Photostimulation av Femtosecond laser aktiverar extracellulär-signalreglerade Kinas (ERK) signalering eller mitokondriella händelser i målceller

Tekniken för att kontrollera cellulära signalmolekyler är en viktig del av utvecklingen av Life Science. Traditionellt, den mest använda metoden är biokemisk behandling av droger eller biologiska material^1,2,3. Under det senaste decenniet öppnar uppfinningen av optogenetik en ny era för cellulära molekylära signal modulering. Transfektion med ljuskänsliga proteiner genom genteknik gör att ljus blir ett kraftfullt verktyg för att modulera olika protein aktiviteter i målcellen. Denna teknik har gjort uppmuntrande framsteg såsom excitation och hämning av neurala signal, främja genuttryck, manipulera cellulära signal mönster, ledande olika cell öden och patologisk utredning^{4,5 ,6,7,8,9}. Men ljus kan bara fungera genom att transfecting celler med optogenetiska proteiner. I nuvarande skede finns det sällsynta metoder som gör det möjligt för ljus att kontrollera cellulära molekyler direkt förutom optogenetik.

Femtosecond laser har avancerade biologiska undersökningar genom att ge effektiv multiphoton excitation samtidigt bibehålla god biologisk säkerhet. Genom att distribuera olika strategier Foto bearbetning, har det insett många prestationer såsom multiphoton mikroskopi, microsurgeries och multiphoton optogenetiska tillämpningar^{10,11,12,13 ,14,15,16}. Nyligen undersökningar visar att femtosecondlaser laserstimulering har visats som en mycket effektiv optisk metod för att direkt inducera molekylära signal händelser. Det har visat sig att tätt fokuserad femtosecondlaser laser bestrålning på endoplasmatiska Retikulum (ER) kan tömma kalcium i ER och aktivera kalcium-release-aktiverade kalcium (CRAC) kanaler för att bilda kalcium signaler i celler¹⁷. Denna fotoaktiverade kalcium signal kan spridas mellan olika typer av celler^18,19,20. Dessutom, det har också förmågan att aktivera cell signalering vägar såsom nukleär faktor aktiverade T-celler (NFAT) och erk signalering väg^21,22. Genom att justera intensitet och lokalisering av femtosecondlaser laser exponering i celler, till exempel, att fokusera lasern på mitokondrien, det kan påverka mitokondriell morfologi och molekylära händelser^{23,24, 25}. specifikt, utbrott av mitokondriell ros generation kan vara upphetsad av photostimulation, som är märkt som fluorescerande blixtar i mitokonan (mitoblixtar).

Därför är fotostimuleringstekniken av god potential att allmänt tillämpas i relaterad biologisk forskning. Det är också en god chans att förlänga femtosecondlaser laserapplikationer i kontroll av cellulära signalmolekyler och funktioner förutom mikroskopi. Här ger vi de tekniska detaljerna i photostimulation. Den photostimulation uppnås genom att koppla en femtosecondlaser laser till ett konfokala Mikroskop för att ge enda målcellen med en kort blixt photostimulation. Det kan initiera effektiv och kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Om photostimulation ligger på mitokondriell tubulär struktur, mitokondriella membranet potential, morfologi, ROS, och permeabilitet övergången porer, kan alla styras av photostimulation. Baserat på denna photostimulation system, ger vi en detaljerad metod för att aktivera ERK signalering väg och påverka flera mitokondriella händelser i hela celler. Detta protokoll belyser processen för att leverera femtosecondlaser laserstimulering till målceller.

Photostimulation systemet är etablerat på ett konfokala Mikroskop med en femtosecondlaser laser koppling i den för samtidig stimulering och kontinuerlig mikroskopi. Den femtosecondlaser laser (våglängd: 1 040 nm, repetitionshastighet: 50 MHz, pulsbredd: 120 FS, maximal effekt genomsnittlig effekt: 1 W) är uppdelad i två balkar innan kopplingen. En styrs genom ett relä teleskop som består av ett par linser. Det återspeglas sedan direkt i back-bländare av ett mål (60x, N.A. = 1,2, vatten nedsänkning) att bilda en diffraktion-Limit fokus (Stim-A). Den andra reflekteras till scanning optiska vägen av konfokalmikroskopi Mikroskop att arbeta som en två-Photon scanning mode (Stim-B). Stim-A presenterar en fast fokuspunkt i mitten av synfält (FOV). Stim-B är en fördesignad partiell konfokal scanning område i FOV. Stim-A och stim-B visas i figur 1a. En CCD-kamera under Dichroic Mirror (DM) ger ljus-fält Imaging för övervakning i fokus för femtosecondlaser laser.

Det finns några viktiga nödvändigheter för följande experiment. I detta protokoll används en femtosecondlaser fiber laserkälla (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) som ett exempel. I praktiken kan de flesta kommersiella femtosecondlaser oscillatorer användas så länge pulsen bredden är kortare än 200 FS och toppeffekt tätheten bör vara över nivån på 10¹¹ ~ 10¹² W/cm². Till exempel, en TI: Sapphire laser som vanligtvis används för multiphoton mikroskopi kan ersätta den femtosecondlaser lasern visade i figur 1b. Lasern makt och några andra photostimulation parametrar måste trimmas eftersom de optiska parametrarna (pulsbredd, våglängd, och upprepning hastighet) varierar mycket i olika femtosecondlaser lasrar som därmed inducera olika multiphoton excitation effektivitetsvinster.

Tillsammans med femtosecondlaser laserstimulering ger konfokalmikroskopi kontinuerlig cell avbildning för att övervaka molekylär dynamik i realtid i både Stim-A och stim-B-lägena. Båda fotostimuleringsscheman (Stim-A och stim-B) styrs av en mekanisk slutare med millisekunders upplösning (figur 1).

I stim-A-läge, är placeringen av laser fokus fast i mitten av FOV. Ett relä teleskop används för att säkerställa fokus för femtosecondlaser laser ska placeras på konfokalmikroskopi Imaging planet genom att trimma avståndet mellan två linser i vertikal riktning (laser spridnings riktningen, vertikal till konfokala avbildning planet, som visas i Figur 1). Vid Bright-Field avbildning av CCD-kamera, kan diametern på laser fokus mätas (~ 2 μm, figur 2b). Stimuleringens varaktigheter och exponeringstider styrs av en slutare under den konfokala avbildningsprocessen.

I stim-B-läget kan stimuleringsområdet förhandstilldelas manuellt i konfokalmikroskopi Imaging kontrollerande programvara till någon form som linje, polygon eller cirkel. Slutaren synkroniseras med den konfokala skanningsprocessen. Det öppnar på pre-designade tid som är inställd genom konfokalmikroskopi Imaging kontrollerande programvara. Då är stimulering området skannas av femtosecondlaser laser som konfokal mikroskopi. Således är provet endast stimuleras av femtosecondlaser laser när konfokala skanningsprocessen går in i en given bildruta.

Fotostimuleringssystemet kan fastställas på både inverterade och upprätt metallurgiska Mikroskop enligt försökspersonerna. In vitro-celler odlade i petriskålar är bättre att arbeta med inverterade Mikroskop. Djur, särskilt hjärnor av levande djur, är mer lämpade med upprätt Mikroskop. I denna studie tar vi det inverterade mikroskopet som ett exempel. Det bör noteras att omslaget till petriskål inte öppnas under hela experiment.

Försiktighet: Protokollet som presenteras nedan innebär att använda NIR femtosecondlaser laser och giftiga kemikalier. Vänligen uppmärksamma alla möjliga skador som induceras av experiment förfaranden. Läs säkerhetsdatabladen för alla relevanta kemikalier eller annat material före användning. Vänligen Följ säkerhetsanvisningarna för laseranläggningar eller konsultera proffs för vägledning innan du använder laserkälla.

1. experimentell förberedelse

1. Ställa in fotostimuleringssystem
   Anmärkning: Systemet består av en femtosecondlaser laser och en laser (vid synligt område för fluorescensexcitation) scanning konfokala Mikroskop. I figur 1används en fiber femtosecondlaser laser (1 040 nm, 50 MHz, 120 FS, 1 W) för koppling. Parametrarna är inte fasta eller nödvändiga. Den kan ersättas med en TI: Sapphire laser eller andra kommersiella femtosecondlaser oscillatorer i NIR sortiment.
   1. Ställ in den femtosecondlaser lasern och det konfokala mikroskopet.
      Anmärkning: Ange femtosecondlaser lasereffekt på en låg nivå (~ 50 mW) i processen att justera den optiska banan.
   2. Använd reflekterande speglar (RM1 och RM2 visade i figur 1b) att direkt femtosecondlaser laserstråle genom en mekanisk slutare. Öppna slutaren.
   3. Ställ en 50/50 balk splitter (BS, figur 1b) att dela femtosecondlaser laserstrålen i två separata balkar (Transmission beam och reflektion balk). Steer RM2 och BS för att göra femtosecondlaser laserstrålen sammanfaller med skanning laserstrålen.
      Anmärkning: (1) en referens Iris (Iris 1, figur 1b) bakom den långa pass Dichroic spegeln (DM, 700 nm cut-on våglängd, figur 1b) används för positionering skanning laser väg. (2) systemet kan endast fungera i stim-A-respektive Stim-B-läge. För Stim-A-läget kan BS tas bort. För Stim-B kan BS ersättas med en RM.
   4. Ställ in ett relä teleskop som består av ett par linser för att utöka överförings strålen bredd, som består med den bakre bländaren av målet.
      Anmärkning: (1) hänvisningen Iris 2 och 3 (figur 1b) är inställd på att kolliera den femtosecondlaser laserstrålen (figur 1b). (2) förstoringen av relä teleskopet beror på den ursprungliga diametern på femtosecondlaser laserstråle och diametern på bakre bländare av målet.
   5. Styr RMs (RM 3-5, figur 1b) för att anpassa den expanderade strålen till Mikroskop. Styr RM 4 och RM 5 för att finjustera fokus för femtosecondlaser laser till centrum av FOV.
   6. Mäta överförings effektiviteten av målet av den femtosecondlaser lasern.
      Anmärkning: Mät lasereffekten på Stim-A respektive Stim-B på grund av laserns olika penetrationsvägar i dessa två lägen. Det kommer att använda kraften på prov för att illustrera relaterade experiment procedurer nedan.
   7. Tune av slutaren, femtosecondlaser laser och konfokala Mikroskop tills experiment börjar.
      Anmärkning: I följande experiment fungerar inte Stim-A och stim-B tillsammans. Om du använder Stim-A måste den femtosecondlaser laserstrålen från Stim-B blockeras. Å andra sidan bör Stim-A-strålen blockeras om systemet fungerar på Stim-B-läget.
2. Förbered kultur mediet: Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) hög glukos med 10% foster bovin serum (FBS).
3. Förbered ERK2-GFP DNA plasmid, Mito-GFP DNA plasmid och mitokondriell Matrix-inriktning cirkulärt perdämpad gult fluorescerande protein (MT-cpYFP) DNA plasmid. Förvara plasmiderna vid-20 ° c tills de används.
4. Bered tetramethylrhodamin (TMRM, 100 μM) och Polyethylenimine (PEI 1 mg/mL). Förvara dem vid-20 ° c tills de används.
5. Förbered 5% paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100, anti-eIF4E (eukaryotisk översättnings start faktor 4E), antikropp (fosfor S209, 1 mg/mL), anti-Bax antikropp (1 mg/mL), anti-cytokrom C-antikropp (1 mg/mL), sekundär antikropp (anti-kanin IgG H & L, Alexa fluor 488, 1 mg/mL) och 1% BSA med 0,1% Tween20. Förvara dessa reagenser vid 4 ° c tills de används.
6. Förbered sterila material: cellkulturer flaskor, petriskålar med glas glida botten (figur 3a), rätter med en glasbotten, en tryckt 500 μm cell plats rutnät (figur 3b, att lokalisera de fotostimulerade celler), 1,5 ml och 10 ml rör, och 1 mL, 100 μL och 10 μL pipetter och spetsar.
7. Förbered standard cellodling laboratorieutrustning: en cellkultur inkubator inställd på 5% CO₂ och 37 ° c, och ett biologiskt säkerhetsskåp.

2. cell kultur och transfektion

Anmärkning: Hela cell (cell linje som härrör från livmoderhalscancer celler tas den 8 februari, 1951 från Henrietta saknar)²⁶ används som ett exempel i detta protokoll.

1. Cell passage
   1. Ta bort odlingsmediet från cell odlings flaskan som innehåller tillräckligt med celler.
   2. Tvätta flaskan med 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS.
   3. Tillsätt 1 mL trypsin långsamt och knacka lätt på flaskan. Sätt tillbaka flaskan i inkubatorn och inkubera cellerna 3 min vid 37 ° c.
   4. Ta bort trypsin. Tillsätt 2-3 mL odlingssubstrat. Pipettera mediet flera gånger för att hjälpa cellerna att lossna. Överför mediet med celler till en 10 mL tub.
   5. Ta 10 μL av provet från röret för cellräkning.
   6. Seed ~ 25 000 celler till en petriskål (figur 3a) och tillsätt odlingssubstrat upp till 1 ml.
   7. Sätt skålen innehöll celler tillbaka i inkubatorn. Inkubera cellerna 24 h vid 37 ° c före transfektion.
2. Cell transfektion
   1. Använd 0,5 μg DNA plasmid (ERK2-GFP, Mito-GFP eller MT-cpYFP) för transfektion per maträtt. Tillsätt 0,5 μg plasmid och 2,5 μg PEI i 50 μL DMEM i ett 1,5 mL-rör. Inkubera blandade medier 10 min vid rumstemperatur.
   2. Ta skålen med cellerna från inkubator. Ersätt odlingssubstrat med 1 mL DMEM.
   3. Tillsätt DNA/PEI blandade medier i cellerna droppe för droppe. Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn.
   4. Inkubera cellerna 3 h vid 37 ° c och ersätt DMEM DNA/PEI Mixed media med 1 mL odlingssubstrat.
   5. Inkubera transfekterade celler 24 h vid 37 ° c före photostimulation experiment.

3. aktivering av ERK2 genom Photostimulation av Femtosecond laser

1. Slå på femtosecondlaser laser och se till att slutaren är stängd.
2. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet och öppna Mikroskop programvaran. Ställ in magnetiseringen laser vid 488 nm. Ställ in effektnivån på 488 nm Laser på 0,1 mW. Ställ in bildstorlek som 512 x 512 pixlar. Ange intervalltid för varje pixel som 2,4 μs. Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor på 6 s för att minimera foto blekning och foto skador på celler. Ställ totalt bildrutor på runt 300 ramar för att ge ~ 30 min kontinuerlig mikroskopi i ett enskilt experiment.
   Anmärkning: Intervallet för två intilliggande ramar, totala bildrutor och avbildnings tiden för kontinuerlig mikroskopi kan justeras enligt experimentella krav. Om ett enskilt experiment varar över 2 timmar, ange inkubations systemet för CO₂ (visas i figur 4) för Mikroskop som finns i steg 3,3 för att ge miljön 5% Co₂ och 37 ° c för att bibehålla cellernas lönsamhet. Om ett enskilt experiment är begränsat inom 2 timmar är det inte nödvändigt med ett inkubations system för CO₂ .
3. Slå på inkuberingssystemet CO₂ , slå på alla värmare och Ställ in arbetstemperaturen vid 37 ° c. Vänta tills temperaturen går upp till 37 ° c och koncentrationen av CO₂ upp till 5%. Sätt inkubatorfasen på mikroskopet så som visas i figur 4a.
4. Förbered hela celler transfekterade med ERK2-GFP som beskrivs i steg 2.
   Anmärkning: I ett enskilt experiment tillämpas schemat Stim-A eller Stim-B för att leverera fotostimulering till celler. Steg 3,5 och 3,6 presenterar detaljerade steg under Stim-A respektive Stim-B.
5. Att leverera femtosecondlaser laserstimulering till målceller med hjälp av Stim-A-läge
   Anmärkning: Före fotostimuleringsproceduren, se till att diametern på fokus är runt 2 μm. Denna process beskrivs i steg 3.5.1 och 3.5.2.
   1. Ta skålen som innehåller celler transfekterade med ERK2-GFP från inkubator och sätta skålen på mikroskopet scenen.
   2. Starta snabbt skanningsläge genom programvaran Mikroskop drift. Finjustera målsättningen att förvärva tydliga fluorescerande bilder av celler. Stoppa snabb skanning. Växla till ljus fälts bilds läge med CCD-kameran (bild 2a). Öppna slutaren och justera avståndet mellan två linser av relä teleskopet för att säkerställa diametern på femtosecondlaser laser fokus att vara ~ 2 μm (figur 2b). Stäng slutaren för att slutföra justeringen.
      Anmärkning: En referenspil kan märkas för att indikera laser skärpan (figur 2). Under tiden kan en referenspil också ställa in i mitten av fluorescerande bildfönstret för att indikera placeringen av fokus femtosecondlaser laser.
   3. Ställ in kraften i femtosecondlaser laser på 15-40 mW (810 nm, 65 FS, 80 MHz), eller 20-60 mW (1040 nm, 120 FS, 50 MHz) på preparatet. Ställ in öppningstiden för slutaren på 0,05-0,2 s.
   4. Använd snabb scanning läge för att välja en mål cell väl uttryckt ERK2-GFP.
   5. Flytta scenen för att lokalisera Cytosol området i den valda målcellen i mitten av FOV under ljus-fält avbildning av CCD-kameran (figur 2A).
   6. Klicka på Start bottom för att starta kontinuerlig mikroskopi Imaging framsteg.
   7. Öppna slutaren vid någon fördefinierad tidslucka för att leverera den femtosecondlaser laserstimulering designad i steg 3.5.3 i målcellen.
      Anmärkning: (1) fotostimulering kan utföras när som helst i den konfokala mikroskopi sekvens som styrs av slutaren. (2) photostimulation kan levereras för flera gånger i samma position under konfokalmikroskopi sekvens.
   8. Vänta tills avbildningsprocessen är slutförd. Spara avbildningsdata för ytterligare dataanalys.
6. Att leverera femtosecondlaser laserstimulering till målceller med hjälp av Stim-B-läget
   1. Ställ in kraften i femtosecondlaser laser på 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) på preparatet.
   2. Ta skålen som innehåller celler transfekterade med ERK2-GFP från inkubatorn och lägga den på mikroskopet skede.
   3. Använd snabb scanning läge för att välja en mål cell väl uttryckt ERK2-GFP.
   4. Ställ in konfokalmikroskopi Imaging-processen som steg 3,2. Definiera en speciell skannings ram som stimuleringsram i avbildningsprocessen. Definiera parametern för simulerings ramen.
      1. Ställ in en skannings region (2 x 2-3 x 3 μm²) vid Cytosol-området nära kärnan i målcellen.
      2. Ställ in total skannings tid på 0,1-0,2 s. Synkronisera slutaren av femtosecondlaser laser med konfokal skanning enligt fördefinierade photostimulation område, som endast är öppen när laserskanning droppar i stimuleringsramen och stäng omedelbart när det slocknar.
         Anmärkning: (1) den photostimulaion regionen kan ställas in på valfri storlek. (2) fotostimulering kan utföras vid en fördefinierad tidslucka i konfokalmikroskopi-sekvensen. (3) photostimulation kan utföras flera gånger på samma eller olika fördefinierade områden i FOV i den konfokalmikroskopi sekvens.
   5. Klicka på Start bottom för att starta kontinuerlig mikroskopi Imaging framsteg.
   6. Vänta tills avbildningsprocessen är slutförd. Spara avbildningsdata för ytterligare dataanalys.
7. Stäng av femtosecondlaser laser och konfokal Mikroskop efter experimentet.

4. aktivering av eIF4E (substrat för ERK) av Femtosecond laser simulering

1. Hela cell förberedelse
   1. Följ stegen 2.1.1-2.1.5.
   2. Seed ~ 20 000 celler till en petriskål med cell plats rutnät (figur 3b) för att lokalisera de fotostimulerade cellerna. Tillsätt odlingssubstrat upp till 1 mL.
   3. Sätt skålen med cellerna tillbaka i inkubatorn. Inkubera cellerna 24 h vid 37 ° c innan femtosecondlaser laserbehandling.
2. Slå på femtosecondlaser lasern och se till att slutaren är stängd.
3. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet och öppna Mikroskop programvaran.
4. Bered CO₂ inkubations systemet som en sats i steg 3,3.
5. Att leverera femtosecondlaser laserstimulering till målceller med hjälp av Stim-A-läge
   1. Ställ in kraften i femtosecondlaser laser på 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1 040 nm) på preparatet. Ställ in öppningstiden för slutaren på 0,05-0,2 s.
   2. Ta skålen med celler från inkubatorn och montera den i CO₂ inkubator på scenen av Mikroskop.
   3. Flytta målet i vertikal riktning för att lokalisera bildplanet under ljus fälts avbildning av CCD-kameran. Flytta preparat stadiet i horisontell riktning för att säkerställa att ingen cell lokaliseras i mitten av FOV. Öppna slutaren och justera avståndet mellan två linser av relä teleskopet för att säkerställa diametern på femtosecondlaser laser fokus på ~ 2 μm. Stäng slutaren för att slutföra justeringen.
   4. Flytta mikroskopet scenen för att slumpmässigt välja 5 ~ 10 galler. Det kan indikeras och lokaliseras av galler i botten av Petriskålarna under Bright-fält avbildning av CCD-kameran. Markera/anteckna koordinaterna för valda rutnät i skålen.
   5. Stimulera alla celler som finns i de valda rutnäten en efter en manuellt under Bright-Field Imaging av CCD-kameran.
6. Sätt tillbaka skålen i inkubatorn. Inkubera cellerna 24 h vid 37 ° c före immunofluorescensmikroskopi. Stäng av femtosecondlaser laser och konfokal Mikroskop efter photostimualtion förfarande.
7. Immunofluorescensmikroskopi av fosforylerade eIF4E i celler med fotostimulering för bekräftelse av ERK-aktivering
   1. Ta skålen som innehåller celler med photostimulation behandling i steg 4,5 ur inkubatorn. Ta bort odlingsmediet. Tvätta cellerna med PBS en gång. Ta bort PBS.
   2. Tillsätt 1 mL 5% PARAFORMALDEHYD (4 ° c) i skålen. Fixera cellerna med 5% PARAFORMALDEHYD i 10 min. ta bort paraformaldehydbufferten. Tvätta cellerna med PBS i 5 min två gånger. Ta bort PBS.
   3. Tillsätt 1 mL 0,5% Triton X-100 i skålen. Inkubera cellerna 15 min vid rumstemperatur. Ta bort Triton X-100 buffert. Tvätta cellerna med PBS i 5 min två gånger. Ta bort PBS.
   4. Tillsätt 1 mL 1% BSA-buffert i skålen. Inkubera cellerna 30 min vid rumstemperatur. Ta bort BSA-bufferten.
   5. Späd anti-eIF4E-antikropp (fosfor S209) i 1 mL PBS med 1% BSA till en slutlig koncentration på 1 μg/mL. Lägg till bufferten i skålen. Inkubera cellerna i 10-12 h vid 4 ° c. Ta bort bufferten.
   6. Tvätta cellerna med PBS i 5 min två gånger. Ta bort PBS.
   7. Späd den sekundära antikroppen mot kanin-IgG H & L i 1 mL PBS med 1% BSA till en slutlig koncentration på 2 μg/mL. Lägg till bufferten i skålen. Inkubera cellerna 2 h vid rumstemperatur. Ta bort bufferten.
   8. Tvätta cellerna med PBS. Ta bort PBS.
   9. Tillsätt 1 mL PBS i skålen.
   10. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet. Öppna Mikroskop programvaran. Ställ excitation laser vid 488 nm. Ställ in effektnivån på 488 nm Laser på 0,1 mW. Ställ in bildstorlek som 512 x 512 pixlar. Ange intervalltid för varje pixel som 2,4 μs.
   11. Sätt skålen med Immunofluorescerande färgning celler på mikroskopet scenen. Leta reda på de markerade rutorna under ljus fälts avbildning av CCD-kameran.
   12. Starta en konfokal skanning med en ram. Spara fluorescerande bilder av photostimulation celler.
   13. Flytta scenen slumpmässigt för att lokalisera områden utan femtosecondlaser laser stimulering. Starta en konfokal skanning med en ram. Spara fluorescerande bilder av inga stimuleringsceller som kontrolldata.
8. Stäng av konfokalmikroskopet efter experimentet.

5. aktivering av Mitoblixtar och andra mitokondriella händelser genom Fotostimulering

Anmärkning: För att observera mitokondriell morfologisk dynamik, hela celler är transfekterade med Mito-GFP i steg 5,1 att överföras indikerar Mitochondria. För att observera mitoblinkar, hela celler transfekterade med MT-cpyfp i steg 5,1.

1. Förbered hela celler transfekterade med Mito-GFP eller MT-cpyfp följande steg 2.
2. Slå på femtosecondlaser laser och se till att slutaren är stängd.
3. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet. Ställ excitation laser vid 488 nm. Ställ in effektnivån på 488 nm Laser på 0,1 mW. Ställ in bildstorlek som 512 x 512 pixlar. Ställ in totalbild tid för varje bildruta som 2,2 s. Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor vid 0 s. Ange totala bildrutor som 200 ramar för att ge ~ 440 s kontinuerlig mikroskopi i ett enskilt experiment.
   Anmärkning: Intervallet för två intilliggande ramar, totala bildrutor och avbildnings tiden för kontinuerlig mikroskopi kan justeras enligt experimentella krav.
4. Bered det CO₂ -inkuberingssystem som beskrivs i steg 3,3 vid behov.
5. Att leverera femtosecondlaser laser stimulering till målet mitokonden med hjälp av Stim-A-läge
   1. Ta skålen som innehåller celler transfekterade med Mito-GFP eller MT-cpyfp från inkubator och sätta skålen på mikroskopet scenen.
   2. Kontrollera status för femtosecondlaser laser som steg 3.5.2. Se till att fokus för femtosecondlaser laser ligger i centrum av FOV. Ställ in en referenspil i mitten av det fluorescerande bildfönstret för att indikera fokuserings positionen.
   3. Ställ in kraften i femtosecondlaser laser på 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) på preparatet. Ställ in öppningstiden för slutaren vid 0,05-0,1 s.
   4. Använd snabb scanning läge för att välja en målcell väl uttryckt Mito-GFP eller MT-cpYFP.
   5. Välj en mitokonson slumpmässigt i målcellen som försöks ämne. Flytta mikroskopet skede för att lokalisera målet mitokondriell tubulär struktur i mitten av FOV (ange med referenspilen) genom snabb scanning läge.
   6. Klicka på Start bottom för att starta kontinuerlig mikroskopi Imaging framsteg.
   7. Öppna slutaren vid någon fördefinierad tid för att leverera den femtosecondlaser laser stimulering utformad i steg 5.5.3 i målet mitokondriell tubulär struktur.
      Anmärkning: (1) den femtosecondlaser laser exponeringen på den mitokondriella rörformiga strukturen kan styras av slutaren när som helst under konfokalmikroskopi. (2) utför endast en femtosecondlaser-laserexponering i ett experiment eftersom en femtosecondlaser laserstimulering kan stör mitokondriell status under en lång period.
   8. Vänta tills avbildningsprocessen är slutförd. Spara avbildningsdata för ytterligare dataanalys.
6. Stäng av femtosecondlaser laser och konfokal Mikroskop efter experimentet.

6. Oscillation av mitokondriell membran potential på målet Mitokona i hela celler av Femtosecond laser stimulering

1. Förbered hela celler enligt stegen 2.1.1-2.1.6.
2. Inkubera cellerna i 24 h vid 37 ° c före experiment.
3. Förbered TMRM-färgning lösning: Späd TMRM i 1 mL DMEM med 10% FBS till en slutlig koncentration av 100 nM.
4. Ta skålen med celler som bereds i steg 5.2.1 och 5.2.2 ur inkubatorn. Ta bort odlingsmediet. Lägg till TMRM-färgningslösningen som förberetts i steg 6,3 i skålen. Fläcken för 15-20 min vid 37 ° c i inkubatorn. Ta bort infärgnings lösningen. Tvätta cellerna med PBS en gång. Tillsätt 1 mL odlingssubstrat i skålen.
5. Slå på femtosecondlaser laser och se till att slutaren är stängd.
6. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet. Öppna Mikroskop programvaran. Ställ excitation laser vid 532 nm. Ställ in effektnivån på 532 nm Laser på 0,1 mW. Ställ in bildstorlek som 512 x 512 pixlar och Frame generation tid på 2,2 s. Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor vid 0 s. Ställ in Total Imaging frames som 200 ramar för att ge ~ 440 s kontinuerlig mikroskopi i ett enskilt experiment.
   Anmärkning: Intervallet för två intilliggande ramar, totala bildrutor och avbildnings tiden för kontinuerlig mikroskopi kan justeras enligt experimentella krav.
7. Bered det CO₂ -inkuberingssystem som beskrivs i steg 3,3 vid behov.
8. Använd Stim-A-läge för att leverera femtosecondlaser laser stimulering till målet mitokonden. Följ steg 5.5.1-5.5.8 att slutföra experimentet.
   Anmärkning: I steg 6,8, Välj en mitokondon som är väl färgade med TMRM som mål mitokonden.
9. Stäng av femtosecondlaser laser och konfokal Mikroskop efter experimentet.

7. förändringar av Bax och cytokrom C på målet Mitokona i hela celler av Femtosecond laser stimulering

Anmärkning: I detta experiment, utsäde cellerna i petriskålar med cell plats galler (figur 3b) för att lokalisera cellen som behandlas av femtosecondlaser laser. Fläcka cellerna med TMRM att lokalisera mitokondiers som väljs för att stimuleras av femtosecondlaser laser.

1. Förbered hela celler i en petriskål med cell plats rutnät (figur 3b) enligt beskrivningen i steg 4,1.
2. Färga cellerna med TMRM enligt beskrivningen i steg 6,3 och 6,4.
3. Slå på femtosecondlaser laser och se till att slutaren är stängd.
4. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet. Öppna Mikroskop programvaran. Ställ excitation laser vid 532 nm. Ställ in effektnivån på 532 nm Laser på 0,1 mW. Ställ in bildstorlek som 512 x 512 pixlar och Frame generation tid på 2,2 s. Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor vid 0 s. Ställ in Total Imaging frames som 50 ramar för att ge ~ 110 s kontinuerlig mikroskopi i ett enskilt experiment.
5. Att leverera femtosecondlaser laser stimulering till målet mitokonden med hjälp av Stim-A-läge
   1. Ställ in kraften i femtosecondlaser laser på 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) på preparatet. Ställ in öppningstiden för slutaren vid 0,05-0,1 s.
   2. Ta skålen som innehåller celler färgade med från inkubatorn och sätta skålen på mikroskopet scenen.
   3. Använd snabb scanning läge för att välja målcellen som är väl färgade med TMRM.
   4. Flytta scenen för att lokalisera målet mitokondriell tubulär struktur i centrum av FOV med hjälp av snabb scanning läge. Markera koordinaten för det rutnät som den valda cellen finns under ljus fälts avbildning.
   5. Klicka på Start bottom för att starta kontinuerlig mikroskopi Imaging framsteg.
   6. Öppna slutaren vid någon fördefinierad tid av mikroskopi Imaging framsteg manuellt för att leverera femtosecondlaser laser stimulering utformad i steg 7.5.1 i målet mitokondriell tubulär struktur.
   7. Vänta tills avbildningsprocessen är slutförd. Markera den valda mitokondrien som simuleras av femtosecondlaser laser. Spara avbildningsdata för ytterligare dataanalys.
   8. Stäng av femtosecondlaser laser och konfokal Mikroskop efter experimentet. Förbered immunofluorescensmikroskopi av Bax eller cytokrom C på experiment cellerna.
6. Immunofluorescensmikroskopi av Bax eller cytokrom C på den femtosecondlaser laser behandlade mitokonliker.
   1. Ta skålen från mikroskopet scenen.
   2. Fullständig Immunofluorescerande färgning av Bax eller cytokrom C Följ stegen 4.7.1-4.7.9.
      Anmärkning: Använd anti-Bax eller anti-cytokrom C i stället för anti-eIF4E i steg 4.7.5 för att avsluta Immunofluorescerande färgning av Bax eller cytokrom C i steg 7.6.2.
   3. Slå på laserscannerkonfokalmikroskopet och öppna Mikroskop programvaran. Ställ magnetisering laser vid 488 nm och 532 nm. Ställ in effektnivån på 488 nm och 532 nm Laser på 0,1 mW. Ställ in bildstorlek som 512 x 512 pixlar och Frame generation tid på 2,2 s.
   4. Sätt skålen med Immunofluorescerande färgning celler på mikroskopet scenen. Lokalisera det valda rutnätet under ljus fälts avbildning av CCD-kameran. Lokalisera cellen som behandlas av femtosecondlaser laser.
   5. Starta en konfokal skanning med en ram. Lokalisera mitokonsinen som stimuleras av femtosecondlaser laser. Spara fluorescerande bild av photostimulation cell för ytterligare dataanalys.
7. Stäng av konfokalmikroskopet efter experimentet.

Photostimulation kan utföras samtidigt tillsammans med kontinuerlig konfokal scanning mikroskopi. Photostimulation kan börja vid en fördefinierad tidslucka i tidsförlopp konfokalmikroskopi sekvens. Den konfokala mikroskopi kan övervaka cellulära molekyler genom fluorescerande avbildning. De molekylära svaren på fotostimulering och annan dynamik kan identifieras på detta sätt. Teoretiskt, om ERK är aktiverad, det kommer att fosforyleras flytta från cytoplasman till cell Nucleus²⁷. Det specifika cell ödet kan regleras av det bestämt mönstrar av denna ERK signalerar²⁸. I nyare studier, optisk modulering baserad på optogentics har gett en hög exakt kontroll av erk signalen i varaktighet och magnitud och avslöjade att oroad erk signalöverföring dynamik driver felaktig spridning i cancerceller^{7, 8}. Här visar vi ERK2 flyttning i kärnan efter behandling av cell med en kort blixt av femtosecondlaser laser med hjälp av den metod som presenteras i detta protokoll. Som framgår av figur 5anår ERK2-GFP-fluorescens maximalt efter flera minuter femtosekunslasersimulering. De ERK2 molekylerna kommer att defosforyleras efter aktivering nedströms substrat i kärnan, och sedan ERK2 kommer tillbaka till cytoplasman indikeras genom att minska av nukleära GFP fluorescens. ERK2 kan aktiveras flera gånger av flera photostimulations (Figur 5b). Därför är det kan manipulera ERK2 signal mönstret exakt genom att kontrollera intervalltid mellan flera stimuli. Dessutom kan ERK2 aktiveras i angränsande celler runt den stimulerade cellen ibland (figur 5c). Denna observation indikerar att vissa diffusbara molekyler kan släppas ut av cellen som behandlats med femtosecondlaser laser för att aktivera ERK2 i de angränsande cellerna. Fosforylering av ERK2 nedströms protein eIF4E kan bekräftas och visualiseras genom immunofluorescensmikroskopi (figur 5D). Detta resultat indikerar att femtosecondlaser laser stimulering kan framgångsrikt aktivera ERK signalering väg. Mer detaljerade resultat finns i Wang S., et al.²².

Mitokondriella oxidativa blixtar (mitoblixtar) är oxidativa skurar i mitokondrier som rot från komplexa mitokondriell molekylär dynamik. Under de senaste tio åren, mitoblixtar realiseras vara en elementär mitokondriell signalering händelse och ta en viktig del i mångfaldiga cellfunktioner^29,30,31. Traditionellt, mitoblixtar observeras vanligtvis av en slump vid behandling av celler med kemikalier för att ge indirekt stress till mitokonen^29,30. Genom att genomföra denna fotostimulering system, uppnår vi en kontrollerbar och exakt sätt att excitera mitoblixtar på enda mitokondriell tubulär nivå. Den framgångsrika mitoblixtens excitation visas i figur 6a. Intressant, egenskaperna hos mitoblixtar såsom Pulse Peak, bredd och respons varaktigheter³² är nära besläktade med femtosecondlaser lasereffekt. Mer detaljerad kvantitativ analys av mitoblixtar upphetsad av femtosecondlaser laser stimulering är i Wang S., et al.³². Denna photostimulation till mitokondrierna visar också varianter av mitokondriell molekylär dynamik, inklusive fragmentering och återställande av mitokondriell morfologi (figur 6b), och svängning av mitokondriell membran potential ( Figur 6C). I likhet med fotoaktiverade mitoblixtar har dessa mitokonaktier olika prestanda med olika effektnivåer av fotostimulering. Det skiljer sig från aktivering av ERK signalering väg. Påverkan av femtosecondlaser laser är mycket begränsad på ett enda mitokondriellt rör. Mer detaljerade resultat finns i Wang Y., et al. ²⁴ och Shi F., et al. ²⁵.

Figur 1: fotostimuleringsschemat som är etablerat på en femtosecondlaser laser koppling till ett konfokalmikroskop. Aoptiska vägar förBfotostimulering och konfokala avbildningssystem. Den femtosecondlaser lasern först delas av en 50/50 balk splitter i två balkar. Transmissionen utökas med ett relä teleskop och återspeglas sedan i målet att bilda Stim-A. Reflektions balken justeras genom Mikroskop skannings systemet för att bilda Stim-B. En CCD-kamera används för att ge en ljus-felID Imaging att övervaka celler och fokus på femtosecondlaser laser i stim-A-läge. Stim-A = ett fast fokus i centrum av FOV; Stim-B = en speciell skannings ram på fördesignad yta. DM = Dichroic spegel, BS = balk splitter, RM = reflekterande spegel. Våglängden för konfokal scanning laser är 488 nm/532 nm/635 nm, och det typiska våglängdsintervallet för fluorescens är < 560 nm/560-625 nm/> 625 nm. Fibern femtosecondlaser laser (1 040 nm, 120 FS, 50 MHz, 1 W) kan ersättas med en TI = Sapphire laser (810 nm, 80 MHz, 65 FS, 1 W) eller andra kommersiella femtosecondlaser laser oscillatorer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: i stim-A-läge, lokalisering och storlek femtosecondlaser laser fokus på målcellen vid konfokalmikroskopi Imaging planet under Bright-felID Imaging. (A) Femtosecond laser blockeras av slutaren. (B) Femtosecond laser är på. Arrow: referenspilen är inställd i mitten av FOV för att bekräfta att femtosecondlaser laser fokus lokaliserar rätt position. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: petriskål som används för cellkulturer, transfektion och fotostimulering experiment. A35 mm petriskål med 15 mm diameter och 0,17 mm tjocklek glasbotten. B35 mm petriskål med glasbotten och tryckt 500 μm cell plats rutnät. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: inkubations systemet för CO₂ . A) Co₂ -inkubatorstadiet och (B) Kontrollpanelen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 5: erk ljusaktivering med hjälp av Stim-A-läget. (A) enda foto stimulans (1 040 nm, 40 MW, 0,1 s) inducerar ERK2-GFP flyttning i kärnan och sedan tillbaka till cytoplasman. (B) ERK2 signal mönster medierad av enstaka femtosecondlaser laser exponering (röd pil, 1 040 nm, 40 mW, 0,1 s) och två photostimulations (gröna pilar, 810 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) erk aktivering i omgivande celler genom enkel kort femtosecondlaser laser exponering i målcellen (vit pil, 810 nm, 24 mW, 0,2 s). (D) Immunofluorescenser av EIF4E-P uppvisar en signifikant ökning 24 h efter enkel foto simulering (810 nm, 25 mW, 0,2 s). Skalstapeln = 10 μm (A) och 20 μm (B, C). Fluorescensen av ERK2-GFP och eIF4E-P är upphetsad av 488 nm excitation laser och samlas i < 560 nm kanal. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: multipla mitokonshändelser som induceras av fotostimulering under Stim-A-läge. (A) excitation av mitoflash på den stimulerade mitokondriella tubulen genom enkel stimulans (810 nm, 16 mW, 0,1 s). B) mitokonaktiermorfologisk fragmentering och återställande orsakad av enkel fotostimulering (1 040 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) Oscillation av mitokondriell membran potential genom enkel femtosecondlaser laserstimulering (1040 nm, 20 mW, 0,1 s). Pilarna i (A) (B) och (C) anger placeringen av photostimulations. Skalstapel = 10 μm. Fluorescensen av Mito-GFP eller MT-cpYFP är upphetsad av 488 nm excitation laser och samlas i < 560 nm kanal. Fluorescensen av TMRM är upphetsad av 532 nm excitation laser och samlas i 560-625 nm kanal. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Rekommenderad stimulering varaktighet och genomsnittlig effekt av femtosecondlaser laser i stim-A-läge.

Tabell 2: Rekommenderad stimulering varaktighet och genomsnittlig effekt av femtosecondlaser laser i stim-A-läge på 2 x 2-3 x 3 μm ² i cellen.

Vi visar en fotostimulering strategi genom att kombinera en femtosecondlaser laser med en laser scanning konfokala Mikroskop system. Photostimulation kan direkt fungera som en två-Photon mikroskopi genom att definiera Stim-B i enlighet därmed. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att utnyttja en kort blixt av femtosecondlaser laser för att utlösa ERK signalering eller mitoblixtar i målceller. De olika stimuleringslägen kan utföras enligt olika experimentella syften och system. Stim-A kan enkelt ställas in baserat på ett konfokalmikroskop. Den femtosecondlaser lasern kan fokuseras på diffraktion-Limit nivå vid FOV Center. Den subcellulära mål måste flyttas till femtosecondlaser laser fokus position manuellt och kan stimuleras för godtyckliga varaktigheter, helt oberoende av konfokalmikroskopi. Därför kan Stim-A skydda provet som är ur fokusområdet perfekt och lämpar sig för långvarig fotostimulering. Stimuleringsregionen Stim-B kan fördefinieras som vilket område som helst i FOV. Den kan utföras automatiskt. Men stimulering varaktighet och exponeringstid kan bara följa tillsammans med den konfokala skanning. Efter att ha fastställt uppehållstiden för varje pixel och den totala bildrutestorleken, är stimuleringstid i en enda mikroskopi RAM faktiskt fast. Photostimulation kan också utföras regelbundet ram för bildruta. Det kan också användas för att aktivera fotosensibiliserande och optogenetiska proteiner som kräver mindre exponeringstid men stort område.

Ett kritiskt övervägande i detta protokoll är hur man bestämmer parametrarna för femtosecondlaser laser stimulering. Enligt våra tidigare studier, den cellulära molekylära aktiviteten är främst induceras av multiphoton exaction^{17,21,22,23,24,25}. Generellt multiphoton exaction effektivitet är relaterad med alla femtosecondlaser laser parametrar inklusive våglängd, pulsbredd, repetitionshastighet. Den cellulära svar är ytterligare relaterade med lasereffekt, stimulering position/region, och exponeringstid samtidigt. I princip är stimuleringseffektiviteten i konflikt med cell säkerheten. Starkare photostimulation som högre genomsnittlig effekt, längre stimulering varaktighet och större total incident laser energi bidrar till högre stimulering effektivitet men ger högre risk för cellskador. Eftersom dessa parametrar är också relativa med varandra och alla bidrar till stimulering och skada effekt, är det omöjligt att använda endast en parameter, som den totala incident laser energi, eller laser medeleffekt, för att definiera det är säkert eller inte. Med tanke på både signal aktiveringen effektivitet och cell säkerhet, här, vi ger Rekommenderad genomsnittlig effekt och stimulering varaktigheten av två femtosecondlaser laserkälla för referens i tabell 1 och tabell 2. Förutom, parametrarna för femtosecondlaser laserstimulering bör ändras enligt den faktiska optiska systemet och biologiskt prov.

Enligt diskussionerna ovan, vi avser att presentera mer detaljerade effektiva intervall av photostimulation parametrar. Våglängden av femtosecondlaser laser kan ändras på NIR intervall som används för photostimulation. Pulsen bredd bör vara kort för att ge en hög toppeffekt och hög ickelinjär exaction effektivitet. Lång puls tid rekommenderas inte för detta protokoll. Vanligtvis är den typiska pulsbredden för två-Photon mikroskopi (< 200 FS) rätt val. Repetitionshastigheten av lasern är inte en nyckelfaktor. Repetitionshastigheten upp till MHz är lämplig för detta protokoll. Den mest kritiska faktorn för cellulära molekylära svar är lasereffekt och stimulering varaktighet femtosecondlaser laser. För att aktivera erk, enligt vårt tidigare arbete²², den genomsnittliga effekten vid 15 MW (810 nm) eller 20 MW (1 040 nm) och exponeringstid på 0,2 s är tillräckligt för att ge tillräcklig stimulering för att aktivera erk signalering samtidigt som ultrahög cell lönsamhet i Hela Cells. Tvärtom, medeleffekt över 80 mW (810 nm) eller 120 mW (1 040 nm) och exponeringstid längre än 1 s kan framkalla oåterkallelig skada på celler. Mitokona är i allmänhet känsligare för fotostimulering. Stimuleringen med en genomsnittlig effekt högre än 40 mW (810 nm) eller 80 mW (1 040 nm) och exponeringstid över 0,2 s kan inducera betydande skador som oåterkallelig fragmentering i stimulerad mitokongörelse eller till och med i alla mitokona över hela cellen. Det bör noteras att fotosensitiviteten hos mitokona till photostimulation varierar mycket i olika celltyper. Till exempel, i HeLa celler, lasereffekt behöver bara cirka 6 mW (810 nm, 0,1 s varaktighet). Alla mitokona kan svar på photostimulation i form av fragmentering, mitoblixtar, och MMP svängningar. Men i mänskliga mesenkymala stamceller, måste kraften ökas till cirka 15 mW (810 nm, 0,1 s varaktighet), och fortfarande runt hälften stimulerad mitokona visar inget svar på photostimulation. I stim-B-läget kan en annan faktor påverka foto aktiverings effektiviteten och cell skadan är stimuleringsområdet. Photostimulation kan orsaka cellskador genom att leverera på en liten stimulering område. Men samma stimulering kan misslyckas med att aktivera ERK genom att leverera på en större stimulering område. Vi rekommenderar att stimuleringsområdet i målcellen är runt 2 x 2-3 x 3 μm² och inte överstiger 25 μm².

Lokaliseringen av stimuleringsregionen är också viktig för tillämpningen av detta protokoll. Enligt tidigare arbeten^17,22, kan photostimulation i det området tömma ca^{2 +} butik i er effektivt och aktivera CRAC kanal. Sedan ca^{2 +} inflödet kan aktivera erk signalering väg därefter. Därför rekommenderar vi att leverera photostimulation på ER-regionen i hela celler för att uppnå en hög ERK aktiverings effektivitet. ER regionen kan lätt skiljas från cytoplasman eller kärna under ljus fält mikroskopi av en fas-kontrast mål. För att införa mitokondriell signalering händelser, fokus för femtosecondlaser laser kan enkelt monteras på den valda mitokondriell struktur efter de relaterade förfaranden.

Photostimulation metoder som beskrivs i detta protokoll kan också användas för att påverka andra flera cellulära händelser som inducera ca^{2 +} och ros signaler^17,20,21. Det bör noteras alla dessa tidigare arbeten har gett utvärderingen av cell säkerhet efter photostimulation. Till exempel, signifikanta morfologiska förändringar av celler, bubblande, mitokondriell fragmentering och svullnad av hela cellen, minskad spridning av celler, och några andra ovanliga förändringar av fluorescensen under konfokalmikroskopi alla innebär hög cellskador. Det bör vara mycket noga med att övervaka cell status. Ändå, med väl kontroll över lasereffekt och stimulans parametrar, kan cellernas lönsamhet upprätthållas på en mycket hög nivå samtidigt med hög stimulering effektivitet. Därav, denna photostimualtion metod för femtosecondlaser laser är av god potential att ytterligare utvidga till fler områden och tillämpas i relevanta tillämpningar.