Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca²⁺ и кальциевого тока L-типа

Сердечные аритмии являются распространенным явлением и одной из основных проблем здравоохранения в настоящее время, поскольку они затрагивают миллионы людей во всем мире. Аритмии связаны с высокой заболеваемостью и смертностью ^1,2 и представляют собой основную причину большинства внезапных сердечных смертей³. Современные варианты лечения улучшили выживаемость пациентов, но по-прежнему в основном являются симптоматическими методами лечения, а не нацелены на основные механизмы. Таким образом, эти методы лечения имеют ограниченную эффективность и часто могут вызывать серьезные побочные эффекты ^4,5,6. Улучшение существующих вариантов лечения требует понимания лежащей в основе патофизиологии, что создает потребность в подходящих моделях для изучения. Модели мелких животных - и особенно модели мышей - играют решающую роль в исследованиях аритмии, поскольку они позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза, например, генетическое влияние на клеточную электрофизиологию, функцию ионных каналов или обработку кальция ^7,8.

Для этого требуются изолированные предсердные и желудочковые кардиомиоциты достаточного количества и жизнеспособности. Ранее был описан широкий спектр различных подходов к выделению для получения предсердных и желудочковых миоцитов 9,10,11,12,13^, а некоторые группы представили данные одновременных измерений кальциевых переходных процессов L-типа и кальциевых токов либо из предсердий 14, либо из желудочков ¹⁵ мышиные кардиомиоциты. Однако, насколько нам известно, нет данных об измерениях предсердий и желудочков у одного животного. Исследователи сосредотачиваются на широком спектре тем, начиная от электрофизиологии и заканчивая протеомикой, функциональными исследованиями, такими как сократимость клеток или белковые взаимодействия, функция митохондрий или генетика - все это нуждается в изолированных кардиомиоцитах. Таким образом, многие из опубликованных протоколов не были специально разработаны для исследований пластырного зажима, что приводит к ограниченному выходу и недостаточному качеству клеток для исследований пластырного зажима. Таким образом, одновременные пластырные зажимы и кальциевые переходные измерения клеток предсердий и желудочков, выделенных от одного животного, не могут быть выполнены с установленными протоколами.

Выделение мышиных, особенно предсердных, миоцитов для экспериментов с пластырем остается сложной задачей. В этой статье представлен простой и быстрый метод выделения высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа, который впоследствии позволяет одновременно измерять как чистый мембранный ток, так и ток-индуцированные кальциевые переходные процессы у одного животного. В данной статье разработан протокол выделения предсердных и желудочковых миоцитов, полученных от мышей дикого типа и мышей, несущих генетические мутации. Этот протокол можно использовать как для самцов, так и для самок мышей. Выделение миоцитов, изображения и репрезентативные результаты, описанные ниже, были получены от мышей дикого типа C57Bl/6 в возрасте 6 (± 1) месяцев. Тем не менее, этот протокол успешно используется для мышей в разном возрасте от 2 до 24 месяцев с разными генотипами. На рисунке 1 показана установка изоляции и крупный план канюлированного сердца во время ферментной перфузии.

Все процедуры на животных были одобрены Советом по надзору за животными Нижней Саксонии (LAVES, AZ-18/2900) и проводились в соответствии со всеми институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию животных.

1. Предварительные договоренности

1. Приготовьте 1 л 10-кратного перфузионного буфера (Таблица 1), 500 мл 1-кратного перфузионного буфера (Таблица 2), 50 мл буфера для разложения (Таблица 3), 10 мл стоп-буфера (Таблица 4), 1 л раствора Тирода (Таблица 5), 10 мл каждого раствора на стадии кальция (раствор Тирода с глюкозой и соответствующим количеством кальция, как указано), 1 л раствора 4-АП (таблица 5), 100 мл раствора пипетки (таблица 6) и 5 мл плюроновой кислоты согласно предоставленным рецептам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы для ванн (Тирод и раствор 4-АП) можно приготовить заранее (без глюкозы) и хранить при температуре +4 °С, глюкозу добавляют в день эксперимента. Раствор пипетки можно хранить при -20 °C, в день эксперимента добавляют кальциевый индикатор, а затем хранят раствор на льду до дальнейшего использования. 10-кратный буфер для перфузии можно хранить при комнатной температуре, 1-кратный буфер для перфузии, буфер для разложения и буфер для остановки должны быть свежеприготовлены в экспериментальный день.
2. Включите водяную баню и роликовый насос.
3. Аппарат Лангендорфа с перфузионным буфером; Убедитесь, что он свободен от воздуха.
4. Подготовьте канюлю аорты, зафиксировав ее под диссекционным микроскопом, соедините со шприцем объемом 1 мл, наполненным буфером для перфузии, и очистите канюлю воздухом, промыв канюлю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно избегать попадания воздуха внутрь перфузионной системы, так как это напрямую повлияет на коронарную перфузию и, следовательно, на эффективность пищеварения. При необходимости к установке может быть добавлена пузырьковая ловушка, чтобы безопасно избежать захвата воздуха.
5. Подготовьте чашки Петри с достаточным количеством перфузионного буфера для забора органов и микроскопии (буфер должен надежно покрывать весь орган, нескольких миллилитров - в зависимости от размера используемой чашки Петри - должно быть достаточно).
6. Подготовьте 3 чашки Петри с буфером для разложения для диссоциации тканей и микроскопии, буфер должен покрывать орган для вскрытия под микроскопом в пределах соответствующей чашки Петри, количество зависит от размера используемой чашки Петри. Для диссоциации используют 3 мл для ткани желудочка и 1,5 мл для ткани предсердий.

2. Извлечение органов

1. Введите мышке 0,1 мл гепарина (1000 ЕД / мл) внутримышечно с помощью шприца объемом 1 мл с канюлей 27 г и подождите 5-10 минут.
2. Поместите мышь в индукционную камеру вместе с небольшой тканью, пропитанной примерно 500 мкл изофлурана. Животное не должно соприкасаться с тканями. Чтобы избежать этого, можно использовать пластиковую кассету для биопсии, чтобы покрыть ткань. После того, как животное будет полностью обезболено, проверьте рефлекс защемления пальцев ног и, как только его больше нет, быстро усыпьте мышь вывихом шейки матки.
3. Поместите мышь на платформу на спину (например, на пенополистирол, покрытый бумажным полотенцем) и зафиксируйте лапы канюлями, чтобы удерживать ее на месте.
4. Удалите мех и кожу, покрывающие грудь и часть живота, с четким разрезом от jugulum к симфизу, и вскройте живот прямо под мечевидной костью, не повреждая структуру органа с помощью ножниц. Поднимите грудину хирургическими щипцами и разрежьте ножницами диафрагму по краю ребер, затем разрежьте ребра по медиальной подмышечной линии и удалите грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
5. Осторожно удалите перикард с помощью тупых щипцов и быстро удалите сердце, приподняв его тупыми щипцами снизу и разрезав крупные сосуды одним единственным разрезом с помощью ножниц.
6. Поместите сердце в перфузионный буфер комнатной температуры и как можно быстрее канюлизируйте аорту иглой с тупым концом под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите любую легочную ткань и жировую ткань, прикрепленную к органу, не теряя на это слишком много времени. Во время канюляции убедитесь, что конец иглы не проходит через аортальный клапан, так как это ухудшит результаты, предотвращая попадание буферов в коронарные артерии.
7. Плотно привяжите сердце кусочком шовного шелка к игле и отсоедините от шприца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура от извлечения сердца (момента, когда перерезаны крупные сосуды) до ушивания аорты иглой должна занимать как можно меньше времени. Рекомендуется не занимать более 90-180 секунд от удаления сердца до начала перфузии.

3. Ферментативное пищеварение

1. После канюляции аорты немедленно подключите канюлированное сердце к аппарату Лангендорфа, избегая попадания воздуха в систему.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может помочь наличие подвесной капли перфузионного буфера в нижней части аппарата Лангендорфа, а также капли перфузионного буфера, расположенного на верхней части иглы, чтобы избежать попадания воздуха в систему.
2. Перфузию сердца перфузионным буфером в течение 1 мин при температуре ровно 37 °C и скорости перфузии ровно 4 мл/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы температура на кончике перфузионной иглы составляла 37 °C, температура водяной бани должна быть установлена немного выше примерно 40 °C. Это следует регулярно проверять, измеряя температуру на перфузионном кончике.
3. Переключите перфузию на буфер для разложения и перфузию в течение ровно 9 минут при температуре ровно 37 °C и скорости перфузии ровно 4 мл/мин.
4. Переложите переваренное сердце в чашку Петри с достаточным буфером для пищеварения, чтобы оно было полностью покрыто. Затем тщательно препарируют предсердия и желудочки под микроскопом.
5. Перенесите предсердия в чашку Петри с 1,5 мл буфера для пищеварения, а желудочки - в другую чашку Петри с 3 мл буфера для пищеварения.
6. Расслоение предсердий
   1. Аккуратно, но не теряя времени, раздвиньте предсердия на мельчайшие кусочки с помощью тупых щипцов.
   2. Растворите ткань, осторожно пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1,000 мкл, который предварительно был разрезан, чтобы расширить отверстие наконечника.
   3. Перенесите раствор в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте эквивалентное количество стоп-буфера (1,5 мл), осторожно пипеткой вниз сбоку от пробирки, чтобы закончить реакцию.
   4. Осторожно пропустите все 3 мл клеточных/тканевых растворов через нейлоновую сетку 200 мкм, чтобы удалить оставшиеся более крупные кусочки ткани, которые не были полностью переварены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное пищеварение почти не оставит твердых кусков.
7. Диссекция желудочков
   1. Быстро измельчите желудочковую ткань на мелкие кусочки с помощью ножниц для рассечения и пипетки вверх и вниз, чтобы растворить. Используйте другой наконечник пипетки объемом 1,000 мкл для пипетки вверх и вниз, его можно укоротить, чтобы расширить отверстие.
   2. Перенесите клеточный/тканевый раствор в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте эквивалентное количество стоп-буфера (3 мл), осторожно пипетировав сбоку пробирки, чтобы закончить реакцию.
   3. Осторожно пропустите все 6 мл клеточного/тканевого раствора через нейлоновую сетку размером 200 мкм, чтобы удалить более крупные кусочки ткани, которые не были полностью переварены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное пищеварение почти не оставит твердых кусков.
8. Оставьте обе трубки (суспензию предсердных и желудочковых клеток) на скамье при комнатной температуре на 6 минут для отстаивания.
9. Центрифугируйте обе пробирки по 15 мл в дозе 5 x g в течение 2 мин.

4. Реинтродукция кальция

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги идентичны как для предсердных, так и для желудочковых клеток (если не указано иное) и выполняются при комнатной температуре.

1. Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью пластиковой пипетки Пастера и осторожно ресуспендируйте гранулы в 10 мл раствора Tyrode, не содержащего кальция.
2. Оставьте клетки на 8 мин для отстаивания.
3. Центрифуга в дозе 5 х г в течение 1 мин (только предсердные клетки, для желудочковых клеток достаточно седиментации).
4. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулы в 10 мл раствора Tyrode с концентрацией кальция 100 мкМ.
5. Оставьте клетки на 8 мин для отстаивания.
6. Центрифуга в дозе 5 х г в течение 1 мин (только предсердные клетки, для желудочковых клеток достаточно седиментации).
7. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулы в 10 мл раствора Tyrode с концентрацией кальция 400 мкМ.
8. Оставьте клетки на 8 мин для отстаивания.
9. Центрифуга в дозе 5 х г в течение 1 мин (только предсердные клетки, для желудочковых клеток достаточно седиментации).
10. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу в 1 мл (предсердие) / 5 мл (желудочковый) раствора Тирода с концентрацией кальция 1 мМ.

5. Загрузка миоцитов флуоресцентным кальциевым индикатором Флуо-3 АМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за светочувствительности флуоресцентного кальциевого индикатора следующие шаги следует выполнять в защищенном от света (например, накрыв трубки алюминиевой фольгой).

1. Приготовьте исходный раствор Fluo-3 AM, добавив 44 мкл 20% плюронового F-127 в безводном ДМСО к 50 мкг Fluo-3AM (можно хранить при -20 °C в защищенном от света месте).
2. Добавьте 10 мкл исходного раствора Флуо-3 АМ к 1 мл клеточной суспензии и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
3. Центрифуга в дозе 5 х г в течение 1 мин.
4. Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью пластиковой пипетки Пастера и ресуспендируйте гранулы в разумном количестве раствора для ванны, чтобы получить хорошую рабочую концентрацию (1-5 мл раствора для ванны в зависимости от плотности клеток).
5. Оставьте на 30 минут для деэтерификации перед началом экспериментов.

6. Одновременные измерения патч-зажима и эпифлуоресцентного переходного процесса Ca²⁺, как описано ранее¹⁶

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения пластыря не являются темой данной статьи, заинтересованный читатель может обратиться к основным публикациям, содержащим подробное описание этого метода 17,18,19,20,21,22. Тем не менее, для лучшего общего понимания приводится краткое изложение протокола измерения кальциевых токов L-типа вместе с индуцированными током кальциевыми переходными процессами.

1. Переносят миоциты в клеточную камеру и переплавляют раствором для ванны при 37 °C.
2. Блокируйте токи калия, добавляя 4-аминопиридин и хлорид бария в раствор для ванны, как указано в таблице 5.
3. Убедитесь, что боросиликатные микроэлектроды имеют сопротивление наконечника 2-5 МОм, заполненные раствором пипетки (таблица 6).
4. Настройка измерений позволяет одновременно регистрировать как электрические сигналы, так и эпифлуоресценцию. Режим зажима напряжения используется для измерения тока Ca²+ L-типа с протоколом, удерживающим ячейку на -80 мВ и импульсом от 600 мс до -40 мВ для инактивации быстрого тока Na⁺, за которым следует испытательный импульс 100 мс до +10 мВ при 0,5 Гц (рис. 2).
5. Используйте возбуждение при длине волны 488 нм, излучаемый свет при длине волны <520 нм для обнаружения и преобразования в [Ca²⁺]I, предполагая_, что
   
   где k_d = константа диссоциации флуоресценции-3 (864 нМ), F = флуоресценция флуоресценции-3; F_max =^Ca2+-насыщенная флуоресценция, полученная в конце каждого эксперимента¹⁹.

Выход выделения определяют после повторного введения кальция путем пипетки 10 мкл клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа. Более 100 жизнеспособных, палочковидных, несокращающихся клеток / 10 мкл для выделения предсердных клеток и более 1000 жизнеспособных палочковидных, несокращающихся клеток / 10 мкл для выделения желудочковых клеток считаются достаточным выходом и обычно получают с использованием этого протокола. Клетки предсердий, полученные с помощью этого протокола, показали множество различных типов клеток, содержащих клетки проводящей системы сердца, особенно синусового узла, а также различные миоциты из правого и левого предсердий, а также придатков предсердий. Поскольку эти области не препарируются по отдельности, результатом являются различные морфологии клеток. Все ячейки предсердий маленькие, с емкостью ячейки в диапазоне примерно от 35 пФ до 100 пФ, некоторые из них более нитевидные, чем другие. На рисунке 3 на панели А показана типичная клетка рабочего миокарда предсердий, загруженная чувствительным к кальцию красителем, готовая к измерениям, полученным с помощью этого протокола. Миоциты желудочков имеют более палочковидную форму и больше по размеру с емкостью клеток в диапазоне от 100 до примерно 400 пФ, на рисунке 3 на панели B показана типичная желудочковая клетка из работающего миокарда, загруженная чувствительным к кальцию красителем, готовая к измерениям, полученным с помощью этого протокола. На рисунке 4 показаны репрезентативные примеры измерений кальциевого тока L-типа с одновременными цитозольными кальциевыми переходными процессами из одного миоцита предсердий (панели B и C) и одного миоцита желудочков (панели E и F).

Рисунок 1: Аппарат Лангендорфа. (A) Фотография изолирующей установки с видом специально разработанного теплообменника и сердечной камеры с рубашкой. (B) Крупный план камеры сердца в рубашке с канюлированным сердцем на месте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Протокол стимуляции. Протокол зажима напряжения (0,5 Гц), используемый для измерения общего чистого мембранного тока (I_M), преимущественно отражающего ток Ca 2+ L-типа и переходный процесс Ca²+, индуцированный током Ca²⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изолированные мышиные кардиомиоциты. (A) Пример предсердного кардиомиоцита, загруженного Fluo-3, готового к экспериментам с пластырем. (B) Пример желудочкового кардиомиоцита, загруженного Fluo-3, готового к экспериментам с пластырем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные записи. (A) Протокол зажима напряжения (0,5 Гц). (B) Общий чистый мембранный ток (I_M), преимущественно отражающий ток Ca²⁺ L-типа в миоците предсердий мыши. (C) Ток Ca 2+ L-типа вызвал переходный Ca²⁺ в миоците предсердий мыши. (D) протокол зажима напряжения (0,5 Гц). (E) Общий чистый мембранный ток (I_M), преимущественно отражающий ток Ca²⁺ L-типа в миоците желудочка мыши. (F) Ток Ca 2+ L-типа вызвал переходный Ca²⁺ в миоците желудочка мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: 10-кратный перфузионный буфер (1,000 мл).

Таблица 2: 1x перфузионный буфер (500 мл).

Таблица 3: Буфер для пищеварения (50 мл).

Таблица 4: Стоп-буфер (10 мл).

Таблица 5: Растворы для ванн.

Таблица 6: Раствор для пипеток.

Таблица 7: Распространенные проблемы и способы их решения.

В этой статье представлен простой и функциональный способ получения высококачественных миоцитов предсердий и желудочков от одной и той же мыши для исследований с помощью пластыря с одновременными записями переходных процессов кальция. Качество полученных данных сильно зависит от качества выделения клеток. Как уже говорилось выше, ранее было описано множество методов выделения мышиных кардиомиоцитов 9,10,11,12. Изолированные клетки используются для различных анализов, начиная от экспериментов с пластырем и заканчивая исследованиями сократимости, морфологическими исследованиями, протеомикой, исследованиями функции митохондрий и многим другим. Для каждой отдельной цели требуются изолированные клетки, оптимизированные по-разному. Из-за этого ни один из протоколов не привел к получению высококачественных выделений, пригодных для экспериментов с пластырем с одновременным измерением свойств обработки кальция предсердными и желудочковыми миоцитами у одной мыши. Чтобы изменить это, адаптация многочисленных протоколов, описанных ранее, привела к разработке этого протокола. Некоторые шаги являются механически сложными, некоторые должны быть выполнены определенным образом, а некоторые просто имеют решающее значение для качества изоляции. Эти шаги будут рассмотрены ниже.

Выход и качество выделения клеток снижаются с возрастом животных, возможно, из-за увеличения фиброза тканей 11,23,24, что делает необходимой индивидуальную корректировку времени пищеварения и количества ферментов. Чем старше животное, тем больше фиброзной ткани следует ожидать. Указанное время пищеварения и количество ферментов являются хорошей отправной точкой для здоровых мышей нормального размера в возрасте 6 месяцев, но им потребуется адаптация к индивидуальным потребностям. Предполагается применять больше ферментов и более длительное время пищеварения при использовании старых мышей или трансгенных мышей, способствующих фиброзу. Как подчеркивалось в предыдущей работе, быстрая и безвоздушная канюляция, а также немедленная перфузия сердца абсолютно необходимы для хорошего качества клеток¹¹. Рекомендуется не занимать более 90-180 секунд с момента извлечения сердца и помещения его в буфер для перфузии комнатной температуры до начала перфузии - чем быстрее, тем лучше. Полезно установить все необходимое оборудование в одной комнате, чтобы избежать больших расстояний. Если желательно дальнейшее укорочение ишемического интервала, можно использовать другой метод наркоза и последующей эвтаназии. Полностью обезболите животное, как описано выше, нанесите достаточное количество фентанила (или эквивалентного обезболивающего препарата в соответствии с вашими рекомендациями по благополучию животных) и переместите животное на платформу с испарителем изофлурана и маской для анестезии, подходящей для мышей, обеспечивая постоянный поток изофлурана и кислорода. После этого действуйте, как описано выше. Поскольку животное имеет нормальное кровообращение до тех пор, пока крупные сосуды не будут отсоединены одним разрезом, этот метод значительно сократит время отсутствия потока и, таким образом, может улучшить качество изоляции при необходимости.

После забора сердца очень важно поместить канюлю аорты на нужную глубину, чтобы обеспечить коронарную перфузию. Поэтому при удалении сердца необходимо разрезать аорту в дуге аорты или в нисходящей аорте, чтобы оставить не менее 5 мм аорты для канюляции, что позволит связать шовный шелк дистальнее коронарных артерий, но до первых боковых ветвей аорты.

В процессе изоляции необходимы множественные переносы клеток, а пипетирование с небольшими наконечниками пипеток вызовет высокое напряжение сдвига в клетках. Возможными решениями для снижения напряжения сдвига являются медленное и осторожное пипетирование, а также обрезка наконечников пипеток на несколько миллиметров под углом 45° для расширения отверстия наконечника. Дальнейшее снижение напряжения сдвига может быть достигнуто путем расплавления разрезанных наконечников пипеток для размягчения краев. Выход изоляции желудочковой изоляции обычно настолько высок, что снижение напряжения сдвига не является обязательным. В зависимости от индивидуальной цели, может быть даже более полезным подвергать желудочковые клетки стрессу сдвига, чтобы выбрать «наиболее приспособленные» клетки. Однако для изоляции предсердий эта процедура имеет решающее значение, так как клетки предсердий особенно уязвимы после пищеварения. При добавлении растворов рекомендуется избегать пипетки непосредственно на клетки, а лучше пытаться медленно проводить пипетку на стенке трубки.

Выбор коллагеназы существенно повлияет на результаты выделения. Поскольку существуют не только различия в ферментных препаратах, но и соответствующие вариации активности ферментов от партии к партии, титрование количества коллагеназы и времени переваривания необходимо при начале работы с новой партией фермента или новым штаммом мышей. Тем не менее, количество и время, указанные в приведенных выше таблицах, являются хорошей отправной точкой для индивидуальной оптимизации⁹. Большинство компаний предоставляют небольшие образцы ферментов для тестирования отдельных партий, что делает выбор партии намного более удобным.

Переходные процессы кальция с типичными амплитудами и нормальным монофазным распадом могут быть получены, если клетки выделены без использования EGTA²⁵, как ранее описано Voigt et ^al.9,16. Таким образом, этот протокол использует низкие концентрации кальция и позволяет избежать EGTA в процессе изоляции. Чтобы защитить клетки от явления^{парадокса Ca 2+ 26}, кальций вводят поэтапно и медленно до конечной концентрации 1 мМ. Из-за более высоких внутриклеточных концентраций натрия кардиомиоциты грызунов особенно склонны к перегрузке кальцием, и медленная и ступенчатая реинтродукция имеет решающее значение²⁷. Потребность в растворах, не содержащих кальция, представляет собой одно из основных ограничений всех выделений кардиомиоцитов грызунов на основе Лангендорфа. Повторное введение кальция всегда приводит к значительной потере жизнеспособных клеток. Тем не менее, медленная и ступенчатая реинтродукция, как описано здесь, приводит к достаточному выходу с хорошим качеством для надежного получения измерений от каждого животного.

Важно оценить выход и качество клеток сразу после повторного введения кальция. Несмотря на то, что окончательная оценка проводится при исправлении изолированных клеток, уже можно судить о количестве и качестве клеток, заглянув под микроскоп перед загрузкой клеток чувствительным к кальцию красителем. Клетки хорошего качества имеют четкую палочковидную форму, имеют однородную мембрану и не сжимаются. Сокращение является признаком низкого качества клеток, поскольку указывает на потерю целостности мембраны и может быть вызвано чрезмерным перевариванием или применением высокого напряжения сдвига. Еще одним признаком переваривания является - помимо множества клеточных теней по отношению к жизнеспособным клеткам - чрезмерно красивая мембрана, которая была очищена от многих поверхностных белков и чрезвычайно уязвима, когда кто-то пытается приблизиться к клетке с наконечником пипетки для образования тюленя. Примеры здоровых клеток хорошего качества показаны на рисунке 3. (Панель А: миоцит предсердий, Панель Б: миоцит желудочков). Выделения с высоким выходом могут привести к тому, что клетки будут невосприимчивы к образованию уплотнений, и наоборот. В конце концов, окончательный тест качества, независимо от внешнего вида и выхода клеток, является ответом на простой вопрос: «Можно ли выполнить желаемые измерения с высококачественными результатами в изолированных клетках каждого изолятора?». Протокол, приведенный выше, делает возможным положительный ответ.

Во многих протоколах изоляции используется разъединяющий агент блеббистатин для получения более высоких выходов и лучшего качества клеток. Этот протокол намеренно избегает блеббистатина, принимая во внимание опубликованные данные о его влиянии на электрофизиологию сердца^28,29 в экспериментах по оптическому картированию. К использованию разъединяющих агентов в электрофизиологических исследованиях следует относиться с осторожностью и ограничивать обстоятельствами, когда разъединение является обязательным.

Клетки, полученные с помощью этого протокола, можно использовать в течение примерно шести часов после загрузки Fluo-3, при этом предсердные клетки более уязвимы ко времени. Следовательно, рекомендуется изучать клетки предсердий до желудочковых клеток, если их обрабатывает тот же исследователь.

Одним из ограничений этого протокола, как и для большинства протоколов изоляции на основе Лангендорфа, является то, что он технически сложен. Понятно, что мышиные сердечки маленькие, и все технические аспекты требуют много упражнений. Это означает, что опытный исследователь получит лучшие результаты. Некоторые протоколы используют постоянное давление для перфузии сердца. Это имеет то преимущество, что из-за переваривания и последовательной потери сопротивления тканей перфузия ускоряется, и это помогает определить оптимальное время переваривания, тем не менее, ускорение может нанести вред ткани и значительно снизить качество клеток. В подходе с постоянным потоком, используемом здесь, нет четких ориентиров для времени переваривания, и часто бывает трудно остановить переваривание в оптимальное время, что знаменует собой соответствующее ограничение. Другим ограничением является то, что в этом протоколе изолированные клетки были проверены только на пригодность к экспериментам, описанным выше. Вполне вероятно, что эти клетки могут быть использованы и для различных анализов, но это еще предстоит доказать. Первым шагом в этом направлении было использование этих ячеек для визуализации потенциалов действия путем загрузки их VF2.1CI, недавно полученным красителем чувствительности к напряжению с превосходной кинетикой по сравнению с ранее использовавшимися чувствительными к напряжению красителями в соответствии с протоколом, опубликованным Seibertz et ^al.30. Чтобы помочь в устранении неполадок, в таблице 7 показаны распространенные проблемы изоляции и способы их решения.

В совокупности описанный протокол изоляции предлагает рабочий подход к одновременному выделению предсердных и желудочковых кардиомиоцитов мышей, что позволяет исследователю получить электрофизиологический фенотип предсердий и желудочков одной мыши. Это устраняет статистические препятствия, связанные с предыдущими протоколами изоляции, выделяющими только предсердные или желудочковые клетки с высоким качеством, и помогает уменьшить количество животных, необходимых для конкретного исследования. Это может быть особенно важно, если вмешательства, такие как, например, имплантация осмотических мини-насосов, заполненных дорогостоящими агентами, являются частью экспериментов, и это может быть жизненно важным фактором в соображениях благополучия животных.