^Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

心不整脈は一般的であり、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるため、現在の主要な医療課題の1つです。不整脈は高い罹患率と死亡率^1,2に関連しており、心臓突然死の大部分の根本的な原因を表しています³。最新の治療選択肢は患者の生存率を向上させましたが、根本的なメカニズムを標的とするのではなく、依然として主に対症療法です。したがって、これらの治療法の有効性は限られており、重篤な副作用を引き起こすことがよくあります^4,5,6。現在の治療オプションを改善するには、根底にある病態生理学への洞察が必要であり、研究に適したモデルの必要性が生じます。小動物モデル、特にマウスモデルは、細胞の電気生理学、イオンチャネル機能、カルシウム処理に対する遺伝的影響など、不整脈形成の重要なメカニズムを研究できるため、不整脈研究において重要な役割を果たします^7,8。

この目的のために、十分な量および生存率の単離された心房および心室心筋細胞が必要とされる。心房および心室筋細胞を得るための幅広い異なる単離アプローチが以前に説明されており⁹、10、^11、12、13であり^、一部のグループは、心房14または心室¹⁵のいずれかからのL型電流およびカルシウム電流誘発カルシウム過渡の同時測定からのデータを提示している。マウス心筋細胞。しかし、私たちの知る限り、1匹の動物からの心房および心室測定のデータはありません。研究者は、電気生理学からプロテオミクス、細胞収縮性やタンパク質相互作用などの機能研究、ミトコンドリア機能、遺伝学に至るまで、単離された心筋細胞を必要とする幅広いトピックに焦点を当てています。したがって、公開されているプロトコルの多くはパッチクランプ研究用に特別に開発されておらず、パッチクランプ研究には収量が制限され、細胞品質が不十分です。したがって、1匹の動物から単離された心房細胞と心室細胞のパッチクランプとカルシウム過渡の同時測定は、確立されたプロトコルでは実行できません。

パッチクランプ実験のためのマウス、特に心房筋細胞の単離は依然として困難です。本稿では、逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流法により、高品質のマウス心房および心室筋細胞を単離するための簡単で迅速な方法を提供し、その後、1匹の動物からの正味の膜電流と電流誘発カルシウム過渡現象の両方を同時に測定することができます。この記事では、野生型マウスおよび遺伝子変異を有するマウスに由来する心房および心室筋細胞を単離するためのプロトコルについて詳述する。このプロトコルは、オスとメスのマウスに同様に使用できます。筋細胞単離、画像、および以下に説明する代表的な結果は、6(±1)ヶ月齢の野生型C57Bl/6マウスから得られた。それにもかかわらず、このプロトコルは、異なる遺伝子型を有する2〜24ヶ月の範囲の様々な年齢のマウスに首尾よく使用されている。 図1 は、分離セットアップと酵素灌流中のカニューレ心臓のクローズアップを示しています。

すべての動物の手順は、ニーダーザクセン州動物審査委員会(LAVES、AZ-18 / 2900)によって承認され、動物福祉に関するすべての制度的、国内的、および国際的なガイドラインに従って実施されました。

1. 事前手配

1. 1 Lの10x灌流バッファー(表1)、500 mLの1x灌流バッファー(表2)、50 mLの消化バッファー(表3)、10 mLのストップバッファー(表4)、1 Lのタイロード溶液(表5)、10 mLの各カルシウムステップ溶液(示されているようにグルコースおよびそれぞれの量のカルシウムを含むタイロード溶液)を準備します。 提供されたレシピに従って、1 Lの4-AP溶液(表5)、100 mLのピペット溶液(表6)および5 mLのプルロン酸。
   注:浴溶液(タイロードおよび4-AP溶液)は、事前に調製し(グルコースなし)、+ 4°Cで保存することができ、グルコースは実験日に添加される。ピペット溶液は-20°Cで保存でき、実験日にカルシウム指示薬を添加し、溶液をさらに使用するまで氷上で保存します。10x灌流バッファーは室温で保存でき、1x灌流バッファー、消化バッファー、および停止バッファーは実験日に新たに調製する必要があります。
2. ウォーターバスとローラーポンプをオンにします。
3. ランゲンドルフ装置に灌流バッファーをプレフィルします。空気がないことを確認してください。
4. 大動脈カニューレを解剖顕微鏡で固定して調製し、灌流バッファーときれいな空気で満たされた1 mLシリンジでカニューレをすすぎます。
   注:灌流システム内の空気は冠状動脈灌流に直接影響し、消化効果に影響を与えるため、避けることが重要です。エアトラップを安全に回避するために、必要に応じてバブルトラップをセットアップに追加できます。
5. 臓器採取と顕微鏡検査に十分な灌流バッファーを使用してペトリ皿を準備します(バッファーは臓器全体をしっかりと覆う必要があり、使用するペトリ皿のサイズに応じて数ミリリットルで十分です)。
6. 組織解離および顕微鏡検査のための消化バッファーで3つのペトリ皿を準備し、緩衝液はそれぞれのペトリ皿内の顕微鏡下で解剖のために器官を覆うべきであり、量は使用されるペトリ皿のサイズに依存する。解離には、心室組織に3 mL、心房組織に1.5 mLを使用します。

2.臓器摘出

1. 27 Gカニューレを備えた1 mLシリンジを使用して、0.1 mLのヘパリン(1,000 U / mL)をマウスに注射し、5〜10分待ちます。
2. マウスを、約500 μLのイソフルランに浸した小さな組織と一緒に誘導チャンバーに入れます。動物は組織と接触してはいけません。それを避けるために、プラスチック製の生検埋め込みカセットを使用して組織を覆うことができます。動物が完全に麻酔されたら、つま先のつまみ反射をチェックし、存在しなくなったらすぐに、頸部脱臼によってマウスをすぐに安楽死させます。
3. マウスを背中のプラットフォーム(ペーパータオルで覆われた発泡スチロールなど)に置き、カニューレで足を固定して所定の位置に保持します。
4. 胸部と腹部の一部を覆っている毛皮と皮膚をジュグルムから結合に向かってはっきりと切り込み、ハサミを使用して臓器構造を傷つけることなく剣状突起の真下腹部を開きます。外科用鉗子で胸骨を持ち上げ、肋骨の端に沿ってハサミで横隔膜を切断し、次に腋窩の内側線で肋骨を切断し、胸郭を取り外して心臓を露出させます。
5. 鈍い鉗子を使用して心膜を慎重に取り外し、下から鈍い鉗子で持ち上げ、ハサミを使用して1回の切断で大きな血管を切断することにより、心臓をすばやく取り除きます。
6. 心臓を室温灌流バッファーに入れ、顕微鏡下で鈍い端の針で大動脈をできるだけ早くカニューレ挿入します。
   注意: 臓器に付着している肺組織や脂肪組織を、時間をあまり失うことなく取り除きます。カニューレ挿入中は、緩衝液が冠状動脈に入るのを防ぐことによって結果を損なうため、針の端が大動脈弁を通って伸びないようにしてください。
7. 縫合シルクで心臓を針にしっかりと結び、注射器から外します。
   注:心臓の取得(大きな血管が切断された瞬間)から大動脈を針に縫合するまでの全手順は、できるだけ短い時間で済みます。心臓の除去から灌流の開始まで90〜180秒以上かからないことをお勧めします。

3.酵素消化

1. 大動脈カニューレ挿入後、すぐにカニューレをランゲンドルフ装置に接続し、システムに空気が入らないようにします。
   注:ランゲンドルフ装置の下部に灌流バッファーのドロップをぶら下げ、システムに空気が入らないようにするために、針の上部に灌流バッファーのドロップを置くと役立ちます。
2. 心臓に灌流バッファーを1分間、温度37°C、灌流速度4 mL/minで灌流します。
   注:灌流針の先端の温度を37°Cにするには、ウォーターバスの温度を約40°Cよりわずかに高く設定する必要があります。 これは、灌流先端の温度を測定することによって定期的にテストする必要があります。
3. 灌流を消化バッファーに切り替え、正確に37°Cの温度と正確に4mL/minの灌流速度で正確に9分間灌流します。
4. 消化された心臓を完全に覆うのに十分な消化バッファーを備えたペトリ皿に移します。次に、顕微鏡で心房と心室を慎重に解剖します。
5. 心房を1.5 mLの消化バッファーを含むペトリ皿に移し、心室を3 mLの消化バッファーを含む別のペトリ皿に移します。
6. 心房郭清
   1. 慎重に、しかし時間を失うことなく、鈍い鉗子を使用して心房を小さな断片に引き離します。
   2. チップの開口部を広げるために以前に切断された1,000 μLのピペットチップを使用して慎重に上下にピペッティングして、組織を溶解します。
   3. 溶液を15 mLの遠沈管に移し、チューブの側面を注意深くピペッティングして等量のストップバッファー(1.5 mL)を加えて反応を終了します。
   4. 3 mLの細胞/組織溶液すべてを200 μmのナイロンメッシュに注意深く通し、完全に消化されていない残りの大きな組織片を取り除きます。
      注:消化が成功すると、固体の塊はほとんど残りません。
7. 心室解離
   1. 解剖ハサミとピペットを上下に使用して、心室組織をすばやく細かく切り刻んで溶解します。上下にピペッティングするために別の1,000μLピペットチップを使用し、開口部を広げるために短くしてもよい。
   2. 細胞/組織溶液を15 mLの遠沈管に移し、チューブの側面で慎重にピペッティングして等量のストップバッファー(3 mL)を加えて反応を終了します。
   3. 6 mLの細胞/組織溶液すべてを200 μmのナイロンメッシュに注意深く通し、完全に消化されていない大きな組織片を取り除きます。
      注:消化が成功すると、固体の塊はほとんど残りません。
8. 両方のチューブ(心房および心室細胞懸濁液)を室温で6分間ベンチに置いておいて落ち着かせます。
9. 両方の15 mLチューブを5 x g で2分間遠心分離します。

4.カルシウムの再導入

注:次の手順は、心房細胞と心室細胞の両方で同じであり(特に言及されていない限り)、室温で実行されます。

1. プラスチック製のパスツールピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを10 mLのカルシウムフリータイロード溶液に注意深く再懸濁します。
2. 沈降のために細胞を8分間放置します。
3. 5 x g で1分間遠心分離する(心房細胞のみ、沈降は心室細胞には十分である)。
4. 上清を廃棄し、カルシウム濃度100 μMのタイロード溶液10 mLにペレットを注意深く再懸濁します。
5. 沈降のために細胞を8分間放置します。
6. 5 x g で1分間遠心分離する(心房細胞のみ、沈降は心室細胞には十分である)。
7. 上清を廃棄し、カルシウム濃度400 μMの10 mLのタイロード溶液にペレットを注意深く再懸濁します。
8. 沈降のために細胞を8分間放置します。
9. 5 x g で1分間遠心分離する(心房細胞のみ、沈降は心室細胞には十分である)。
10. 上清を廃棄し、ペレットを1 mL(心房)/ 5 mL(心室)のタイロード溶液に1 mMカルシウム濃度で注意深く再懸濁します。.

5.蛍光カルシウム指示薬Fluo-3 AMによる筋細胞の負荷

注意: 蛍光カルシウムインジケーターの光感度のため、次の手順は光から保護して実行する必要があります(たとえば、チューブをアルミホイルで覆うなど)。

1. 無水DMSO中の20%プルロニックF-127を50 μgのFluo-3AMに添加して、Fluo-3 AMストック溶液を調製します(光から保護された-20°Cで保存できます)。
2. 10 μLのFluo-3 AMストック溶液を1 mLの細胞懸濁液に加え、光から保護された室温で10分間インキュベートします。
3. 5 x g で1分間遠心分離します。
4. プラスチック製のパスツールピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを妥当な量の浴溶液に再懸濁して、良好な使用濃度(細胞密度に応じて1〜5 mLの浴溶液)を得ます。
5. 実験を開始する前に、脱エステル化のために30分間放置してください。

6.前述のパッチクランプとエピ蛍光^Ca2+過渡測定の同時測定¹⁶

注:パッチクランプ測定はこの記事のトピックではなく、関心のある読者は、この方法の詳細な説明を提供する主要な出版物を参照することができます¹⁷、^18、19、²⁰、^21、22。それにもかかわらず、全体的な理解を深めるために、電流誘発カルシウム過渡現象とともにL型カルシウム電流を測定するためのプロトコルに関する要約が提供されています。

1. 筋細胞を細胞室に移し、37°Cの浴液で過溶します。
2. 表5に示すように、4-アミノピリジンと塩化バリウムを浴溶液に添加することにより、カリウム電流を遮断します。
3. ホウケイ酸微小電極の先端抵抗がピペット溶液で満たされた2〜5MΩであることを確認してください(表6)。
4. 電気信号と落射蛍光の両方を同時に記録できるように測定を設定します。電圧クランプモードを使用して、セルを-80mVに保持し、600msのランプパルスを-40mVに保持して高速Na⁺電流を非アクティブ化し、続いて0.5Hzで+10mVまで100msのテストパルスを使用してL型Ca²⁺電流を測定します(図2)。
5. 488 nmで励起を使用し、<520 nmで発光して検出し、[^{Ca 2+}]_I に変換すると仮定します
   
   ここで、k_d = Fluo-3の解離定数(864 nM)、F = Fluo-3蛍光;Fmax=^Ca2+-飽和蛍光は各実験¹⁹の終了時に得られた。

単離収率は、カルシウム再導入後に10 μLの細胞懸濁液を顕微鏡スライド上にピペッティングすることによって決定されます。心房細胞単離の場合は100を超える生存可能な棒状の非収縮細胞/ 10 μL、心室細胞単離の場合は1,000を超える生存可能な棒状の非収縮細胞/ 10 μLが十分な収量と見なされ、一般的にこのプロトコルを使用して得られます。このプロトコルで得られた心房細胞は、心臓伝導系の細胞、特に洞結節、ならびに左右の心房および心房付属器からの異なる筋細胞を含む様々な異なる細胞型を示した。これらの領域は別々に解剖されないため、さまざまな細胞形態が得られます。すべての心房細胞は小さく、細胞容量は約35 pF〜100 pFの範囲であり、一部は他の細胞よりも糸状です。 図3 パネルAは、カルシウム感受性色素を負荷した心房作動心筋からの典型的な細胞を示し、このプロトコルで得られた測定の準備ができている。心室筋細胞はより棒状で大きく、細胞容量は100〜約400pFの範囲であり、 図3 のパネルBは、カルシウム感受性色素を負荷した作動心筋からの典型的な心室細胞を示しており、このプロトコルで得られた測定の準備ができています。 図4 は、1つの心房筋細胞(パネルBおよびC)と1つの心室筋細胞(パネルEおよびF)からの同時細胞質カルシウム過渡によるL型カルシウム電流測定の代表例を示しています。

図1:ランゲンドルフ装置。 (A)カスタム設計された熱交換器とジャケット付き心腔を視野に入れた隔離セットアップの写真。(B)カニューレ心臓が所定の位置にあるジャケット付き心腔のクローズアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:刺激プロトコル。 総正味膜電流_(IM)を測定するために使用される電圧クランププロトコル(0.5Hz)は、主にL型Ca2+電流およびCa2+電流誘導^Ca2+過渡現象を反映します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:単離されたマウス心筋細胞。 (A)パッチクランプ実験の準備ができているFluo-3を負荷した心房心筋細胞の例。(B)パッチクランプ実験の準備ができているFluo-3を負荷した心室心筋細胞の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:代表的な録音。 (A)電圧クランププロトコル(0.5 Hz)。(b)総正味膜電流(IM₎は、主にマウス心房筋細胞におけるL型^Ca2+電流を反映する。(c)L型^Ca2+電流は、マウス心房筋細胞において一過性の^Ca2+を誘発する。(D)電圧クランププロトコル(0.5 Hz)。(e)総正味膜電流(IM₎は、主にマウス心室筋細胞におけるL型^Ca2+電流を反映する。(f)L型Ca2+電流は、マウス心室筋細胞において一過性の^Ca2+を誘発した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:10x灌流バッファー(1,000 mL)。

表2:1x灌流バッファー(500mL)。

表3:消化バッファー(50mL)。

表4:ストップバッファー(10mL)。

表5:入浴剤。

表6:ピペット溶液。

表 7: 一般的な問題とその解決方法

この記事では、カルシウム一過性記録を同時に行うパッチクランプ研究のために、同じマウスから高品質の心房筋細胞と心室筋細胞を取得する簡単で機能的な方法を提供します。得られたデータの品質は、細胞単離の品質に大きく依存します。上述のように、マウス心筋細胞を単離する多くの方法が以前に記載されている⁹、^10、11、12。単離された細胞は、パッチクランプ実験から収縮性研究、形態学的研究、プロテオミクス、ミトコンドリア機能研究など、さまざまな分析に使用されます。個々の目的ごとに、異なる方法で最適化された単離されたセルが必要です。このため、どのプロトコルも、1匹のマウスからの心房筋細胞と心室筋細胞のカルシウム取り扱い特性を同時に測定するパッチクランプ実験に適した高品質の分離につながりませんでした。これを変えるために、前述の多数のプロトコルの適応により、このプロトコルが開発されました。機械的に困難なステップもあれば、特定の方法で実行されるステップもあれば、絶縁品質にとって重要なステップもあります。これらの手順については、以下で説明します。

細胞単離の収量と質は、おそらく組織線維症の増加¹¹、^23、24のために動物の年齢とともに低下し^、消化時間と酵素量の個々の調整が必要になります。動物が年をとるほど、より多くの線維化組織が予想されます。示された消化時間と酵素量は、生後6か月の正常なサイズの健康なマウスにとって良い出発点ですが、個々のニーズに適応する必要があります。線維症を好む高齢マウスまたはトランスジェニックマウスを使用する場合は、より多くの酵素とより長い消化時間を適用することが提案されています。以前の研究が強調しているように、心臓の迅速で空気のないカニューレ挿入と即時灌流は、良好な細胞品質にとって絶対に重要です¹¹。心臓を入手して室温の灌流バッファーに入れて灌流を開始するまで、90〜180秒以上かからないことをお勧めします。長距離を避けるために、必要なすべての機器を1つの部屋に設置すると便利です。虚血間隔のさらなる短縮が望まれる場合、麻薬症およびその後の安楽死の別の方法を用いることができる。上記のように動物を完全に麻酔し、十分な量のフェンタニル(または動物福祉のガイドラインに従って同等の鎮痛薬)を適用し、動物をイソフルラン気化器とマウスに適した麻酔マスクを備えたプラットフォームに移動し、一定のイソフルランと酸素の流れを提供します。その後、上記のように進める。大きな血管が1回の切断で切断されるまで動物は正常な循環を持っているので、この方法は無流動時間を大幅に短縮し、必要に応じて分離品質を向上させることができます。

心臓を採取した後、冠状動脈灌流を確保するために大動脈カニューレを適切な深さに配置することが重要です。したがって、心臓を切除するときに大動脈弓または下行大動脈で大動脈を切断し、カニューレ形成のために少なくとも5mmの大動脈を残して、冠状動脈から遠位に縫合糸絹を結ぶことができるようにする必要がありますが、最初の大動脈側枝の前に。

単離プロセスでは、複数の細胞移動が必要であり、小さなピペットチップを使用したピペッティングは細胞に高いせん断応力を引き起こします。せん断応力を低減するための可能な解決策は、ゆっくりと慎重にピペッティングすることと、ピペットチップを45°の角度で数ミリメートル切断してチップ開口部を広げることです。切断されたピペットチップを溶融してエッジを柔らかくすることで、せん断応力をさらに低減できます。心室隔離の隔離収率は、通常、非常に高いので、剪断応力低減は必須ではない。個々の目標に応じて、心室細胞をせん断応力にさらして「最も適した」細胞を選択することはさらに有用です。ただし、心房分離では、消化後に心房細胞が特に脆弱であるため、この手順が重要です。溶液を追加するときはいつでも、細胞に直接ピペッティングするのではなく、チューブ壁でゆっくりとピペッティングを試みることをお勧めします。

コラゲナーゼの選択は、単離結果に大きく影響します。酵素調製物に違いがあるだけでなく、酵素活性のバッチ間の変動もあるため、新しい酵素バッチまたは新しいマウス系統で作業を開始する場合は、コラゲナーゼ量と消化時間の滴定が必要です。ただし、上記の表に示されている量と時間は、^{個々の最適化9}の良い出発点を示しています。ほとんどの企業は、個々のバッチをテストするために小さな酵素サンプルを提供しているため、バッチ選択がはるかに便利になります。

典型的な振幅および正常な単相崩壊を伴うカルシウム過渡現象は、Voigtらによって前述されたようにEGTA²⁵を使用せずに細胞を単離した場合に得ることができる^9,16。したがって、このプロトコルは低カルシウム濃度を使用し、単離プロセス中にEGTAを回避します。^Ca2+パラドックス現象²⁶から細胞を保護するために、カルシウムは最終濃度1mMまで段階的にゆっくりと再導入される。細胞内ナトリウム濃度が高いため、げっ歯類心筋細胞は特にカルシウム過剰になりやすく、ゆっくりと段階的な再導入が重要です²⁷。カルシウムフリー溶液の必要性は、ランゲンドルフベースのげっ歯類心筋細胞単離の主要な制限の1つです。カルシウムの再導入は、常に生存細胞の著しい損失をもたらす。それにもかかわらず、本明細書に記載されるようなゆっくりとした段階的な再導入は、各動物から測定値を確実に得るために良好な品質で十分な収率をもたらす。

カルシウム再導入直後に細胞収量と品質を評価することが重要です。最終評価は単離された細胞にパッチを当てている間に行われますが、カルシウム感受性色素を細胞にロードする前に顕微鏡で見ることで、細胞の量と質をすでに判断できます。良質の細胞は明らかに棒状であり、均質な膜を有しそして収縮しない。収縮は、膜の完全性の喪失を示し、過剰消化または高せん断応力の適用によって引き起こされる可能性があるため、細胞品質が低いことを示しています。過剰消化のもう一つの兆候は、生存細胞に関連する多くの細胞影に加えて、多くの表面タンパク質が除去されており、シール形成のためにピペットチップで細胞に近づこうとすると非常に脆弱な、見栄えの良い膜です。例示的な健康で良質の細胞が 図3に示されている。(パネルA:心房筋細胞、パネルB:心室筋細胞)。高収率での単離は、細胞がシール形成に対して免疫性をもたらし、逆もまた同様です。結局のところ、細胞の外観や収量に関係なく、究極の品質テストは、「各単離の単離された細胞で高品質の結果で目的の測定を実行することは可能ですか?」という単純な質問に対する答えです。上記のプロトコルは、肯定的な答えを可能にします。

多くの分離プロトコルは、脱共役剤ブレビスタチンを使用して、より高い収率とより高品質の細胞を得ます。このプロトコルは、光学マッピング実験における心臓電気生理学^28,29への影響の公表された証拠を考慮して、意図的にブレビスタチンを回避する。電気生理学的研究における脱共役剤の使用は注意して扱う必要があり、脱共役が必須である状況に限定する必要があります。.

このプロトコルで得られた細胞は、Fluo-3をロードしてから約6時間使用でき、心房細胞は時間に対してより脆弱です。したがって、同じ研究者が心室細胞を処理する場合は、心室細胞の前に心房細胞を研究することをお勧めします。

このプロトコルの1つの制限は、ほとんどのランゲンドルフベースの絶縁プロトコルに当てはまりますが、技術的に難しいことです。明らかに、マウスの心臓は小さく、すべての技術的側面は多くの運動を必要とします。これは、経験豊富な研究者がより良い結果を得ることを意味します。一部のプロトコルでは、一定の圧力を使用して心臓を灌流します。これには、消化と組織抵抗の連続的な喪失により灌流が加速するという利点があり、これは最適な消化時間を定義するのに役立ちますが、加速は組織に害を及ぼし、細胞の品質を大幅に低下させる可能性があります。ここで使用されているコンスタントフローアプローチでは、消化時間の明確なベンチマークはなく、最適な時間に消化を停止するのが難しい場合があり、関連する制限があります。別の制限は、このプロトコルにおいて単離された細胞が、上述の実験への適合性についてのみ試験されたことである。これらの細胞はさまざまな分析にも使用できる可能性がありますが、それでも証明する必要があります。その方向への最初のステップは、Seibertzらによって発表されたプロトコルに従って、以前に使用された電圧感受性色素よりも優れた動力学を持つ最近派生した電圧感受性色素であるVF2.1CIをロードすることにより、活動電位を視覚化するためにこの細胞を使用することでした³⁰。トラブルシューティングに役立つように、 表 7 に一般的な分離の問題とその対処方法を示します。

まとめると、記載された分離プロトコルは、マウス心房および心室心筋細胞を同時に単離するための実用的なアプローチを提供し、研究者が単一のマウスの心房および心室電気生理学的表現型を得ることを可能にする。これにより、心房細胞または心室細胞のいずれかを高品質で分離するだけの以前の分離プロトコルによってもたらされた統計的障害が取り除かれ、特定の研究に必要な動物の数を減らすのに役立ちます。これは、例えば高価な薬剤で満たされた浸透圧ミニポンプの移植などの介入が実験の一部であり、動物福祉の考慮事項において重要な要素となり得る場合に特に重要であり得る。