Summary
מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.
Abstract
מודלים של עכברים ממלאים תפקיד מכריע בחקר הפרעות קצב ומאפשרים לחקור מנגנונים מרכזיים של הפרעות קצב, כולל שינוי בתפקוד תעלת היונים וטיפול בסידן. לשם כך, קרדיומיוציטים פרוזדוריים או חדריים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק טלאי או לחקור הפרעות בטיפול בסידן. עם זאת, התשואה המוגבלת של קרדיומיוציטים באיכות גבוהה המתקבלים על ידי פרוטוקולי הבידוד הנוכחיים אינה מאפשרת את שתי המדידות באותו עכבר. מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באיכות גבוהה באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, למדידות עוקבות בו זמנית של מעברי סידן וזרם סידן מסוג L מחיה אחת. לבבות עכבר מתקבלים, ואבי העורקים הוא cannulated במהירות כדי להסיר דם. לאחר מכן הלבבות מחוררים תחילה בתמיסה נטולת סידן (37°C) כדי לנתק את הרקמה ברמה של דיסקים משולבים ולאחר מכן בתמיסת אנזים המכילה מעט סידן כדי לשבש מטריצה חוץ-תאית (37°C). הלב המעוכל מנותח לאחר מכן לאטריה ולחדרים. דגימות רקמה נחתכות לחתיכות קטנות ומומסות על ידי פיפטציה בזהירות למעלה ולמטה. העיכול האנזימטי מופסק, והתאים מוכנסים מחדש בהדרגה לריכוזי הסידן הפיזיולוגיים. לאחר טעינה עם מחוון פלואורסצנטי Ca2+, קרדיומיוציטים מבודדים מוכנים למדידה בו זמנית של זרמי סידן וחולפים. בנוסף, נדונות מלכודות בידוד ופרוטוקולי מהדק טלאי ועקבות מייצגים של זרמי סידן מסוג L עם מדידות ארעיות סידן בו זמנית במיוציטים מורין פרוזדורים וחדריים שבודדו כמתואר לעיל.
Introduction
הפרעות קצב לב הן נפוצות ואחד האתגרים העיקריים כיום בתחום הבריאות, שכן הן משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם. הפרעות קצב קשורות לתחלואה גבוהה ולתמותה 1,2 ומייצגות את הסיבה הבסיסית לרוב מקרי המוות הלבבי הפתאומי3. אפשרויות הטיפול העדכניות שיפרו את הישרדות המטופלים, אך עדיין מדובר בעיקר בטיפולים סימפטומטיים ולא במנגנונים הבסיסיים. לכן, טיפולים אלה הם בעלי יעילות מוגבלת ועלולים לגרום לעתים קרובות לתופעות לוואי חמורות 4,5,6. שיפור אפשרויות הטיפול הנוכחיות דורש תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה הבסיסית, מה שיוצר את הצורך במודלים מתאימים למחקר. מודלים של בעלי חיים קטנים - ובמיוחד מודלים של עכברים - ממלאים תפקיד מכריע במחקר הפרעות קצב, שכן הם מאפשרים לחקור מנגנוני מפתח של הפרעות קצב, למשל ההשפעה הגנטית על אלקטרופיזיולוגיה תאית, תפקוד תעלות יונים או טיפול בסידן 7,8.
לשם כך נדרשים קרדיומיוציטים פרוזדוריים וחדריים מבודדים בכמות מספקת וכדאיות. ספקטרום רחב של גישות בידוד שונות להשגת מיוציטים פרוזדוריים וחדריים תואר בעבר 9,10,11,12,13 וכמה קבוצות הציגו נתונים ממדידות סימולטניות של זרם מסוג L וזרם סידן המושרה על ידי מעבר סידן מפרוזדורים 14 או חדר 15 קרדיומיוציטים מורין. עם זאת, למיטב ידיעתנו אין נתונים זמינים על מדידות פרוזדורים כמו גם חדרים מחיה אחת. החוקרים מתמקדים במגוון רחב של נושאים, החל מאלקטרופיזיולוגיה ועד פרוטאומיקה, מחקרים פונקציונליים כמו התכווצות תאים או אינטראקציות חלבונים, תפקוד מיטוכונדריאלי או גנטיקה – כולם זקוקים לקרדיומיוציטים מבודדים. לפיכך, רבים מהפרוטוקולים שפורסמו לא פותחו במיוחד עבור מחקרי מהדק טלאי, מה שמוביל לתפוקות מוגבלות ואיכות תאים לא מספקת למחקרי מהדק טלאים. לפיכך, מדידות בו זמנית של מהדק טלאי וסידן ארעיות של תאים פרוזדוריים וחדרים שבודדו מבעל חיים אחד אינן יכולות להתבצע עם פרוטוקולים מבוססים.
בידוד של מיוציטים מורינים – במיוחד פרוזדורים – עבור ניסויים מהדק טלאי נותר מאתגר. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ומהירה לבידוד של מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באיכות גבוהה באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר לאחר מכן מדידות בו זמנית הן של זרם קרום נטו והן של מעבר סידן המושרה בזרם מחיה אחת. מאמר זה מפרט פרוטוקול לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים שמקורם בעכברים מסוג בר ובעכברים הנושאים מוטציות גנטיות. פרוטוקול זה יכול לשמש עכברים זכרים ונקבות כאחד. בידוד המיוציטים, התמונות והתוצאות המייצגות המתוארות להלן התקבלו מעכברי בר מסוג C57Bl/6 בגיל 6 (± 1) חודשים. עם זאת, פרוטוקול זה שימש בהצלחה עבור עכברים בגילאים שונים החל מ 2 עד 24 חודשים עם גנוטיפים שונים. איור 1 מראה את מערך הבידוד ותקריב של לב משומר במהלך זילוח אנזימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בנושא בעלי חיים אושרו על ידי המועצה לביקורת בעלי חיים בסקסוניה התחתונה (LAVES, AZ-18/2900) ונערכו בהתאם לכל ההנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת בעלי חיים.
1. סידורים מראש
- הכינו 1 ליטר של חיץ זילוח 10x (טבלה 1), 500 מ"ל של חיץ זילוח 1x (טבלה 2), 50 מ"ל של חיץ עיכול (טבלה 3), 10 מ"ל של חיץ עצירה (טבלה 4), 1 ליטר של תמיסת Tyrode (טבלה 5), 10 מ"ל של כל תמיסת שלב סידן (תמיסת Tyrode עם גלוקוז וכמות סידן מתאימה כפי שצוין), 1 ליטר של תמיסת 4-AP (טבלה 5), 100 מ"ל של תמיסת פיפטה (טבלה 6) ו-5 מ"ל של חומצה פלורונית לפי המתכונים שסופקו.
הערה: ניתן להכין מראש תמיסות אמבטיה (Tyrode ותמיסת 4-AP) (ללא גלוקוז) ולאחסן ב +4 ° C, גלוקוז מתווסף ביום הניסוי. ניתן לאחסן תמיסת פיפטה ב -20 מעלות צלזיוס, מחוון סידן מתווסף ביום הניסוי ותמיסה מאוחסנת על קרח עד לשימוש נוסף. ניתן לאחסן חיץ זילוח 10x בטמפרטורת החדר, יש להכין חיץ זילוח 1x, חיץ עיכול וחיץ עצירה טריים ביום הניסוי. - הפעל את אמבט המים ואת משאבת הרולר.
- מילוי מראש של מנגנון לנגנדורף בחיץ זילוח; ודא שהוא נטול אוויר.
- הכינו צינורית אבי העורקים על ידי קיבוע מתחת למיקרוסקופ דיסקציה, חברו מזרק 1 מ"ל מלא בחיץ זילוח ואוויר צלול על ידי שטיפת הצינורית.
הערה: חשוב להימנע מכל אוויר בתוך מערכת הזלוף, שכן זה ישפיע ישירות על זילוח כלילי ובכך על יעילות העיכול. במידת הצורך, ניתן להוסיף מלכודת בועות להתקנה, כדי למנוע בבטחה לכידת אוויר. - הכינו צלחות פטרי עם מספיק חיץ זילוח לאיסוף איברים ומיקרוסקופ (החיץ צריך לכסות היטב את כל האיבר, כמה מיליליטרים – תלוי בגודל צלחת הפטרי המשומשת – אמורים להספיק).
- הכינו 3 צלחות פטרי עם חיץ עיכול לדיסוציאציה של רקמות ומיקרוסקופ, החיץ צריך לכסות את האיבר לדיסקציה תחת המיקרוסקופ בתוך צלחת הפטרי המתאימה, הכמות תלויה בגודל צלחת הפטרי המשומשת. עבור דיסוציאציה להשתמש 3 מ"ל עבור רקמה חדרית ו 1.5 מ"ל עבור רקמת פרוזדורים.
2. קצירת איברים
- הזריקו לעכבר 0.1 מ"ל הפרין (1,000 U/mL) כלומר באמצעות מזרק 1 מ"ל עם צינורית 27 גרם והמתינו 5-10 דקות.
- הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה יחד עם רקמה קטנה ספוגה בכ-500 מיקרוליטר איזופלורן. החיה לא צריכה להיות בקשר עם הרקמה. כדי להימנע מכך, ניתן להשתמש בקלטת הטבעה של ביופסיה פלסטית כדי לכסות את הרקמה. ברגע שהחיה מורדמת לחלוטין, בדוק אם יש רפלקס צביטת בוהן וברגע שהוא אינו קיים יותר, להרדים במהירות את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם.
- הניחו את העכבר על פלטפורמה על גבו (למשל, על קלקר מכוסה במגבת נייר) וקיבעו את הכפות עם צינוריות כדי להחזיק אותו במקומו.
- הסר פרווה ועור המכסים את החזה וחלק מהבטן עם חתך ברור מ jugulum לכיוון סימפיזיס ולפתוח את הבטן ממש מתחת xiphoid מבלי לפגוע בכל מבנה איבר באמצעות מספריים. להרים את עצם החזה עם מלקחיים כירורגיים לחתוך את הסרעפת עם מספריים לאורך קצה הצלעות, ולאחר מכן לחתוך את הצלעות בקו השחי המדיאלי ולהסיר את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
- בזהירות להסיר את קרום הלב באמצעות מלקחיים קהה במהירות להסיר את הלב על ידי הרמת אותו עם מלקחיים קהה מלמטה על ידי חיתוך כלי גדול עם חתך אחד בודד באמצעות מספריים.
- הכניסו את הלב לחיץ זילוח בטמפרטורת החדר וקשרו את אבי העורקים עם מחט קצה קהה מתחת למיקרוסקופ במהירות האפשרית.
הערה: הסר כל רקמת ריאה ורקמת שומן המחוברת לאיבר מבלי לאבד זמן רב מדי עליו. בזמן הקנולציה, יש לוודא כי קצה המחט אינו משתרע דרך שסתום אבי העורקים, שכן הדבר יפגע בתוצאות על ידי מניעת חוצצים מלהיכנס לעורקים הכליליים. - קשרו את הלב עם פיסת משי תפירה בחוזקה למחט והתנתקו מהמזרק.
הערה: כל ההליך מקבלת הלב (הרגע שבו כלי הדם הגדולים נחתכים) ועד תפירת אבי העורקים למחט צריך לקחת כמה שפחות זמן. מומלץ לא לקחת יותר מ 90-180 שניות מהסרת הלב עד תחילת הזלוף.
3. עיכול אנזימטי
- לאחר קנולציה של אבי העורקים, חברו מיד את הלב המשומר למנגנון לנגנדורף תוך הימנעות מכניסת אוויר למערכת.
הערה: זה יכול לעזור שיש טיפה תלויה של חיץ זילוח בתחתית מנגנון לנגנדורף, כמו גם טיפה של חיץ זילוח יושב על החלק העליון של המחט על מנת למנוע כל אוויר נכנס למערכת. - יש לערבב את הלב עם חיץ זילוח למשך דקה אחת בטמפרטורה של 37°C בדיוק וקצב זילוח של 4 מ"ל/דקה בדיוק.
הערה: על מנת לקבל טמפרטורה של 37 °C בקצה מחט הזלוף, טמפרטורת אמבט המים צריכה להיות מוגדרת מעט מעל כ 40 °C (70 °F). זה צריך להיבדק באופן קבוע על ידי מדידת הטמפרטורה בקצה זילוח. - מעבירים את הזילוח לחיץ העיכול ומחוררים למשך 9 דקות בדיוק בטמפרטורה של 37°C בדיוק ובקצב זילוח של 4 מ"ל/דקה בדיוק.
- העבירו את הלב המעוכל לצלוחית פטרי עם מספיק חיץ עיכול כדי לשמור עליו מכוסה במלואו. לאחר מכן לנתח בזהירות את אטריה וחדרים מתחת למיקרוסקופ.
- מעבירים את האטריה לצלחת פטרי עם 1.5 מ"ל של חיץ עיכול ואת החדרים לצלחת פטרי אחרת עם 3 מ"ל של חיץ עיכול.
- דיסקציה פרוזדורית
- בזהירות, אך ללא אובדן זמן, פרקו את האטריה לחתיכות זעירות באמצעות מלקחיים קהים.
- ממיסים את הרקמה על ידי זינוק זהיר למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה 1,000 μL, אשר נחתך בעבר כדי להרחיב את פתח הקצה.
- העבר את התמיסה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסף כמות שווה ערך של חיץ עצירה (1.5 מ"ל) על ידי פיפטציה בזהירות בצד הצינור כדי לסיים את התגובה.
- העבירו בזהירות את כל 3 מ"ל תמיסות התא/רקמות דרך רשת ניילון של 200 מיקרומטר כדי להסיר את חתיכות הרקמה הגדולות שנותרו שלא עוכלו במלואן.
הערה: עיכול מוצלח לא ישאיר כמעט גושים מוצקים.
- דיסקציה חדרית
- חותכים במהירות את רקמת החדר לחתיכות זעירות באמצעות מספריים דיסקציה ופיפטה למעלה ולמטה כדי להתמוסס. השתמש עוד 1,000 μL פיפטה קצה עבור pipeting למעלה ולמטה, זה עשוי להיות מקוצר כדי להרחיב את הפתח.
- העבר תמיסת תא/רקמה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסף כמות שווה ערך של חיץ עצירה (3 מ"ל) על ידי פיטיפציה בזהירות בצד הצינור כדי לסיים את התגובה.
- העבירו בזהירות את כל 6 מ"ל תמיסת התא/רקמה דרך רשת ניילון של 200 מיקרומטר כדי להסיר חתיכות רקמה גדולות יותר שלא עוכלו במלואן.
הערה: עיכול מוצלח לא ישאיר כמעט גושים מוצקים.
- השאירו את שני הצינורות (מתלה תאי פרוזדורים וחדר חדרים) על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 6 דקות כדי להתיישב.
- צנטריפוגה שני צינורות 15 מ"ל ב 5 x גרם במשך 2 דקות.
4. החזרת סידן
הערה: השלבים הבאים זהים הן עבור תאי פרוזדורים והן עבור תאים חדריים (אלא אם צוין אחרת) ומבוצעים בטמפרטורת החדר.
- יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק ולהשהות בזהירות את הגלולה ב-10 מ"ל של תמיסת טירוד נטולת סידן.
- השאירו תאים למשך 8 דקות לשיקוע.
- צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקות (רק תאים פרוזדורים, שקיעה מספיקה עבור תאים חדריים).
- יש להשליך את כדורי הסופרנאטנט בזהירות ב-10 מ"ל של תמיסת Tyrode עם ריכוז סידן של 100 מיקרומטר.
- השאירו תאים למשך 8 דקות לשיקוע.
- צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקות (רק תאים פרוזדורים, שקיעה מספיקה עבור תאים חדריים).
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות בזהירות את הגלולה ב-10 מ"ל של תמיסת טירוד עם ריכוז סידן של 400 מיקרומטר.
- השאירו תאים למשך 8 דקות לשיקוע.
- צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקות (רק תאים פרוזדורים, שקיעה מספיקה עבור תאים חדריים).
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות בזהירות את הגלולה ב-1 מ"ל (פרוזדור) / 5 מ"ל (חדרי) של תמיסת טירוד עם ריכוז סידן של 1 מ"מ.
5. העמסת מיוציטים עם מחוון סידן פלואורסצנטי Fluo-3 AM
הערה: בשל רגישות האור של מחוון הסידן הפלואורסצנטי, יש לבצע את השלבים הבאים מוגנים מפני אור (למשל, על ידי כיסוי צינורות ברדיד אלומיניום).
- הכן את תמיסת המלאי Fluo-3 AM על ידי הוספת 44 μL של 20% פלורוני F-127 ב- DMSO נטול מים ל- 50 מיקרוגרם של Fluo-3AM (ניתן לאחסן ב- -20 °C מוגן מפני אור).
- הוסף 10 μL של תמיסת מלאי Fluo-3 AM ל- 1 מ"ל של תרחיף תאים ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
- צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקה.
- יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק ולהשהות מחדש את הגלולה בכמות סבירה של תמיסת אמבטיה כדי לקבל ריכוז עבודה טוב (1-5 מ"ל של תמיסת אמבטיה בהתאם לצפיפות התא).
- השאירו למשך 30 דקות לדה-אסטריפיקציה לפני שתתחילו בניסויים.
6. מדידות ארעיות בו זמנית של מהדק טלאי ואפיפלואורסצנטי Ca2+ כמתואר לעיל16
הערה: מדידות מהדק טלאי אינן נושא מאמר זה, הקורא המעוניין עשוי להיות מופנה לפרסומים גדולים המספקים תיאורים מעמיקים של שיטה זו 17,18,19,20,21,22. עם זאת, להבנה כללית טובה יותר, ניתן סיכום על פרוטוקול למדידת זרמי סידן מסוג L יחד עם מעברי סידן המושרים בזרם.
- מעבירים מיוציטים לתוך תא התא וסופרפיוז עם תמיסת אמבטיה ב 37 ° C.
- חסום זרמי אשלגן על-ידי הוספת 4-אמינופירידין ובריום כלורי לתמיסת האמבטיה כמצוין בטבלה 5.
- ודא שלמיקרואלקטרודות בורוסיליקט יש עמידות חוד של 2-5 MΩ מלא בתמיסת פיפטה (טבלה 6).
- מדידות התקנה כדי לאפשר הקלטה בו זמנית של אותות חשמליים ואפיפלואורסנציה בו זמנית. מצב מהדק מתח משמש למדידת זרם Ca2+ מסוג L עם פרוטוקול המחזיק את התא ב -80 mV ודופק רמפה של 600 ms עד -40 mV כדי להשבית את זרם Na+ המהיר, ואחריו פעימת בדיקה של 100 ms ל +10 mV ב- 0.5 הרץ (איור 2).
- השתמש בעירור ב 488 ננומטר, נפלט אור ב <520 ננומטר כדי לזהות ולהמיר ל [Ca2+] אני מניח
כאשר kd = קבוע דיסוציאציה של Fluo-3 (864 nM), F = פלואורסצנטיות פלואורסצנטית; Fmax = Ca2+ פלואורסצנטיות רוויה המתקבלת בסוף כל ניסוי19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תפוקת הבידוד נקבעת לאחר החזרת הסידן על ידי הנחת 10 מיקרוליטר של תרחיף התא על שקופית מיקרוסקופ. יותר מ-100 תאים בני קיימא, בצורת מוט, שאינם מתכווצים/10 μL לבידוד תאים פרוזדוריים ויותר מ-1,000 תאים בני קיימא, בצורת מוט, שאינם מתכווצים/10 μL לבידוד תאים חדריים נחשבים לתנובה מספקת ומתקבלים בדרך כלל באמצעות פרוטוקול זה. תאי פרוזדורים שהתקבלו בפרוטוקול זה הראו מגוון סוגי תאים שונים המכילים תאים של מערכת ההולכה הלבבית, במיוחד בלוטת הסינוס, כמו גם מיוציטים שונים מהאטריום הימני והשמאלי וכן את נספחי הפרוזדורים. מכיוון שאזורים אלה אינם מנותחים בנפרד, מורפולוגיות תאים שונות הן התוצאה. כל תאי הפרוזדורים קטנים, עם קיבולות תאים הנעות בין כ 35 pF - 100 pF, חלקם פיליפורמים יותר מאחרים. איור 3 בלוח A מראה תא טיפוסי משריר הלב העובד פרוזדורים עמוס בצבע רגיש לסידן, מוכן למדידות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה. מיוציטים חדריים הם יותר בצורת מוט וגדולים יותר עם קיבולות תאים שנעות בין 100 לסביבות 400 pF, איור 3 בלוח B מראה תא חדר טיפוסי משריר הלב העובד עמוס בצבע רגיש לסידן, מוכן למדידות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה. איור 4 מציג דוגמאות מייצגות של מדידות זרם סידן מסוג L עם מעברי סידן ציטוסוליים בו זמנית ממיוציטים פרוזדוריים אחד (לוח B ו-C) וממיוציטים חדריים אחד (פאנל E ו-F).
איור 1: מנגנון לנגנדורף. (A) צילום של מערך הבידוד עם מבט על מחליף החום המעוצב בהתאמה אישית וחדר הלב המעוטר. (B) תקריב של חדר הלב עם לב משומר במקומו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרוטוקול גירוי. פרוטוקול מהדק מתח (0.5 הרץ) המשמש למדידת זרם קרום נטו כולל (IM), המשקף בעיקר זרם Ca 2+ מסוג L וזרם Ca 2+ המושרה Ca 2+ חולף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קרדיומיוציטים מורינים מבודדים. (A) דוגמה לקרדיומיוציטים פרוזדוריים עמוסים בפלו-3, מוכנים לניסויי מהדק טלאי. (B) דוגמה לקרדיומיוציטים חדריים עמוסים בפלו-3, מוכנים לניסויי מהדק טלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הקלטות מייצגות. (A) פרוטוקול מהדק מתח (0.5 הרץ). (B) זרם קרום נטו כולל (IM), המשקף בעיקר זרם Ca2+ מסוג L במיוציטים פרוזדוריים מורינים. (C) זרם Ca 2+ מסוג L הפעיל Ca2+ חולף במיוציטים פרוזדוריים מורין. (D) פרוטוקול מהדק מתח (0.5 הרץ). (E) זרם קרום נטו כולל (IM), המשקף בעיקר זרם Ca2+ מסוג L במיוציטים חדריים מורינים. (F) זרם Ca 2+ מסוג L הפעיל Ca2+ חולף במיוציטים חדריים מורינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ריכוז סופי (mM) | |
| NaCl | 120.4 |
| KCl | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na 2 HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
טבלה 1: חיץ זילוח 10x (1,000 מ"ל).
| ריכוז סופי (mM) | |
| NaHCO3 | 4.6 |
| טאורין | 30 |
| 2,3-בוטנדיון מונוקסיום | 10 |
| גלוקוז | 5.5 |
| מאגר זילוח 10x | 50 מ"ל |
| זיקוק כפול H 2 O(18,2 MΩ-cm) | 500 מ"ל |
טבלה 2: חיץ זילוח אחד (500 מ"ל).
| ריכוז סופי | |
| קולגנאז סוג II | ~600 U/ml |
| CaCl2 | 40 מיקרומטר |
| 1x חיץ זילוח | 50 מ"ל |
טבלה 3: חיץ עיכול (50 מ"ל).
| ריכוז סופי | |
| סרום עגל בקר | 10% |
| CaCl2 | 12.5 מיקרומטר |
| 1x חיץ זילוח | 10 מ"ל |
טבלה 4: חיץ עצירה (10 מ"ל).
| ריכוז סופי (mM) | ||
| טיירוד | 4-AP | |
| NaCl | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| גלוקוז | 10 | 10 |
| KCl | 4 | 4 |
| MgCl x 6H2O | 1 | 1 |
| פרובנסיד | 2 | 2 |
| 4-אמינופירידין | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| pH | 7.35 מותאם עם 1 M NaOH בטמפרטורת החדר | 7.35 מותאם עם 1 M NaOH בטמפרטורת החדר |
טבלה 5: פתרונות אמבטיה.
| ריכוז סופי (mM) | |
| DL-אספרטט K+-מלח | 92 |
| KCl | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| גואנוזין 5′-טריפוספט מלח טריס | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| פלואו-3 | 0.1 |
| pH | 7.20 מותאם עם 1 M KOH בטמפרטורת החדר |
טבלה 6: פתרון פיפטה.
| הבעיה נצפתה | סיבה אפשרית | תמיסה |
| תפוקת תאים נמוכה, גושי רקמות נותרו | קלקול קיבה | הארכת זמן העיכול במרווחים של 15 שניות |
| תפוקת תאים נמוכה, גושי רקמות נותרו | קלקול קיבה | הגדל את כמות collagenase ב 50 U / ml צעדים |
| תערובת של תאים מעוכלים יתר על המידה, גושי רקמות שנותרו | ללא זילוח כלילי | יש להקפיד לא להחדיר צינורית אבי העורקים לחדר |
| תערובת של תאים מעוכלים יתר על המידה, גושי רקמות שנותרו | בועות אוויר | הקפידו לא להכניס אוויר למערכת הזילוח |
| איכות תא כוללת נמוכה | זמן איסכמי ארוך מדי | הפחתת זמן איסכמי, לשקול שיטות חלופיות כדי לשמור על זרימת הדם זמן רב ככל האפשר |
טבלה 7: בעיות נפוצות וכיצד לפתור אותן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מספק דרך קלה ופונקציונלית להשיג מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה מאותו עכבר עבור מחקרי מהדק טלאי עם הקלטות סידן חולפות בו זמנית. איכות הנתונים המתקבלים תלויה מאוד באיכות בידוד התא. כפי שהוזכר לעיל, שיטות רבות לבודד קרדיומיוציטים murine תוארו בעבר 9,10,11,12. התאים המבודדים משמשים לניתוחים שונים, החל מניסויי מהדק טלאי ועד מחקרי התכווצות, מחקרים מורפולוגיים, פרוטאומיקה, מחקר תפקודי מיטוכונדריה ועוד. כל מטרה בנפרד דורשת תאים מבודדים הממוטבים באופן שונה. בשל כך, אף אחד מהפרוטוקולים לא הוביל לבידודים באיכות גבוהה המתאימים לניסויי מהדק טלאי עם מדידה סימולטנית של תכונות הטיפול בסידן של מיוציטים פרוזדוריים וחדריים מעכבר אחד. כדי לשנות זאת, ההתאמה של פרוטוקולים רבים שתוארו קודם הביאה לפיתוח פרוטוקול זה. חלק מהצעדים מאתגרים מבחינה מכנית, חלקם צריכים להיעשות באופן ספציפי וחלקם פשוט חיוניים לאיכות הבידוד. שלבים אלה יידונו להלן.
התפוקה והאיכות של בידוד התאים יורדות עם גיל בעלי החיים, אולי בגלל פיברוזיס מוגבר ברקמה 11,23,24 מה שהופך התאמות אינדיבידואליות של זמן העיכול וכמות האנזים הדרושות. ככל שבעל החיים מבוגר יותר, כך יש לצפות לרקמה פיברוטית יותר. זמני העיכול המצוינים וכמויות האנזימים הם נקודת התחלה טובה לעכברים בריאים בגודל תקין בגיל 6 חודשים, אך יצטרכו הסתגלות לצרכים האישיים. מומלץ להשתמש באנזימים רבים יותר ובזמני עיכול ארוכים יותר בעת שימוש בעכברים מבוגרים או בעכברים טרנסגניים המעדיפים פיברוזיס. כפי שעבודות קודמות הדגישו, קנולציה מהירה ונטולת אוויר, כמו גם זילוח מיידי של הלב, הם קריטיים לחלוטין לאיכות תאים טובה11. מומלץ לא לקחת יותר מ-90-180 שניות מקבלת הלב והכנסתו לחיץ זילוח בטמפרטורת החדר ועד לתחילת הזילוח – כמה שיותר מהר, יותר טוב. כדאי להגדיר את כל הציוד הדרוש בחדר אחד כדי להימנע ממרחקים ארוכים. אם רוצים קיצור נוסף של המרווח האיסכמי, ניתן להשתמש בשיטה אחרת של נרקוזיס והמתת חסד לאחר מכן. יש להרדים את בעל החיים באופן מלא כמתואר לעיל, למרוח כמות מספקת של פנטניל (או תרופה משככת כאבים שוות ערך בהתאם להנחיות שלך לרווחת בעלי חיים) i.p. ולהעביר את בעל החיים לפלטפורמה עם וופורייזר איזופלורן ומסיכת הרדמה המתאימה לעכברים, תוך מתן זרימת איזופלורן וחמצן קבועה. לאחר מכן המשך כמתואר לעיל. מכיוון שלבעל החיים יש סירקולציה תקינה עד ניתוק הכלים הגדולים בחתך יחיד, שיטה זו תקצר את זמן אי הזרימה באופן משמעותי ובכך תוכל לשפר את איכות הבידוד במידת הצורך.
לאחר קצירת הלב, קריטי למקם את צינורית אבי העורקים בעומק הנכון כדי להבטיח זילוח כלילי. לכן, יש צורך לחתוך את אבי העורקים בקשת אבי העורקים או באבי העורקים היורד בעת הסרת הלב להשאיר לפחות 5 מ"מ של אבי העורקים עבור קנולציה, המאפשר לקשור את משי התפר דיסטלי מן העורקים הכליליים, אבל לפני הראשון אבי העורקים צדדי ענפים.
במהלך תהליך הבידוד, יש צורך בהעברות תאים מרובות ופיפטה עם קצות פיפטה קטנים תגרום ללחץ גזירה גבוה לתאים. פתרונות אפשריים להפחתת לחץ הגזירה הם פיפטציה איטית וזהירה, כמו גם חיתוך קצות פיפטה בכמה מילימטרים בזווית של 45 מעלות כדי להרחיב את פתח הקצה. הפחתה נוספת של מתח הגזירה יכולה להיות מושגת על ידי המסת קצות פיפטה לחתוך כדי לרכך את הקצוות. תפוקת הבידוד של בידוד החדר בדרך כלל כה גבוהה עד כי הפחתת מתח הגזירה אינה חובה. בהתאם למטרה האישית של האדם, זה יכול להיות אפילו שימושי יותר לחשוף את תאי החדר ללחץ גזירה כדי לבחור את התאים "המתאימים" ביותר. עם זאת, עבור בידוד פרוזדורים הליך זה הוא קריטי, כמו תאים פרוזדורים פגיעים במיוחד לאחר העיכול. בכל פעם שמוסיפים תמיסות, מומלץ להימנע מפיפט ישירות על התאים, אלא לנסות לצנן באיטיות את דופן הצינור.
הבחירה ב-collagenase תשפיע באופן משמעותי על תוצאות הבידוד. מאחר שיש לא רק הבדלים בתכשירי אנזימים, אלא גם וריאציה רלוונטית בין אצווה לפעילות האנזימים, יש צורך בטיטרציה של כמות הקולגנאז וזמן העיכול כאשר מתחילים לעבוד עם אצווה חדשה של אנזים או זן חדש של עכברים. עם זאת, הכמות והזמן המצוינים בטבלאות לעיל מסמנים נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה אישית9. רוב החברות מספקות דגימות אנזימים קטנות לבדיקת אצוות בודדות, מה שהופך את בחירת האצווה להרבה יותר נוחה.
ניתן להשיג מעברי סידן עם אמפליטודות אופייניות ודעיכה מונופאזית רגילה אם התאים מבודדים ללא שימוש ב- EGTA25 כפי שתואר קודם לכן על ידי Voigt et al.9,16. פרוטוקול זה, אם כן, משתמש בריכוזי סידן נמוכים ומונע EGTA בתהליך הבידוד. כדי להגן על התאים מפני תופעת פרדוקס Ca 2+ 26, סידן מוחזר בהדרגה ובאיטיות עד לריכוז סופי של 1 mM. בשל ריכוזי נתרן תוך-תאיים גבוהים יותר, קרדיומיוציטים של מכרסמים מועדים במיוחד לעומס יתר של סידן וחזרה איטית והדרגתית היא חיונית27. הצורך בתמיסות נטולות סידן מייצג את אחת המגבלות העיקריות של כל בידודי הקרדיומיוציטים של מכרסמים מבוססי לנגנדורף. החזרת סידן תמיד מובילה לאובדן משמעותי של תאים ברי קיימא. עם זאת, החזרה איטית והדרגתית כפי שמתואר כאן, מובילה ליבול מספיק באיכות טובה כדי לקבל מדידות מכל בעל חיים בצורה אמינה.
חשוב להעריך את תפוקת התאים ואת איכותם מיד לאחר החזרת הסידן. למרות שהערכה סופית מתבצעת בעת תיקון התאים המבודדים, ניתן כבר לשפוט את כמות התאים ואת איכותם על ידי מבט מתחת למיקרוסקופ לפני העמסת התאים בצבע רגיש לסידן. תאים באיכות טובה הם בבירור בצורת מוט, יש קרום הומוגני והם אינם מתכווצים. התכווצות היא סימן לאיכות תאים נמוכה מכיוון שהיא מצביעה על אובדן שלמות הממברנה ועלולה להיגרם על ידי עיכול יתר או יישום של לחץ גזירה גבוה. סימן נוסף לעיכול יתר הוא – מלבד צללים רבים של תאים ביחס לתאים בני קיימא – קרום יפה מדי למראה שנוקה מחלבונים רבים על פני השטח והוא פגיע ביותר כאשר מנסים להתקרב לתא עם קצה פיפטה ליצירת חותם. תאים בריאים ובאיכות טובה למופת מוצגים באיור 3. (לוח A: מיוציטים פרוזדוריים, לוח B: מיוציטים חדריים). בידודים עם תפוקות גבוהות יכולים להוביל לתאים חסינים להיווצרות כלבי ים ולהיפך. בסופו של דבר, בדיקת האיכות האולטימטיבית ללא קשר למראה התא ותפוקתו, היא התשובה לשאלה פשוטה: 'האם ניתן לבצע את המדידות הרצויות עם תוצאות באיכות גבוהה בתאים המבודדים של כל בידוד?'. הפרוטוקול המובא לעיל מאפשר תשובה חיובית.
פרוטוקולי בידוד רבים משתמשים בחומר ביטול הצימוד Blebbistatin כדי להשיג תפוקות גבוהות יותר ותאים באיכות טובה יותר. פרוטוקול זה נמנע במכוון מבלביסטטין, תוך התחשבות בראיות שפורסמו להשפעתו על אלקטרופיזיולוגיה של הלב28,29 בניסויי מיפוי אופטי. השימוש בחומרי פירוק צימוד במחקרים אלקטרופיזיולוגיים חייב להיות מטופל בזהירות ויש להגביל אותו לנסיבות שבהן ניתוק הצימוד הוא חובה.
תאים המתקבלים עם פרוטוקול זה יכולים לשמש במשך כשש שעות לאחר טעינה עם Fluo-3 עם תאים פרוזדורים להיות פגיעים יותר לזמן. כתוצאה מכך, מומלץ לחקור תאי פרוזדורים לפני תאי החדר אם אותו חוקר מעבד אותם.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה – כפי שנכון לרוב פרוטוקולי הבידוד מבוססי לנגנדורף – היא שהוא קשה מבחינה טכנית. ברור שלבבות עכברים הם קטנים, וכל ההיבטים הטכניים דורשים הרבה פעילות גופנית. משמעות הדבר היא כי חוקר מנוסה ישיג תוצאות טובות יותר. פרוטוקולים מסוימים משתמשים בלחץ מתמיד כדי לחורר את הלב. זה יש את היתרון כי בשל העיכול ואובדן רצוף של התנגדות רקמות זילוח יואץ, וזה עוזר להגדיר את זמן העיכול האופטימלי, עם זאת התאוצה יכולה לפגוע ברקמה ולהפחית את איכות התא באופן משמעותי. בגישת זרימה קבועה כפי שהיא משמשת כאן, אין אמות מידה ברורות לזמני העיכול ולעתים קרובות קשה לעצור את העיכול בזמן אופטימלי, מה שמסמן מגבלה רלוונטית. מגבלה נוספת היא שבפרוטוקול זה נבדקו התאים המבודדים רק להתאמה לניסויים שתוארו לעיל. סביר להניח כי תאים אלה יכולים לשמש גם לניתוח שונה, אבל זה עדיין חייב להיות מוכח. צעד ראשון בכיוון זה היה שימוש בתאים אלה כדי להמחיש פוטנציאלי פעולה על ידי העמסתם עם VF2.1CI, צבע רגישות למתח שנגזר לאחרונה עם קינטיקה מעולה לצבעים רגישים למתח שהיו בשימוש בעבר, על פי פרוטוקול שפורסם על ידי Seibertz et al.30. כדי לסייע בפתרון בעיות, טבלה 7 מציגה בעיות בידוד נפוצות וכיצד לגשת אליהן.
יחד, פרוטוקול הבידוד המתואר מציע גישת עבודה לבידוד בו זמנית של קרדיומיוציטים פרוזדוריים וחדריים, ומאפשר לחוקר להשיג פנוטיפ אלקטרופיזיולוגי פרוזדורי וחדר של עכבר יחיד. זה מסיר מכשולים סטטיסטיים שמציבים פרוטוקולי בידוד קודמים המבודדים רק תאים פרוזדוריים או חדריים באיכות גבוהה ומסייע להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר ספציפי. זה יכול להיות חשוב במיוחד אם התערבויות, כמו למשל השתלת משאבות אוסמוטיות מלאות בחומרים יקרים, הן חלק מהניסויים וזה יכול להיות גורם חיוני בשיקולי רווחת בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG; תוכנית מדען קליני ברפואת כלי דם (PRIME), MA 2186/14-1 לפ' טומסיץ וד' שוטלר; VO1568/3-1, IRTG1816 ופרויקט SFB1002 A13 עד N. Voigt), קרן המחקר הגרמנית תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה (EXC 2067/1- 390729940 ל- N. Voigt), המרכז הגרמני למחקר קרדיווסקולרי (DZHK; 81X2600255 ל- S. Clauss ו- N. Voigt; 81Z0600206 ל- S. Kääb), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. Clauss), ERA-NET למחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל- S. Clauss), קרן היינריך-ולוטה-מילפנצל (ל-S. Clauss) וקרן Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 ל-N. Voigt). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D.
- Schüttler, D., et al.
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
