Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca²⁺ transitórios e corrente de cálcio tipo L

As arritmias cardíacas são comuns e um dos grandes desafios atuais para a saúde, uma vez que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. As arritmias estão associadas a alta morbidade e mortalidade ^1,2 e representam a causa básica da maioria das mortes súbitas cardíacas³. As opções de tratamento atualizadas melhoraram a sobrevida do paciente, mas ainda são principalmente tratamentos sintomáticos em vez de visar os mecanismos subjacentes. Assim, esses tratamentos têm eficácia limitada e podem frequentemente causar efeitos colaterais graves ^4,5,6. Uma melhoria das opções de tratamento atuais requer informações sobre a fisiopatologia subjacente, criando a necessidade de modelos adequados para estudo. Modelos de pequenos animais - e especificamente modelos de camundongos - desempenham um papel crucial na pesquisa de arritmias, pois permitem estudar mecanismos-chave da arritmogênese, por exemplo, o impacto genético na eletrofisiologia celular, na função dos canais iônicos ou no manuseio do cálcio ^7,8.

Para isso, são necessários cardiomiócitos atriais e ventriculares isolados em quantidade e viabilidade suficientes. Um amplo espectro de diferentes abordagens de isolamento para obtenção de miócitos atriais e ventriculares foi previamente descrito9,10,11,12,13 e alguns grupos apresentaram dados de medidas simultâneas de transientes de cálcio induzidos pela corrente L e pela corrente de cálcio do átrio ¹⁴ ou ventricular15 cardiomiócitos murinos. No entanto, até onde sabemos, não há dados disponíveis de medidas atriais e ventriculares de um animal. Os pesquisadores se concentram em uma ampla variedade de tópicos que vão desde eletrofisiologia até proteômica, estudos funcionais como contratilidade celular ou interações proteicas, função mitocondrial ou genética – todos precisando de cardiomiócitos isolados. Muitos dos protocolos publicados, portanto, não foram desenvolvidos especificamente para estudos de patch clamp, levando a rendimentos limitados e qualidade celular insuficiente para estudos de patch clamp. Assim, medidas simultâneas de patch clamp e transiente de cálcio de células atriais e ventriculares isoladas de um animal não podem ser realizadas com protocolos estabelecidos.

O isolamento de miócitos murinos – especialmente atriais – para experimentos de patch clamp permanece desafiador. Este artigo fornece um método simples e rápido para o isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que subsequentemente permite medições simultâneas de transientes de cálcio induzidos pela corrente líquida e corrente de um animal. Este artigo elabora um protocolo para o isolamento de miócitos atriais e ventriculares derivados de camundongos selvagens e portadores de mutações genéticas. Este protocolo pode ser usado para camundongos machos e fêmeas. O isolamento de miócitos, as imagens e os resultados representativos descritos abaixo foram obtidos de camundongos selvagens C57Bl/6 com idade de 6 (± 1) meses. No entanto, este protocolo tem sido utilizado com sucesso em camundongos em várias idades variando de 2 a 24 meses com diferentes genótipos. A Figura 1 mostra o arranjo de isolamento e o close-up de um coração canulado durante a perfusão enzimática.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Lower Saxony Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) e conduzidos de acordo com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais de bem-estar animal.

1. Pré-arranjos

1. Preparar 1 L de tampão de perfusão 10x (Tabela 1), 500 mL de tampão de perfusão 1x (Tabela 2), 50 mL de tampão de digestão (Tabela 3), 10 mL de tampão de parada (Tabela 4), 1 L de solução de Tyrode (Tabela 5), 10 mL de cada solução de etapa de cálcio (solução de Tyrode com glicose e respectiva quantidade de cálcio, conforme indicado), 1 L de solução de 4-AP (Tabela 5), 100 mL de solução de pipeta (Tabela 6) e 5 mL de ácido plurônico de acordo com as receitas fornecidas.
   NOTA: As soluções de banho (Tyrode e solução 4-AP) podem ser preparadas (sem glicose) com antecedência e armazenadas a +4 °C, a glicose é adicionada no dia do experimento. A solução de pipeta pode ser armazenada a -20 °C, o indicador de cálcio é adicionado no dia experimental e a solução então armazenada em gelo até uso posterior. 10x tampão de perfusão pode ser armazenado à temperatura ambiente, 1x tampão de perfusão, tampão de digestão e tampão de parada devem ser preparados na hora no dia experimental.
2. Ligue o banho-maria e a bomba de roletes.
3. Aparelho de Langendorff pré-preenchido com tampão de perfusão; Certifique-se de que está livre de ar.
4. Preparar a cânula aórtica fixando-a sob o microscópio de dissecção, conectar com uma seringa de 1 mL preenchida com tampão de perfusão e ar puro enxaguando a cânula.
   OBS: É fundamental evitar qualquer ar dentro do sistema de perfusão, pois isso afetará diretamente a perfusão coronariana e, consequentemente, a eficácia da digestão. Uma armadilha de bolhas pode ser adicionada à configuração, se necessário, para evitar com segurança qualquer aprisionamento de ar.
5. Prepare placas de Petri com tampão de perfusão suficiente para coleta de órgãos e microscopia (o tampão deve cobrir com segurança todo o órgão, alguns mililitros – dependendo do tamanho da placa de Petri usada – devem ser suficientes).
6. Preparar 3 placas de Petri com tampão de digestão para dissociação tecidual e microscopia, tampão deve cobrir o órgão para dissecção sob o microscópio dentro da respectiva placa de Petri, quantidade depende do tamanho da placa de Petri utilizada. Para a dissociação utilizar 3 mL para tecido ventricular e 1,5 mL para tecido atrial.

2. Captação de órgãos

1. Injetar 0,1 mL de heparina (1.000 U/mL) i.p. em camundongo usando uma seringa de 1 mL com cânula de 27 G e aguardar 5-10 min.
2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução junto com um pequeno tecido embebido em aproximadamente 500 μL de isoflurano. O animal não deve estar em contato com o tecido. Para evitar isso, pode-se usar um de plástico embutido em biópsia para cobrir o tecido. Uma vez que o animal esteja totalmente anestesiado, verifique se há reflexo de pinça do dedo do pé e, assim que ele não estiver mais presente, eutanasie rapidamente o camundongo por deslocamento cervical.
3. Coloque o mouse em uma plataforma nas costas (por exemplo, em isopor coberto com um papel toalha) e fixe as patas com cânulas para mantê-lo no lugar.
4. Remova o pelo e a pele que cobre o tórax e parte do abdômen com um corte claro da jugúgula em direção à sínfise e abra o abdome logo abaixo do xifoide sem ferir qualquer estrutura do órgão usando uma tesoura. Levante o esterno com pinça cirúrgica e corte o diafragma com tesoura ao longo da borda das costelas, depois corte as costelas na linha axilar medial e remova a caixa torácica para expor o coração.
5. Remova cuidadosamente o pericárdio usando pinça romba e remova rapidamente o coração, levantando-o com pinça romba por baixo e cortando os grandes vasos com um único corte usando tesoura.
6. Coloque o coração em tampão de perfusão à temperatura ambiente e canule a aorta com uma agulha romba sob o microscópio o mais rápido possível.
   NOTA: Remova qualquer tecido pulmonar e tecido adiposo ligado ao órgão sem perder muito tempo nele. Ao canular, certifique-se de que a extremidade da agulha não se estenda através da válvula aórtica, pois isso prejudicará os resultados, impedindo que os tampões entrem nas artérias coronárias.
7. Amarre o coração com um pedaço de seda de sutura firmemente à agulha e desconecte da seringa.
   NOTA: Todo o procedimento desde a obtenção do coração (momento em que os grandes vasos são cortados) até a sutura da aorta à agulha deve levar o menor tempo possível. Recomenda-se não demorar mais do que 90-180 s da remoção do coração até o início da perfusão.

3. Digestão enzimática

1. Após a canulação da aorta, conectar imediatamente o coração canulado ao aparelho de Langendorff, evitando a entrada de ar no sistema.
   NOTA: Pode ajudar a ter uma gota pendurada de tampão de perfusão na parte inferior do aparelho de Langendorff, bem como uma gota de tampão de perfusão na parte superior da agulha, a fim de evitar a entrada de ar no sistema.
2. Perfundir o coração com tampão de perfusão por 1 min a uma temperatura de exatamente 37 °C e uma taxa de perfusão de exatamente 4 mL/min.
   NOTA: Para que a temperatura seja de 37 °C na ponta da agulha de perfusão, a temperatura em banho-maria deve ser ligeiramente superior a aproximadamente 40 °C. Isso deve ser testado regularmente, medindo a temperatura na ponta de perfusão.
3. Alternar a perfusão para o tampão de digestão e perfundir por exatamente 9 min a uma temperatura de exatamente 37 °C e uma taxa de perfusão de exatamente 4 mL/min.
4. Transfira o coração digerido para uma placa de Petri com tampão de digestão suficiente para mantê-lo totalmente coberto. Em seguida, disseque cuidadosamente os átrios e ventrículos sob o microscópio.
5. Transfira os átrios para uma placa de Petri com 1,5 mL de tampão de digestão e os ventrículos para outra placa de Petri com 3 mL de tampão de digestão.
6. Dissecção atrial
   1. Com cuidado, mas sem perda de tempo, afaste os átrios em pequenos pedaços usando pinças rombas.
   2. Dissolva o tecido pipetando cuidadosamente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL, que foi previamente cortada para ampliar a abertura da ponta.
   3. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 ml e adicione uma quantidade equivalente de tampão de paragem (1,5 ml) pipetando cuidadosamente para baixo na lateral do tubo para terminar a reacção.
   4. Passe cuidadosamente todos os 3 mL de soluções celulares/teciduais através de uma malha de nylon de 200 μm para remover pedaços de tecido maiores remanescentes que não foram totalmente digeridos.
      NOTA: Uma digestão bem-sucedida não deixará quase nenhum pedaço sólido.
7. Dissecção ventricular
   1. Pique rapidamente o tecido ventricular em pequenos pedaços usando tesoura de dissecção e pipeta para cima e para baixo para dissolver. Use outra ponta de pipeta de 1.000 μL para pipetar para cima e para baixo, ela pode ser encurtada para ampliar a abertura.
   2. Transfira célula/solução de tecido para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione uma quantidade equivalente de tampão de parada (3 mL) pipetando cuidadosamente para baixo na lateral do tubo para encerrar a reação.
   3. Passe cuidadosamente todos os 6 mL de célula/solução de tecido através de uma malha de nylon de 200 μm para remover pedaços de tecido maiores que não foram totalmente digeridos.
      NOTA: Uma digestão bem-sucedida não deixará quase nenhum pedaço sólido.
8. Deixar ambos os tubos (suspensão de células atriais e ventriculares) no banco à temperatura ambiente por 6 min para assentar.
9. Centrifugar ambos os tubos de 15 mL a 5 x g por 2 min.

4. Reintrodução do cálcio

NOTA: Os passos seguintes são idênticos para as células atriais e ventriculares (salvo indicação em contrário) e são realizados à temperatura ambiente.

1. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta plástica de Pasteur e ressuspender cuidadosamente o pellet em 10 ml de solução de Tyrode sem cálcio.
2. Deixar as células por 8 min para sedimentação.
3. Centrifugar a 5 x g por 1 min (apenas células atriais, a sedimentação é suficiente para as células ventriculares).
4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet em 10 ml de solução de Tyrode com concentração de cálcio de 100 μM.
5. Deixar as células por 8 min para sedimentação.
6. Centrifugar a 5 x g por 1 min (apenas células atriais, a sedimentação é suficiente para as células ventriculares).
7. Eliminar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet em 10 ml de solução de Tyrode com concentração de cálcio de 400 μM.
8. Deixar as células por 8 min para sedimentação.
9. Centrifugar a 5 x g por 1 min (apenas células atriais, a sedimentação é suficiente para as células ventriculares).
10. Eliminar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet em 1 ml (atrial)/ 5 ml (ventricular) de solução de Tyrode com concentração de cálcio a 1 mM.

5. Carga de miócitos com indicador de cálcio fluorescente Fluo-3 AM

NOTA: Devido à sensibilidade à luz do indicador de cálcio fluorescente, as seguintes etapas devem ser executadas protegidas da luz (por exemplo, cobrindo tubos com folha de alumínio).

1. Preparar a solução-mãe de Fluo-3 AM adicionando 44 μL de F-127 plurónico a 20% em DMSO anidro a 50 μg de Fluo-3AM (pode ser armazenado a -20 °C protegido da luz).
2. Adicionar 10 μL de solução-mãe de Fluo-3 AM a 1 ml de suspensão celular e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente protegida da luz.
3. Centrifugar a 5 x g por 1 min.
4. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta plástica de Pasteur e ressuspenda o pellet em uma quantidade razoável de solução de banho para obter uma boa concentração de trabalho (1-5 mL de solução de banho, dependendo da densidade celular).
5. Deixe por 30 min para desesterificação antes de iniciar os experimentos.

6. Medidas simultâneas de patch-clamp e Ca²⁺ transiente epifluorescente, conforme descrito anteriormente¹⁶

OBS: Medidas de patch clamp não são o tema deste artigo, o leitor interessado pode ser encaminhado para as principais publicações que fornecem descrições detalhadas deste método 17,18,19,20,21,22. No entanto, para uma melhor compreensão geral, um resumo sobre um protocolo para medir correntes de cálcio do tipo L juntamente com transientes de cálcio induzidos pela corrente é fornecido.

1. Transferir miócitos para uma câmara celular e superfundir-se com solução de banho a 37 °C.
2. Bloquear as correntes de potássio adicionando 4-aminopiridina e cloreto de bário à solução de banho, conforme indicado na Tabela 5.
3. Certifique-se de que os microeletrodos de borossilicato tenham uma resistência de ponta de 2-5 MΩ preenchidos com solução de pipeta (Tabela 6).
4. Configure medições para permitir a gravação simultânea de sinais elétricos e epifluorescência ao mesmo tempo. O modo de fixação de tensão é usado para medir a corrente Ca²+ tipo L com um protocolo que mantém a célula em -80 mV e um pulso de rampa de 600 ms a -40 mV para inativar a corrente rápida de Na⁺, seguido por um pulso de teste de 100 ms a +10 mV a 0,5 Hz (Figura 2).
5. Use excitação a 488 nm, luz emitida a <520 nm para detectar e converter para [Ca²⁺]_I supondo
   
   Onde k_d = constante de dissociação de fluorescência de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescência de Fluo-3; F_max = fluorescência saturada de Ca²⁺ obtida ao final de cada experimento¹⁹.

O rendimento do isolamento é determinado após a reintrodução de cálcio por pipetagem de 10 μL de suspensão celular em uma lâmina de microscópio. Mais de 100 células viáveis, em forma de bastonete, sem contração/10 μL para isolamento de células atriais, e mais de 1.000 células viáveis, em forma de bastonete, não contraídas/10 μL para isolamento de células ventriculares são consideradas como rendimento suficiente e são comumente obtidas usando este protocolo. As células atriais obtidas com este protocolo mostraram uma variedade de diferentes tipos celulares contendo células do sistema de condução cardíaco, especialmente o nó sinusal, bem como diferentes miócitos do átrio direito e esquerdo, bem como os apêndices atriais. Como essas regiões não são dissecadas separadamente, várias morfologias celulares são o resultado. Todas as células atriais são pequenas, com capacitâncias celulares variando de aproximadamente 35 pF – 100 pF, algumas são mais filiformes que outras. A Figura 3 mostra uma célula típica do miocárdio atrial em funcionamento carregada de corante sensível ao cálcio, pronta para as medidas obtidas com este protocolo. Os miócitos ventriculares são mais bastonetes e maiores, com capacitâncias celulares variando de 100 a cerca de 400 pF, Figura 3 painel B mostra uma célula ventricular típica do miocárdio em funcionamento carregada com corante sensível ao cálcio, pronta para as medidas obtidas com este protocolo. A Figura 4 mostra exemplos representativos de medidas da corrente de cálcio tipo L com transientes citosólicos simultâneos de cálcio de um miócito atrial (painéis B e C) e um miócito ventricular (painéis E e F).

Figura 1: Aparelho de Langendorff. (A) Fotografia da configuração do isolamento com vista ao trocador de calor personalizado e à câmara cardíaca encamisada. (B) Close-up da câmara cardíaca encamisada com o coração canulado no lugar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Protocolo de estimulação. Protocolo de clamp de voltagem (0,5 Hz) usado para medir a corrente líquida total da membrana (I_M), refletindo predominantemente a corrente Ca 2+ tipo L e a corrente Ca 2+ induzida Ca ²⁺ transitória. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Cardiomiócitos murinos isolados. (A) Um exemplo de cardiomiócito atrial carregado com Fluo-3, pronto para experimentos de patch-clamp. (B) Um exemplo de cardiomiócito ventricular carregado com Fluo-3, pronto para experimentos de patch-clamp. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Gravações representativas. (A) Protocolo de clamp de tensão (0,5 Hz). (B) Corrente líquida total da membrana (I_M), refletindo predominantemente a corrente Ca²⁺ do tipo L em miócito atrial murino. (C) A corrente Ca 2+ tipo L desencadeou Ca²⁺ transitória em miócito atrial murino. (D) protocolo de clampe de tensão (0,5 Hz). (E) Corrente líquida total da membrana (I_M), refletindo predominantemente a corrente Ca²⁺ do tipo L em um miócito ventricular murino. (F) A corrente Ca 2+ tipo L desencadeou Ca²⁺ transitória em miócito ventricular murino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tampão de perfusão 10x (1.000 mL).

Tabela 2: 1x tampão de perfusão (500 mL).

Tabela 3: Tampão de digestão (50 mL).

Tabela 4: Tampão de parada (10 mL).

Tabela 5: Soluções para banho.

Tabela 6: Solução da pipeta.

Tabela 7: Problemas comuns e como resolvê-los.

Este artigo fornece uma maneira fácil e funcional de obter miócitos atriais e ventriculares de alta qualidade do mesmo camundongo para estudos de patch-clamp com registros simultâneos de transientes de cálcio. A qualidade dos dados obtidos depende muito da qualidade do isolamento celular. Como mencionado acima, vários métodos para isolar cardiomiócitos murinos foram descritos previamente9,10,11,12. As células isoladas são usadas para várias análises que vão desde experimentos de patch clamp até estudos de contratilidade, estudos morfológicos, proteômica, pesquisa da função mitocondrial e muito mais. Cada finalidade individual requer células isoladas otimizadas de forma diferente. Devido a isso, nenhum dos protocolos levou a isolamentos de alta qualidade adequados para experimentos de patch-clamp com medição simultânea das propriedades de manipulação de cálcio de miócitos atriais e ventriculares de um camundongo. Para mudar isso, a adaptação de vários protocolos descritos anteriormente resultou no desenvolvimento desse protocolo. Algumas etapas são mecanicamente desafiadoras, algumas devem ser feitas de forma específica e outras são simplesmente cruciais para a qualidade do isolamento. Essas etapas serão discutidas abaixo.

O rendimento e a qualidade do isolamento celular diminuem com a idade dos animais, possivelmente devido ao aumento da fibrose tecidual ^11,23,24, sendo necessários ajustes individuais do tempo de digestão e da quantidade de enzimas. Quanto mais velho um animal, mais tecido fibrótico é esperado. Os tempos de digestão e as quantidades de enzimas indicados são um bom ponto de partida para ratos saudáveis de tamanho normal aos 6 meses de idade, mas precisarão de adaptação às necessidades individuais. Sugere-se aplicar mais enzimas e tempos de digestão mais longos ao usar camundongos mais velhos ou camundongos transgênicos favorecendo a fibrose. Como enfatizado em trabalhos anteriores, a canulação rápida e livre de ar, bem como a perfusão imediata do coração, são absolutamente fundamentais para a boa qualidade^celular11. Recomenda-se não levar mais de 90-180 segundos para obter o coração e colocá-lo em tampão de perfusão à temperatura ambiente para iniciar a perfusão – quanto mais rápido, melhor. É útil configurar todos os equipamentos necessários em uma sala para evitar longas distâncias. Se o encurtamento adicional do intervalo isquêmico for desejado, é possível usar outro método de narcose e posterior eutanásia. Anestesie totalmente o animal conforme descrito acima, aplique uma quantidade suficiente de fentanil (ou um medicamento analgésico equivalente de acordo com suas diretrizes para o bem-estar animal) i.p. e mova o animal para uma plataforma com um vaporizador de isoflurano e uma máscara de anestesia adequada para camundongos, fornecendo fluxo constante de isoflurano e oxigênio. Depois, proceda como descrito acima. Uma vez que o animal tem uma circulação normal até que os grandes vasos sejam desconectados com um único corte, este método reduzirá significativamente o tempo sem fluxo e pode, assim, melhorar a qualidade do isolamento, se necessário.

Após a retirada do coração, é fundamental colocar a cânula aórtica na profundidade certa para garantir a perfusão coronariana. É, portanto, necessário cortar a aorta no arco aórtico ou na aorta descendente ao retirar o coração para deixar pelo menos 5 mm da aorta para canulação permitindo amarrar a seda de sutura distal das artérias coronárias, mas antes dos primeiros ramos laterais da aorta.

Durante o processo de isolamento, múltiplas transferências de células são necessárias e a pipetagem com pequenas pontas de pipeta causará alta tensão de cisalhamento nas células. As possíveis soluções para reduzir a tensão de cisalhamento são pipetar lenta e cuidadosamente, bem como cortar as pontas da pipeta em alguns milímetros em um ângulo de 45° para ampliar a abertura da ponta. Uma maior redução da tensão de cisalhamento pode ser alcançada derretendo as pontas da pipeta cortada para suavizar as bordas. O rendimento isolatório do isolamento ventricular geralmente é tão alto que a redução da tensão de cisalhamento não é obrigatória. Dependendo do objetivo individual de cada um, pode até ser mais útil expor as células ventriculares ao estresse de cisalhamento para selecionar as células "mais aptas". No entanto, para o isolamento atrial este procedimento é crítico, uma vez que as células atriais são particularmente vulneráveis após a digestão. Sempre que adicionar soluções, recomenda-se evitar pipetar diretamente nas células, mas sim tentar pipetar lentamente na parede do tubo.

A escolha da colagenase afetará significativamente os resultados do isolamento. Uma vez que não existem apenas diferenças nas preparações enzimáticas, mas também uma variação relevante lote a lote na atividade enzimática, a titulação da quantidade de colagenase e o tempo de digestão são necessários quando se começa a trabalhar com um novo lote de enzima ou uma nova estirpe de ratinhos. No entanto, a quantidade e o tempo indicados nas tabelas acima marcam um bom ponto de partida para a otimização individual⁹. A maioria das empresas fornece pequenas amostras de enzimas para testar lotes individuais, o que torna a seleção de lotes muito mais conveniente.

Transientes de cálcio com amplitudes típicas e decaimento monofásico normal podem ser obtidos se as células forem isoladas sem o uso de EGTA²⁵, como descrito anteriormente por Voigt et ^al.9,16. Este protocolo, portanto, utiliza baixas concentrações de cálcio e evita EGTA durante o processo de isolamento. Para proteger as células do fenômeno do paradoxo Ca 2^{+ 26}, o cálcio é reintroduzido gradual e lentamente até uma concentração final de 1 mM. Devido às maiores concentrações intracelulares de sódio, os cardiomiócitos de roedores são especialmente propensos à sobrecarga de cálcio, sendo crucial a reintrodução lenta e gradual²⁷. A necessidade de soluções isentas de cálcio representa uma das principais limitações de todos os isolamentos de cardiomiócitos de roedores baseados em Langendorff. A reintrodução de cálcio sempre leva a uma perda significativa de células viáveis. A reintrodução lenta e gradual, como descrito aqui, no entanto, leva a um rendimento suficiente com boa qualidade para obter medições de cada animal de forma confiável.

É importante avaliar o rendimento e a qualidade celular logo após a reintrodução do cálcio. Embora a avaliação final ocorra durante a correção das células isoladas, já se pode julgar a quantidade e a qualidade celular ao examinar o microscópio antes de carregar as células com corante sensível ao cálcio. As células de boa qualidade são claramente em forma de bastonete, têm uma membrana homogênea e não se contraem. A contração é um sinal de baixa qualidade celular, pois indica uma perda da integridade da membrana e pode ser causada por superdigestão ou aplicação de alto estresse de cisalhamento. Outro sinal de superdigestão é – além de muitas sombras celulares em relação às células viáveis – uma membrana excessivamente bonita que foi limpa de muitas proteínas de superfície e é extremamente vulnerável quando se tenta se aproximar da célula com a ponta da pipeta para a formação de selos. Células exemplares saudáveis e de boa qualidade são mostradas na Figura 3. (Painel A: miócito atrial, Painel B: miócito ventricular). Isolamentos com altos rendimentos podem levar a células imunes à formação de selos e vice-versa. No final, o teste de qualidade final, independentemente da aparência e do rendimento das células, é a resposta a uma pergunta simples: "É possível realizar as medições desejadas com resultados de alta qualidade nas células isoladas de cada isolamento?". O protocolo fornecido acima possibilita uma resposta positiva.

Muitos protocolos de isolamento utilizam o agente desacoplador Blebbistatina para obter maiores rendimentos e células de melhor qualidade. Esse protocolo evita propositalmente a blebbistatina, levando em consideração as evidências publicadas de sua influência na eletrofisiologia cardíaca^28,29 em experimentos de mapeamento óptico. O uso de agentes de desacoplamento em estudos eletrofisiológicos deve ser tratado com cautela e deve ser limitado a circunstâncias em que o desacoplamento é obrigatório.

As células obtidas com este protocolo podem ser utilizadas por aproximadamente seis horas após o carregamento com Fluo-3, sendo as células atriais mais vulneráveis ao tempo. Consequentemente, recomenda-se estudar as células atriais antes das células ventriculares se o mesmo pesquisador processá-las.

Uma limitação desse protocolo – como acontece com a maioria dos protocolos de isolamento baseados em Langendorff – é que ele é tecnicamente difícil. Claramente, os corações de camundongos são pequenos e todos os aspectos técnicos exigem muito exercício. Isso significa que um pesquisador experiente obterá melhores resultados. Alguns protocolos usam uma pressão constante para perfundir o coração. Isso tem a vantagem de que, devido à digestão e perda consecutiva de resistência tecidual, a perfusão irá acelerar, e isso ajuda a definir o tempo ideal de digestão, no entanto, a aceleração pode prejudicar o tecido e diminuir significativamente a qualidade celular. Em uma abordagem de fluxo constante como a usada aqui, não há referências claras para os tempos de digestão e muitas vezes pode ser difícil parar a digestão em um momento ideal, o que marca uma limitação relevante. Outra limitação é que neste protocolo as células isoladas foram testadas apenas quanto à adequação aos experimentos descritos acima. É provável que essas células também possam ser usadas para diferentes análises, mas isso ainda precisa ser comprovado. Um primeiro passo nessa direção foi o uso dessas células para visualizar potenciais de ação, carregando-os com VF2.1CI, um corante de sensibilidade de voltagem recentemente derivado com cinética superior aos corantes sensíveis à voltagem usados anteriormente, de acordo com um protocolo publicado por Seibertz et ^al.30. Para ajudar na solução de problemas, a Tabela 7 mostra problemas comuns de isolamento e como abordá-los.

Em conjunto, o protocolo de isolamento descrito oferece uma abordagem funcional para o isolamento simultâneo de cardiomiócitos murinos atriais e ventriculares, permitindo ao pesquisador obter um fenótipo eletrofisiológico atriais e ventriculares de um único camundongo. Isso elimina obstáculos estatísticos colocados por protocolos de isolamento anteriores apenas isolando células atriais ou ventriculares de alta qualidade e ajuda a reduzir o número de animais necessários para um estudo específico. Isso pode ser especialmente importante se intervenções como, por exemplo, a implantação de minibombas osmóticas cheias de agentes caros fizerem parte dos experimentos e puderem ser um fator vital em considerações de bem-estar animal.