placer la canule aortique à la bonne profondeur pour assurer la perfusion coronaire. Il est donc nécessaire de couper l’aorte au niveau de l’arc aortique ou au niveau de l’aorte descendante lors du retrait du cœur pour laisser au moins 5 mm de l’aorte pour la canulation permettant d’attacher la soie de suture distale des artères coronaires mais avant les premières branches latérales aortiques.

Pendant le processus d’isolement, plusieurs transferts de cellules sont nécessaires et le pipetage avec de petites pointes de pipette entraînera une contrainte de cisaillement élevée pour les cellules. Les solutions possibles pour réduire les contraintes de cisaillement consistent à pipeter lentement et soigneusement, ainsi qu’à couper les extrémités des pipettes de quelques millimètres dans un angle de 45° pour élargir l’ouverture de la pointe. Une réduction supplémentaire de la contrainte de cisaillement peut être obtenue en faisant fondre les pointes de pipette coupées pour adoucir les bords. Le rendement d’isolement de l’isolement ventriculaire est généralement si élevé que la réduction de la contrainte de cisaillement n’est pas obligatoire. Selon l’objectif individuel, il peut même être plus utile d’exposer les cellules ventriculaires au stress de cisaillement pour sélectionner les cellules « les plus aptes ». Cependant, pour l’isolement auriculaire, cette procédure est essentielle, car les cellules auriculaires sont particulièrement vulnérables après la digestion. Lors de l’ajout de solutions, il est recommandé d’éviter de pipeter directement sur les cellules, mais plutôt d’essayer de pipeter lentement la paroi du tube.

Le choix de la collagénase affectera considérablement les résultats de l’isolement. Étant donné qu’il existe non seulement des différences dans les préparations enzymatiques, mais aussi une variation pertinente de l’activité enzymatique d’un lot à l’autre, le titrage de la quantité de collagénase et du temps de digestion est nécessaire lorsque vous commencez à travailler avec un nouveau lot d’enzymes ou une nouvelle souche de souris. Cependant, la quantité et le temps indiqués dans les tableaux ci-dessus constituent un bon point de départ pour l’optimisation individuelle⁹. La plupart des entreprises fournissent de petits échantillons d’enzymes pour tester des lots individuels, ce qui rend la sélection des lots beaucoup plus pratique.

Des transitoires calciques avec des amplitudes typiques et une désintégration monophasique normale peuvent être obtenus si les cellules sont isolées sans l’utilisation d’EGTA²⁵ comme décrit précédemment par Voigt et ^coll.9,16. Ce protocole utilise donc de faibles concentrations de calcium et évite l’EGTA pendant le processus d’isolement. Pour protéger les cellules du phénomène paradoxal Ca 2^{+ 26}, le calcium est réintroduit progressivement et lentement jusqu’à une concentration finale de 1 mM. En raison de concentrations intracellulaires de sodium plus élevées, les cardiomyocytes de rongeurs sont particulièrement sujets à la surcharge en calcium et une réintroduction lente et progressive est cruciale²⁷. Le besoin de solutions sans calcium représente l’une des principales limites de toutes les isolations de cardiomyocytes de rongeurs à base de Langendorff. La réintroduction du calcium entraîne toujours une perte importante de cellules viables. La réintroduction lente et progressive, telle que décrite ici, conduit néanmoins à un rendement suffisant avec une bonne qualité pour obtenir des mesures fiables de chaque animal.

Il est important d’évaluer le rendement cellulaire et la qualité juste après la réintroduction du calcium. Bien que l’évaluation finale ait lieu lors de l’application des cellules isolées, on peut déjà juger de la quantité et de la qualité des cellules en regardant au microscope avant de charger les cellules avec un colorant sensible au calcium. Les cellules de bonne qualité sont clairement en forme de bâtonnet, ont une membrane homogène et ne se contractent pas. La contraction est un signe de faible qualité cellulaire car elle indique une perte d’intégrité de la membrane et peut être causée par une surdigestion ou l’application d’une contrainte de cisaillement élevée. Un autre signe de surdigestion est – en plus de nombreuses ombres cellulaires par rapport aux cellules viables – une membrane trop belle qui a été débarrassée de nombreuses protéines de surface et qui est extrêmement vulnérable lorsque l’on essaie d’approcher la cellule avec l’embout de la pipette pour la formation du joint. Des exemples de cellules saines et de bonne qualité sont illustrés à la figure 3. (Panel A : myocyte auriculaire, Panel B : myocyte ventriculaire). Les isolements avec des rendements élevés peuvent conduire à des cellules immunisées contre la formation de phoques et vice versa. En fin de compte, le test de qualité ultime, indépendamment de l’apparence et du rendement des cellules, est la réponse à une question simple: « Est-il possible d’effectuer les mesures souhaitées avec des résultats de haute qualité dans les cellules isolées de chaque isolement? ». Le protocole fourni ci-dessus permet une réponse positive.

De nombreux protocoles d’isolement utilisent l’agent de découplage Blebbistatin pour obtenir des rendements plus élevés et des cellules de meilleure qualité. Ce protocole évite délibérément la blébbistatine, en tenant compte des preuves publiées de son influence sur l’électrophysiologie cardiaque^28,29 dans les expériences de cartographie optique. L’utilisation d’agents de découplage dans les études électrophysiologiques doit être traitée avec prudence et doit être limitée aux circonstances où le découplage est obligatoire.

Les cellules obtenues avec ce protocole peuvent être utilisées pendant environ six heures après le chargement avec Fluo-3, les cellules auriculaires étant plus vulnérables au temps. Par conséquent, il est recommandé d’étudier les cellules auriculaires avant les cellules ventriculaires si le même chercheur les traite.

L’une des limites de ce protocole, comme pour la plupart des protocoles d’isolation basés sur Langendorff, est qu’il est techniquement difficile. De toute évidence, les cœurs de souris sont petits et tous les aspects techniques nécessitent beaucoup d’exercice. Cela signifie qu’un chercheur expérimenté obtiendra de meilleurs résultats. Certains protocoles utilisent une pression constante pour perfuser le cœur. Cela a l’avantage qu’en raison de la digestion et de la perte consécutive de résistance tissulaire, la perfusion va s’accélérer, ce qui aide à définir le temps de digestion optimal, néanmoins l’accélération peut endommager le tissu et diminuer la qualité cellulaire de manière significative. Dans une approche à débit constant telle qu’utilisée ici, il n’y a pas de repères clairs pour les temps de digestion et il peut souvent être difficile d’arrêter la digestion à un moment optimal, ce qui marque une limitation pertinente. Une autre limite est que, dans ce protocole, les cellules isolées n’ont été testées que pour déterminer leur adéquation aux expériences décrites ci-dessus. Il est probable que ces cellules puissent également être utilisées pour différentes analyses, mais cela doit encore être prouvé. Un premier pas dans cette direction a été l’utilisation de ces cellules pour visualiser les potentiels d’action en les chargeant avec VF2.1CI, un colorant de sensibilité à la tension récemment dérivé avec une cinétique supérieure aux colorants sensibles à la tension précédemment utilisés selon un protocole publié par Seibertz et ^al.30. Pour faciliter le dépannage, le tableau 7 présente les problèmes d’isolement courants et la façon de les aborder.

Pris ensemble, le protocole d’isolement décrit offre une approche de travail pour l’isolement simultané des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires murins, permettant au chercheur d’obtenir un phénotype électrophysiologique auriculaire et ventriculaire d’une seule souris. Cela élimine les obstacles statistiques posés par les protocoles d’isolement précédents qui n’isolent que les cellules auriculaires ou ventriculaires de haute qualité et contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires pour une étude spécifique. Cela peut être particulièrement important si des interventions telles que l’implantation de minipompes osmotiques remplies d’agents coûteux font partie des expériences et peuvent être un facteur vital pour les considérations de bien-être animal.