La fotostimolazione da parte del laser Femtosecondo attiva la segnalazione o eventi mitocondriali regolati dal segnale extracellulare (ERK) nelle cellule bersaglio

La tecnologia di controllo delle molecole di segnalazione cellulare è una parte importante dello sviluppo delle scienze della vita. Tradizionalmente, il metodo più comunemente usato è il trattamento biochimico da parte di farmaci o materiali biologici^1,2,3. Negli ultimi dieci anni, l'invenzione dell'optogenetica apre una nuova era per la modulazione del segnale molecolare cellulare. La trasfezione con le proteine sensibili alla luce mediante l'ingegneria genica rende la luce un potente strumento per modulare varie attività proteiche nelle cellule bersaglio. Questa tecnologia ha fatto progressi incoraggianti come l'eccitazione e l'inibizione del segnale neurale, la promozione dell'espressione genica, la manipolazione dei modelli di segnale cellulare, la conduttura di diversi destini cellulari e l'indagine patologica^{4,5 ,6,7,8,9}. Tuttavia, la luce può funzionare solo traducendo le cellule con proteine optogenetiche. Nella fase attuale, esistono rari metodi che consentono alla luce di controllare le molecole cellulari direttamente oltre all'optogenetica.

Il laser Femtosecondo ha avanzato ricerche biologiche fornendo un'efficiente eccitazione multifotona pur mantenendo una buona sicurezza biologica. Con l'implementazione di diverse strategie di elaborazione fotografica, ha realizzato numerosi risultati come microscopia multifotone, microchirurgie e applicazioni optogenetiche multifotonia^{10,11,12,13 ,14,15,16}. Recenti indagini dimostrano che la stimolazione laser del femtosecondo è stata dimostrata come un metodo ottico altamente efficiente per indurre direttamente gli eventi di segnalazione molecolare. È stato scoperto che l'irradiazione laser femtosecondi strettamente focalizzata sul reticolo endoplasmico (ER) è in grado di esaurire il calcio in ER e attivare canali di calcio attivato dal rilascio di calcio (CRAC) per formare segnali di calcio nelle cellule¹⁷. Questo segnale di calcio foto-attivato può diffondersi tra più tipi di celle^18,19,20. Inoltre, ha anche la capacità di attivare le vie di segnalazione cellulare come il fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) e il percorso di segnalazione ERK^21,22. Regolando l'intensità e la localizzazione dell'esposizione al laser femtosecondo nelle cellule, ad esempio, concentrando il laser sui mitocondri, può influenzare la morfologia mitocondriale e gli eventi molecolari^{23,24, 25}. In particolare, le esplosioni di generazione di ROS mitocondriale possono essere eccitate dalla fotostimolazione, che viene sottolineata come lampi fluorescenti nei mitocondri (mitofrangh).

Pertanto, la tecnologia di fotostimolazione è di buon potenziale per essere ampiamente applicata nella ricerca biologica correlata. È anche una buona occasione per estendere le applicazioni laser femtosecondi nel controllo delle molecole di segnalazione cellulare e delle funzioni oltre alla microscopia. Qui, forniamo i dettagli tecnici della fotostimolazione. La fotostimolazione si ottiene acunmando un laser femtosecondo a un microscopio confocale per fornire una singola cellula bersaglio con una breve fotostimolazione flash. Può avviare un'attivazione efficiente e controllabile di ERK nella cellula. Se la fotostimolazione si trova sulla struttura tubolare mitocondriale, il potenziale della membrana mitocondriale, la morfologia, ros e i pori di transizione permeabilità, possono essere tutti controllati dalla fotostimolazione. Sulla base di questo schema di fotostimolazione, forniamo un metodo dettagliato per attivare il percorso di segnalazione ERK e influenzare più eventi mitocondriali nelle cellule di Hela. Questo protocollo chiarisce il processo di stimolazione laser delle femtosecondi nelle cellule bersaglio.

Il sistema di fotostimolazione è stabilito su un microscopio confocale con un accoppiamento laser femtosecondo per la stimolazione simultanea e la microscopia continua. Il laser femtosecondo (lunghezza d'onda: 1.040 nm, velocità di ripetizione: 50 MHz, larghezza dell'impulso: 120 fs, potenza media massima di uscita: 1 W) viene diviso in due fasci prima dell'accoppiamento. Uno è guidato attraverso un telescopio relè costituito da un paio di lenti. Viene quindi riflesso direttamente nell'apertura posteriore di un obiettivo (60x, N.A. - 1,2, immersione in acqua) per formare un focus di diffrazione-limite (Stim-A). L'altro si riflette nel percorso ottico di scansione del microscopio confocale per funzionare come una modalità di scansione a due fotoni (Stim-B). Stim-A presenta un punto focale fisso al centro del campo visivo (FOV). Stim-B è un'area di scansione confocale parziale pre-progettata nel FOV. Stim-A e Stim-B sono mostrate nella Figura 1A. Una telecamera CCD sotto lo specchio dicroico (DM) fornisce immagini a campo luminoso per monitorare la messa a fuoco del laser a femtosecondi.

Ci sono alcuni elementi essenziali per i seguenti esperimenti. In questo protocollo, una fonte laser in fibra femtosecondo (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) viene utilizzata come esempio. In pratica, la maggior parte degli oscillatori femtosecondi commerciali può essere utilizzata fintanto che la larghezza dell'impulso è inferiore a 200 fs e la densità di potenza massima dovrebbe essere superiore al livello di 10¹¹ x 10¹² W/cm². Ad esempio, un laser Ti: Sapphire di solito utilizzato per la microscopia multifotone è in grado di sostituire il laser femtosecondo mostrato in Figura 1B. La potenza laser e alcuni altri parametri di fotostimolazione devono essere sintonizzati perché i parametri ottici (larghezza dell'impulso, lunghezza d'onda e frequenza di ripetizione) variano molto in diversi laser femtosecondi che inducono così diverse efficienze di eccitazione multifotone.

Insieme alla stimolazione laser del femtosecondo, la microscopia confocale fornisce l'imaging cellulare continuo per monitorare la dinamica molecolare in tempo reale sia nei modi Stim-A che Stim-B. Entrambi gli schemi di fotostimolazione (Stim-A e Stim-B) sono controllati da un otturatore meccanico con risoluzione dei millisecondi (Figura 1).

Nella modalità Stim-A, la posizione della messa a fuoco laser è fissa al centro di FOV. Un telescopio relè viene utilizzato per garantire che la messa a fuoco del laser femtosecondo sia posizionata sul piano di imaging confocale regolando la distanza tra due lenti nella direzione verticale (la direzione di propagazione laser, verticale al piano di imaging confocale, come mostrato nella Figura 1). Con l'imaging del campo luminoso della fotocamera CCD, è possibile misurare il diametro della messa a fuoco laser (2 m, Figura 2B). La durata della stimolazione e i tempi di esposizione sono controllati da un otturatore durante il processo di imaging confocale.

In modalità Stim-B, l'area di stimolazione può essere pre-assegnata manualmente nel software di controllo dell'imaging confocale a qualsiasi forma come linea, poligono o cerchio. L'otturatore è sincronizzato con il processo di scansione confocale. Si apre al tempo pre-progettato che viene impostato attraverso il software di controllo dell'imaging confocale. Quindi, l'area di stimolazione viene scansionata dal laser femtosecondo come microscopia confocale. Pertanto, il campione viene stimolato dal laser del femtosecondo solo quando il processo di scansione confocale entra in un dato telaio di imaging.

Il sistema di fotostimolazione può essere stabilito su microscopi metallurgici invertiti ed eretti in base ai soggetti dell'esperimento. Le cellule in vitro coltivate nei piatti Petri sono meglio lavorare con microscopi invertiti. Gli animali, in particolare i cervelli di animali vivi, sono più adatti con microscopi eretti. In questo studio, prendiamo come esempio il microscopio invertito. Va notato che la copertura del piatto Petri non viene aperta durante l'intero esperimento.

ATTENZIONE: Il protocollo presentato di seguito prevede l'utilizzo di laser femtosecondo NIR e sostanze chimiche tossiche. Prestare attenzione a tutti i possibili danni indotti dalle procedure di sperimentazione. Si prega di leggere le schede tecniche di sicurezza di tutte le sostanze chimiche pertinenti o altri materiali prima dell'uso. Si prega di seguire le istruzioni di sicurezza delle strutture laser o consultare i professionisti per la guida prima di azionare la fonte laser.

1. Preparazione sperimentale

1. Impostazione del sistema di fotostimolazione
   NOT: Il sistema è costituito da un laser a femtosecondi e da un microscopio confocale a scansione laser (a distanza visibile per l'eccitazione a fluorescenza). Nella Figura1, un laser a femtosecondo in fibra (1.040 nm, 50 MHz, 120 fs, 1 W) viene utilizzato per l'accoppiamento. I parametri non sono fissi o necessari. Può essere sostituito da un laser Ti: Zaffiro o altri oscillatori femtosecondi commerciali della gamma NIR.
   1. Sintonizzatevi sul laser al femtosecondo e sul microscopio confocale.
      NOT: Si prega di impostare la potenza laser del femtosecondo a un livello basso (50 mW) nel processo di regolazione del percorso ottico.
   2. Utilizzare specchi riflettenti (RM1 e RM2 mostrati nella Figura 1B) per dirigere il raggio laser del femtosecondo attraverso un otturatore meccanico. Aprire l'otturatore.
   3. Impostare una barra di divisione del fascio 50/50 (BS, Figura 1B) per dividere il fascio laser del femtosecondo in due raggi separati (fascio di trasmissione e fascio di riflessione). Steer RM2 e BS per far coincidere il raggio laser del femtosecondo con il raggio laser a scansione.
      NOT: (1) Un'iride di riferimento (Iris 1, Figura 1B) dietro il mirror dichroic a passaggio lungo (DM, 700 nm cut-on wavelength, Figura 1B) viene utilizzato per il posizionamento della scansione del percorso laser. (2) Il sistema può funzionare solo in modalità Stim-A o Stim-B, rispettivamente. Per la modalità Stim-A, il BS può essere rimosso. Per Stim-B, il BS può essere sostituito da un RM.
   4. Impostare un telescopio relè composto da una coppia di lenti per espandere la larghezza del fascio di trasmissione, che è costituito con l'apertura posteriore dell'obiettivo.
      NOT: (1) Le iris di riferimento 2 e 3 (Figura 1B) sono impostate per collidare il fascio laser del femtosecondo (Figura 1B). (2) L'ingrandimento del telescopio a staffetta dipende dal diametro originale del fascio laser del femtosecondo e dal diametro dell'apertura posteriore dell'obiettivo.
   5. Steer RM (RM 3-5, Figura 1B) per allineare il fascio espanso al microscopio. Steer RM 4 e RM 5 per mettere a fuoco il laser femtosecondo al centro di FOV.
   6. Misurare l'efficienza di trasmissione dell'obiettivo del laser a femtosecondi.
      NOT: Si prega di misurare la potenza del laser rispettivamente a Stim-A e Stim-B a causa dei diversi percorsi di penetrazione del laser in queste due modalità. Utilizzerà l'energia a campione per illustrare le relative procedure di esperimento riportate di seguito.
   7. Sintonizzare l'otturatore, il laser al femtosecondo e il microscopio confocale fino all'inizio degli esperimenti.
      NOT: Negli esperimenti seguenti, Stim-A e Stim-B non lavorano insieme. Se si utilizza Stim-A, il raggio laser femtosecondo di Stim-B deve essere bloccato. D'altra parte, il fascio di Stim-A dovrebbe essere bloccato se il sistema funziona in modalità Stim-B.
2. Preparare il mezzo di coltura: l'alto glucosio ad alto livello di Dulbecco (DMEM) del medio modificato di Dulbecco con siero bovino fetale (FBS) è del 10%.
3. Preparare il plasmide di DNA ERK2-GFP, il plasmide del DNA Mito-GFP e il plasmide di DNA della matrice mitocondriale (mt-cpYFP) che puntano circolano. Mantenere il plasmidi a -20 gradi centigradi fino all'uso.
4. Preparare la tetrametilrorodamina (TMRM, 100 M) e la polietilenimina (PEI 1 mg/mL). Conservarli a -20 gradi centigradi fino all'uso.
5. Preparare 5% paraformaldeide, 0.5% Triton X-100, anti-eIF4E (fattore di avvio della traduzione eucariota 4E), anticorpo (fosforo S209, 1 mg/mL), anticorpo anti-Bax (1 mg/mL), anticorpo anti-cimomocchiato C (1 mg/mL), anticorpo secondario (anti-Rabbit IgG H;L, Alexa Fluor 488, 1 mg/mL) e 1% BSA con 0.1% Tween20. Tenere questi reagenti a 4 gradi centigradi fino all'uso.
6. Preparare materiali sterili: bottiglie di coltura cellulare, piatti Petri con fondo scorrevole di vetro (Figura 3A), piatti con un fondo di vetro, una griglia di localizzazione delle celle da 500 m impressa (Figura 3B, per localizzare le cellule fotostimolate), tubi da 1,5 mL e 10 mL e 1 mL, 100 e 10 pipette e punte l.
7. Preparare attrezzature standard per la coltura cellulare: un incubatore di colture cellulari fissato al 5% di CO₂ e 37 gradi centigradi e un armadietto di sicurezza biologica.

2. Cultura cellulare e trasfezione

NOT: La cellula di Hela (linea cellulare derivata dalle cellule tumorali cervicali adottata l'8 febbraio 1951 da Henrietta Lacks)²⁶ è usata come esempio in questo protocollo.

1. Passaggio cellulare
   1. Rimuovere il mezzo di coltura dalla bottiglia di coltura cellulare contenente un numero sufficiente di celle.
   2. Lavare la bottiglia con 2 mL di salina con buffer fosfato (PBS). Rimuovere il PBS.
   3. Aggiungere 1 mL di prove di prova lentamente e toccare leggermente la bottiglia. Rimettere la bottiglia nell'incubatrice e incubare le cellule 3 min a 37 gradi centigradi.
   4. Rimuovere la metapsino. Aggiungere 2-3 mL di media di coltura. Pipette il mezzo più volte per aiutare le cellule a staccarsi. Trasferire il mezzo con le celle in un tubo da 10 mL.
   5. Prendere 10 l del campione dal tubo per il conteggio cellulare.
   6. Seme 25.000 cellule in un piatto Petri (Figura 3A) e aggiungere mezzo di coltura fino a 1 mL.
   7. Rimettere le cellule contenute nel piatto nell'incubatrice. Incubare le cellule a 24 h a 37 gradi centigradi prima della trasfezione.
2. Trasfezione cellulare
   1. Per la trasfezione per piatto, utilizzare 0,5 g di plasmide di DNA (ERK2-GFP, Mito-GFP o mt-cpYFP). Aggiungete 0,5 g di plasmide e 2,5 g di PEI in 50 gradi di DMEM in un tubo da 1,5 mL. Incubare supporti misti 10 min a temperatura ambiente.
   2. Prendere il piatto con le cellule dall'incubatrice. Sostituire il supporto di coltura con 1 mL di DMEM.
   3. Aggiungere il DNA/PEI supporti misti nelle cellule cadere a goccia. Rimetti le cellule nell'incubatrice.
   4. Incubare le cellule di 3 h a 37 gradi centigradi e sostituire i supporti misti DMEM DNA/PEI con 1 mL di mezzo di coltura.
   5. Incubare le cellule trasfette 24 h a 37 gradi centigradi prima degli esperimenti di fotostimolazione.

3. Attivazione di ERK2 mediante fotostimolazione del laser Femtosecondo

1. Accendere il laser femtosecondo e assicurarsi che l'otturatore sia chiuso.
2. Accendere il microscopio confocale a scansione laser e aprire il software del microscopio. Impostare il laser di eccitazione a 488 nm. Impostare il livello di potenza del laser a 488 nm a 0,1 mW. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel. Impostare l'intervallo di tempo di ogni pixel come 2,4 s. Impostare l'intervallo di tempo tra due fotogrammi a 6 s per ridurre al minimo il fotosblaggio e il fotogrado alle celle. Impostare i fotogrammi di imaging totale a circa 300 fotogrammi per fornire una microscopia continua di 30 min in un singolo esperimento.
   NOT: L'intervallo di due fotogrammi adiacenti, i fotogrammi di imaging totali e il tempo di imaging della microscopia continua possono essere regolati in base ai requisiti sperimentali. Se un singolo esperimento dura più di 2 h, si prega di impostare il sistema di incubazione di CO₂ (mostrato nella Figura 4) per il microscopio come presente al passaggio 3.3 per fornire l'ambiente del 5% di CO₂ e 37 gradi centigradi per il mantenimento della vitalità cellulare. Se un singolo esperimento è limitato entro 2 h, il sistema di incubazione di CO₂ non è necessario.
3. Accendere il sistema di incubazione CO 2, accendere tutto il riscaldatore e impostare la temperatura di lavoro a 37 gradi centigradi. Attendere fino a quando la temperatura sale fino a 37 gradi centigradi e la concentrazione di CO₂ fino al 5%. Posizionare lo stadio dell'incubatore sullo stadio del microscopio come illustrato nella figura 4A.
4. Preparare le cellule hela trascate con ERK2-GFP come descritto al punto 2.
   NOT: In un singolo esperimento, lo schema Stim-A o Stim-B viene applicato per fornire fotostimolazione alle cellule. I passaggi 3.5 e 3.6 presentano i passaggi dettagliati ai sensi rispettivamente di Stim-A e Stim-B.
5. Fornire la stimolazione laser al femtosecondo nelle cellule bersaglio utilizzando la modalità Stim-A
   NOT: Prima della procedura di fotostimolazione, assicurarsi che il diametro della messa a fuoco sia di circa 2 m. Questo processo è descritto nei passaggi 3.5.1 e 3.5.2.This process is described in step 3.5.1 and 3.5.2.
   1. Prendere il piatto contenente cellule trafettate con ERK2-GFP dall'incubatrice e mettere il piatto sullo stadio del microscopio.
   2. Avviare la modalità di scansione rapida tramite il software operativo al microscopio. Regolare l'obiettivo di acquisire immagini fluorescenti chiare delle cellule. Interrompere la scansione rapida. Passare alla modalità di imaging del campo luminoso dalla telecamera CCD (Figura 2A). Aprire l'otturatore e regolare la distanza tra due lenti del telescopio relè per garantire che il diametro della messa a fuoco laser del femtosecondo sia di 2 m (Figura 2B). Chiudere l'otturatore per completare la regolazione.
      NOT: Una freccia di riferimento può essere etichettata per indicare la messa a fuoco laser (Figura 2). Nel frattempo, una freccia di riferimento può anche impostare al centro della finestra di imaging fluorescente per indicare la posizione del fuoco del laser femtosecondo.
   3. Impostare la potenza del laser femtosecondo a 15-40 mW (810 nm, 65 fs, 80 MHz) o 20-60 mW (1040 nm, 120 fs, 50 MHz) sul campione. Impostare l'orario di apertura dell'otturatore a 0,05-0,2 s.
   4. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare una cella di destinazione ben espressa ERK2-GFP.
   5. Spostare lo stage per localizzare l'area del citosol della cella di destinazione selezionata al centro del FOV nell'imaging del campo luminoso della telecamera CCD (Figura 2A).
   6. Fare clic sul pulsante Avvia in basso per avviare lo stato di avanzamento dell'imaging di microscopia continua.
   7. Aprire l'otturatore in qualsiasi intervallo di tempo predefinito per fornire la stimolazione laser del femtosecondo progettata al passaggio 3.5.3 nella cella di destinazione.
      NOT: (1) La fotostimolazione può essere eseguita in qualsiasi momento nella sequenza di microscopia confocale controllata dall'otturatore. (2) La fotostimolazione può essere somministrata più volte nella stessa posizione durante la sequenza di microscopia confocale.
   8. Attendere il completamento del processo di imaging. Salvare i dati di imaging per un'ulteriore analisi dei dati.
6. Fornire la stimolazione laser al femtosecondo nelle cellule bersaglio utilizzando la modalità Stim-B
   1. Impostare la potenza del laser femtosecondo su 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) sul campione.
   2. Prendere il piatto contenente cellule trafettate con ERK2-GFP dall'incubatrice e metterlo sullo stadio del microscopio.
   3. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare una cella di destinazione ben espressa ERK2-GFP.
   4. Impostare il processo di imaging confocale come passaggio 3.2. Definire un fotogramma di scansione speciale come fotogramma di stimolazione nel processo di imaging. Definire il parametro del fotogramma di simulazione.
      1. Impostare una regione di scansione (2 x 2-3 x 3 m²) nell'area del citosol vicino al nucleo nella cella di destinazione.
      2. Impostare il tempo di scansione totale a 0.1-0.2 s. Sincronizzare l'otturatore del laser femtosecondo con la scansione confocale in base all'area di fotostimolazione predefinita, che è aperta solo quando la scansione laser scende nel telaio di stimolazione e si chiude immediatamente quando si spegne.
         NOT: (1) La regione fototimulazione può essere impostata su qualsiasi dimensione. (2) La fotostimolazione può essere eseguita in qualsiasi fascia oraria predefinita nella sequenza di microscopia confocale. (3) La fotostimolazione può essere eseguita più volte sulla stessa o diversa area predefinita nel FOV in quella sequenza di microscopia confocale.
   5. Fare clic sul pulsante Avvia in basso per avviare lo stato di avanzamento dell'imaging di microscopia continua.
   6. Attendere il completamento del processo di imaging. Salvare i dati di imaging per un'ulteriore analisi dei dati.
7. Spegnere il laser al femtosecondo e il microscopio confocale dopo l'esperimento.

4. Attivazione di eIF4E (Substrato di ERK) da parte della simulazione laser Femtosecond

1. Preparazione delle cellule di Hela
   1. Seguire i passaggi 2.1.1-2.1.5.
   2. Semina 20.000 cellule in una piastra Petri con griglie di localizzazione cellulare (Figura 3B) per localizzare le cellule fotostimolate. Aggiungere un supporto di coltura fino a 1 mL.
   3. Rimettere il piatto con le cellule nell'incubatrice. Incubare le cellule a 24 h a 37 gradi centigradi prima del trattamento laser al femtosecondo.
2. Accendere il laser a femtosecondi e assicurarsi che l'otturatore sia chiuso.
3. Accendere il microscopio confocale a scansione laser e aprire il software del microscopio.
4. Preparare il sistema di incubazione CO₂ come dichiarazione al punto 3.3.
5. Fornire la stimolazione laser al femtosecondo nelle cellule bersaglio utilizzando la modalità Stim-A
   1. Impostare la potenza del laser femtosecondo a 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1.040 nm) sul campione. Impostare l'orario di apertura dell'otturatore a 0,05-0,2 s.
   2. Prendere il piatto con le cellule dell'incubatrice e montarlo nell'incubatrice di CO₂ sullo stadio del microscopio.
   3. Spostare l'obiettivo in direzione verticale per posizionare il piano di imaging sotto l'imaging del campo luminoso della telecamera CCD. Spostare lo stage del prome in direzione orizzontale per assicurarsi che nessuna cella si localizzi al centro di FOV. Aprire l'otturatore e regolare la distanza tra due lenti del telescopio relè per garantire il diametro della messa a fuoco laser del femtosecondo a 2 m. Chiudere l'otturatore per completare la regolazione.
   4. Spostare lo stadio del microscopio per selezionare in modo casuale le griglie da 5-10. Può essere indicato e localizzato dalle griglie nella parte inferiore dei piatti Petri sotto l'imaging a campo luminoso della fotocamera CCD. Contrassegnare/registrare le coordinate delle griglie selezionate nel piatto.
   5. Stimolare manualmente tutte le celle posizionate nelle griglie selezionate una ad una sotto l'imaging a campo luminoso della telecamera CCD.
6. Rimettere il piatto nell'incubatrice. Incubare le cellule a 24 h a 37 gradi centigradi prima della microscopia immunofluorescenza. Spegnere il laser femtosecondo e il microscopio confocale dopo la procedura di fototimualtion.
7. Microscopia immunofluoreescenza del fosforo eIF4E nelle cellule con fotostimolazione per la conferma dell'attivazione di ERK
   1. Prendere il piatto contenente cellule con trattamento di fotostimolazione nel passaggio 4.5 dall'incubatrice. Rimuovere il supporto di coltura. Lavare le cellule con PBS una volta. Rimuovere PBS.
   2. Aggiungere nel piatto 1 mL di paraformaldeide del 5% (4 gradi centigradi). Fissare le cellule con 5% paraformaldeide per 10 min. Rimuovere il buffer di paraformaldeide. Lavare le celle con PBS per 5 min due volte. Rimuovere PBS.
   3. Aggiungere 1 mL di 0,5% Triton X-100 nel piatto. Incubare le cellule 15 min a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer Triton X-100. Lavare le celle con PBS per 5 min due volte. Rimuovere PBS.
   4. Aggiungere 1 mL di 1% tamponi BSA nel piatto. Incubare le cellule 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer BSA.
   5. Diluire l'anticorpo anti-eIF4E (fosforo S209) in 1 mL di PBS con 1% di BSA ad una concentrazione finale di 1 g/mL. Aggiungere il tampone nel piatto. Incubare le cellule per 10-12 h a 4 gradi centigradi. Rimuovere il buffer.
   6. Lavare le celle con PBS per 5 min due volte. Rimuovere PBS.
   7. Diluire l'anticorpo secondario anti-Rabbit IgG H&L in 1 mL di PBS con 1% di BSA ad una concentrazione finale di 2 g/mL. Aggiungere il tampone nel piatto. Incubare le cellule 2 h a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer.
   8. Lavare le cellule con PBS. Rimuovere PBS.
   9. Aggiungere 1 mL di PBS nel piatto.
   10. Accendere il microscopio confocale a scansione laser. Aprire il software del microscopio. Impostare il laser di eccitazione a 488 nm. Impostare il livello di potenza del laser a 488 nm a 0,1 mW. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel. Impostare l'intervallo di tempo di ogni pixel come 2,4 s.
   11. Mettere il piatto con cellule di colorazione immunofluorescente sullo stadio del microscopio. Individuare le caselle selezionate sotto l'imaging a campo luminoso della fotocamera CCD.
   12. Avviare la scansione confocal a singolo fotogramma. Salvare le immagini fluorescenti delle cellule di fotostimolazione.
   13. Spostare lo stage in modo casuale per individuare le aree senza stimolazione laser del femtosecondo. Avviare la scansione confocal a singolo fotogramma. Salvare le immagini fluorescenti di nessuna cella di stimolazione come dati di controllo.
8. Spegnere il microscopio confocale dopo l'esperimento.

5. Attivazione di Mitoflashes e altri eventi mitocondriali per fotostimolazione

NOT: Per osservare la dinamica morfologica mitocondriale, le cellule di Hela vengono trascate con Mito-GFP nel passaggio 5.1 per indicare fluorescente i mitocondri. Per osservare le stracichie, le cellule hela vengono trasinate con mt-cpYFP nel passaggio 5.1.

1. Preparare le cellule Hela trascate con Mito-GFP o mt-cpYFP dopo il passaggio 2.
2. Accendere il laser femtosecondo e assicurarsi che l'otturatore sia chiuso.
3. Accendere il microscopio confocale a scansione laser. Impostare il laser di eccitazione a 488 nm. Impostare il livello di potenza del laser a 488 nm a 0,1 mW. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel. Impostare il tempo totale di imaging di ogni fotogramma come 2,2 s. Impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi a 0 s. Impostare i fotogrammi di imaging totali come 200 fotogrammi per fornire una microscopia continua di 440 s in un singolo esperimento.
   NOT: L'intervallo di due fotogrammi adiacenti, i fotogrammi di imaging totali e il tempo di imaging della microscopia continua possono essere regolati in base ai requisiti sperimentali.
4. Preparare il sistema di incubazione DI CO₂ come descritto al punto 3.3 se necessario.
5. Fornire la stimolazione laser al femtosecondo nella mitocondria bersaglio utilizzando la modalità Stim-A
   1. Prendere il piatto contenente le cellule trafettate con Mito-GFP o mt-cpYFP dall'incubatrice e mettere il piatto sullo stadio del microscopio.
   2. Controllare lo stato del laser femtosecondo come passo 3.5.2. Assicurarsi che la messa a fuoco del laser femtosecondo si trovi al centro di FOV. Impostare una freccia di riferimento al centro della finestra di imaging fluorescente per indicare la posizione dello stato attivo.
   3. Impostare la potenza del laser femtosecondo a 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) sul campione. Impostare l'orario di apertura dell'otturatore a 0,05-0,1 s.
   4. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare una cella di destinazione ben espressa Mito-GFP o mt-cpYFP.
   5. Selezionare un mitocondrione in modo casuale nella cella di destinazione come soggetto sperimentale. Spostare lo stadio del microscopio per localizzare la struttura tubolare mitocondriale di destinazione al centro di FOV (indicare dalla freccia di riferimento) in modalità di scansione rapida.
   6. Fare clic sul pulsante Avvia in basso per avviare lo stato di avanzamento dell'imaging di microscopia continua.
   7. Aprire l'otturatore in qualsiasi momento predefinito per fornire la stimolazione laser del femtosecondo progettata al punto 5.5.3 nella struttura tubolare mitocondriale di destinazione.
      NOT: (1) L'esposizione al laser femtosecondo sulla struttura tubolare mitocondriale può essere controllata dall'otturatore in qualsiasi momento durante la microscopia confocale. (2) Eseguire un solo esposizione femtosecondo-laser in un esperimento perché una stimolazione laser femtosecondo può perturbare lo stato mitocondriale per un lungo periodo.
   8. Attendere il completamento del processo di imaging. Salvare i dati di imaging per un'ulteriore analisi dei dati.
6. Spegnere il laser al femtosecondo e il microscopio confocale dopo l'esperimento.

6. Oscillazione del potenziale della membrana mitocondriale sui mitocondri bersaglio nelle cellule Hela mediante stimolazione laser femtosecondi

1. Preparare le celle Hela seguendo i passaggi 2.1.1-2.1.6.
2. Incubare le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi prima dell'esperimento.
3. Preparare la soluzione di colorazione TMRM: diluire il TMRM in 1 mL di DMEM con 10% FBS ad una concentrazione finale di 100 nM.
4. Togliere il piatto con le cellule preparate nei gradine 5.2.1 e 5.2.2 dall'incubatrice. Rimuovere il supporto di coltura. Aggiungere la soluzione di colorazione TMRM preparata nel passaggio 6.3 nel piatto. Macchie per 15-20 min a 37 gradi centigradi nell'incubatrice. Rimuovere la soluzione di colorazione. Lavare le cellule con PBS una volta. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura nel piatto.
5. Accendere il laser femtosecondo e assicurarsi che l'otturatore sia chiuso.
6. Accendere il microscopio confocale a scansione laser. Aprire il software del microscopio. Impostare il laser di eccitazione a 532 nm. Impostare il livello di potenza del laser di 532 nm a 0,1 mW. Impostare le dimensioni dell'imaging su 512 x 512 pixel e il tempo di generazione dei fotogrammi su 2,2 s. Impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi a 0 s. Impostare i fotogrammi di imaging totali come 200 fotogrammi per fornire una microscopia continua di 440 s in un singolo esperimento.
   NOT: L'intervallo di due fotogrammi adiacenti, i fotogrammi di imaging totali e il tempo di imaging della microscopia continua possono essere regolati in base ai requisiti sperimentali.
7. Preparare il sistema di incubazione CO₂ descritto al punto 3.3, se necessario.
8. Utilizzare la modalità Stim-A per fornire la stimolazione laser femtosecondo nel mitocondrio bersaglio. Segui i passaggi 5.5.1-5.5.8 per completare l'esperimento.
   NOT: Nel passaggio 6.8, selezionare un mitocondrio che è ben macchiato con TMRM come mitocondrio bersaglio.
9. Spegnere il laser al femtosecondo e il microscopio confocale dopo l'esperimento.

7. Cambiamenti di Bax e Citochrome C sul target Mitocondri nelle cellule Hela da stimolazione laser femtosecondo

NOT: In questo esperimento, semina le cellule nei piatti Petri con griglie di localizzazione cellulare (Figura 3B) per localizzare la cellula trattata dal laser a femtosecondi. Macchiare le cellule con TMRM per localizzare il mitocondrio che viene selezionato per essere stimolato dal laser femtosecondo.

1. Preparare le cellule di Hela in una piastra Petri con griglie di posizione delle celle (Figura 3B) come descritto nel passaggio 4.1.
2. Macchiare le cellule con TMRM come descritto nei passaggi 6.3 e 6.4.
3. Accendere il laser femtosecondo e assicurarsi che l'otturatore sia chiuso.
4. Accendere il microscopio confocale a scansione laser. Aprire il software del microscopio. Impostare il laser di eccitazione a 532 nm. Impostare il livello di potenza del laser di 532 nm a 0,1 mW. Impostare le dimensioni dell'imaging su 512 x 512 pixel e il tempo di generazione dei fotogrammi su 2,2 s. Impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi su 0 s. Impostare i fotogrammi di imaging totali come 50 fotogrammi per fornire una microscopia continua di 110 s in un singolo esperimento.
5. Fornire la stimolazione laser al femtosecondo nella mitocondria bersaglio utilizzando la modalità Stim-A
   1. Impostare la potenza del laser femtosecondo a 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) sul campione. Impostare l'orario di apertura dell'otturatore a 0,05-0,1 s.
   2. Prendere il piatto contenente le cellule macchiate con dall'incubatrice e mettere il piatto sullo stadio del microscopio.
   3. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare la cella di destinazione che è ben macchiata con TMRM.
   4. Spostare lo stage per localizzare la struttura tubolare mitocondriale di destinazione al centro di FOV utilizzando la modalità di scansione rapida. Contrassegnare la coordinata della griglia in cui si trova la cella selezionata nell'imaging dei campi luminosi.
   5. Fare clic sul pulsante Avvia in basso per avviare lo stato di avanzamento dell'imaging di microscopia continua.
   6. Aprire manualmente l'otturatore a qualsiasi tempo predefinito di avanzamento dell'imaging a microscopia per fornire la stimolazione laser del femtosecondo progettata al punto 7.5.1 nella struttura tubolare mitocondriale del bersaglio.
   7. Attendere il completamento del processo di imaging. Contrassegnare il mitocondrio selezionato che viene simulato dal laser a femtosecondi. Salvare i dati di imaging per un'ulteriore analisi dei dati.
   8. Spegnere il laser al femtosecondo e il microscopio confocale dopo l'esperimento. Preparare la microscopia all'immunofluorescenza di Bax o citocromatica C sulle cellule dell'esperimento.
6. Microscopia immunofluoreescenza di Bax o citochrome C sul laser femtosecondo mitocondrio trattato.
   1. Prendi il piatto dalla fase del microscopio.
   2. La colorazione immunofluorescente completa di Bax o citocromo C segue i passi 4.7.1-4.7.9.
      NOT: Utilizzare l'anti-Bax o l'anti-citocromo C invece dell'anti-eIF4E nel passaggio 4.7.5 per terminare la colorazione immunofluorescente di Bax o citochrome C nel passaggio 7.6.2.
   3. Accendere il microscopio confocale a scansione laser e aprire il software del microscopio. Impostare il laser di eccitazione a 488 nm e 532 nm. Impostare il livello di potenza di 488 nm e 532 nm laser a 0,1 mW. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel e il tempo di generazione del fotogramma su 2,2 s.
   4. Mettere il piatto con cellule di colorazione immunofluorescente sullo stadio del microscopio. Individuare la griglia selezionata sotto l'imaging a campo luminoso della fotocamera CCD. Individuare la cella trattata dal laser femtosecondo.
   5. Avviare la scansione confocal a singolo fotogramma. Individuare il mitocondrio stimolato dal laser a femtosecondi. Salvare l'immagine fluorescente della cella di fotostimolazione per un'ulteriore analisi dei dati.
7. Spegnere il microscopio confocale dopo l'esperimento.

La fotostimolazione può essere eseguita contemporaneamente insieme alla microscopia a scansione confocale continua. La fotostimolazione può iniziare in qualsiasi fascia oraria predefinita nella sequenza di microscopia confocale time-lapse. La microscopia confocale può monitorare le molecole cellulari mediante imaging fluorescente. Le risposte molecolari alla fotostimolazione e ad altre dinamiche possono essere identificate in questo modo. Teoricamente, se ERK è attivato, sarà fosfolato spostare dal citoplasma al nucleo cellulare²⁷. Il destino specifico delle cellule può essere regolato da alcuni modelli di questo segnale ERK²⁸. In studi recenti, la modulazione ottica basata su optogenetica ha fornito un elevato controllo preciso del segnale ERK in durata e grandezza e ha rivelato che la trasmissione del segnale ERK perturbato guida la proliferazione impropria nelle cellule tumorali^{7, 8}. Qui, dimostriamo la traslocazione ERK2 nel nucleo dopo aver trattato la cellula con un breve flash del laser femtosecondo utilizzando il metodo presentato in questo protocollo. Come mostrato nella Figura 5A, la fluorescenza ERK2-GFP raggiunge il massimo dopo alcuni minuti di simulazione laser a femtosecondi. Le molecole ERK2 saranno depforosforate dopo aver attivato i substrati a valle nel nucleo, e poi l'ERK2 torna al citoplasma indicato dalla diminuzione della fluorescenza nucleare di GFP. ERK2 può essere attivato per più volte da più fotostimolazioni (Figura 5B). Pertanto, è in grado di manipolare il modello di segnale ERK2 con precisione controllando il tempo di intervallo tra gli stimoli multipli. Inoltre, ERK2 può essere attivato in celle adiacenti intorno alla cellula stimolata occasionalmente (Figura 5C). Questa osservazione indica che alcune molecole diffusibili possono essere rilasciate dalla cellula trattata con il laser a femtosecondi per attivare l'ERK2 nelle cellule adiacenti. La fosforolalazione della proteina a valle ERK2 eIF4E può essere confermata e visualizzata mediante microscopia immunofluorescenza (Figura 5D). Questo risultato indica che la stimolazione laser del femtosecondo può attivare con successo il percorso di segnalazione ERK. Risultati più dettagliati sono in Wang S., et al.

I flash ossidativi mitocondriali (mitoflashes) sono esplosioni ossidative nei mitocondri che sradicano da complesse dinamiche molecolari mitocondriali. Nell'ultimo decennio, i mitoflashes sono considerati un evento elementare di segnalazione dei mitocondri e prendono una parte importante nelle funzioni cellulari multitudine^29,30,31. Tradizionalmente, i mitoflashes sono di solito osservati per caso quando si trattano le cellule con sostanze chimiche per fornire stress indiretto ai mitocondri^29,30. Implementando questo schema di fotostimolazione, otteniamo un modo controllabile e preciso per eccitare i mitoflashes a livello tubolare mitocondriale singolo. L'eccitazione mitoflash di successo è mostrato in Figura 6A. È interessante notare che le proprietà di mitoflashes come il picco dell'impulso, la larghezza e le durate di risposta³² sono strettamente correlate alla potenza laser del femtosecondo. Un'analisi quantitativa più dettagliata dei mitofci eccitati dalla stimolazione laser femtosecondo è in Wang S., et al.³². Questa fotostimolazione ai mitocondri mostra anche varietà di dinamiche molecolari mitocondriali, tra cui la frammentazione e il ripristino della morfologia mitocondriale (Figura 6B), e l'oscillazione del potenziale della membrana mitocondriale ( Figura 6C). Simile ai mitoflashes attivati dal foto, questi eventi di mitocondri hanno prestazioni diverse con diverse intensità di potenza della fotostimolazione. È diverso dall'attivazione del percorso di segnalazione ERK. L'influenza del laser femtosecondo è fortemente limitata su un singolo tubo mitocondriale. Risultati più dettagliati sono in Wang Y., et al. ²⁴ e Shi F., et al. ²⁵.

Figura 1: Lo schema di fotostimolazione stabilito su un accoppiamento laser femtosecondo in un microscopio confocale. (A) Percorsi ottici del sistema di fotostimolazione e imaging confocale. Il laser femtosecondo è inizialmente diviso da uno splitter 50/50 fascio in due raggi. La trasmissione è espansa da un telescopio a staffetta e poi riflessa nell'obiettivo di formare Stim-A. Il fascio di riflessione è allineato attraverso il sistema di scansione al microscopio per formare Stim-B. Una telecamera CCD viene utilizzata per fornire un'imaging luminoso-felide per monitorare le cellule e la messa a fuoco del laser femtosecondo in modalità Stim-A. Stim-A - un fuoco fisso nel centro di FOV; Stim-B - un telaio di scansione speciale in un'area pre-progettata. DM - specchio dicrotrico, BS - separatore del fascio, RM - specchio riflettente. La lunghezza d'onda del laser a scansione confocale è di 488 nm/532 nm/635 nm e l'intervallo tipico della lunghezza d'onda di raccolta di fluorescenza è <560 nm/560-625 nm/> 625 nm/> 625 nm. Il laser a fibra femtosecondo (1.040 nm, 120 fs, 50 MHz, 1 W) può essere sostituito da un laser Ti - Sapphire (810 nm, 80 MHz, 65 fs, 1 W) o da altri oscillatori laser a femtosecondi commerciali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Nella modalità Stim-A, la localizzazione e le dimensioni del laser del femtosecondo sulla cella bersaglio nel piano di imaging confocale sotto l'imaging brillante-felide. (A) Il laser a femtosecondi è bloccato dall'otturatore. (B) Il laser femtosecondo è acceso. Freccia: la freccia di riferimento è impostata al centro di FOV per confermare che la messa a fuoco laser del femtosecondo individua la posizione corretta. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il piatto Petri utilizzato per esperimenti di coltura cellulare, trasfezione e fotostimolazione. (A) La piastra Petri da 35 mm con un diametro di 15 mm e un fondo di vetro spessore 0,17 mm. (B) Il piatto Petri da 35 mm con fondo di vetro e una griglia di localizzazione delle celle impressa da 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Il sistema di incubazione di CO 2. (A) Lo stadio dell'incubatore di CO₂ e (B) il pannello di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: fotoattivazione di ERK utilizzando la modalità Stim-A. (A) Lo stimolo fotografico singolo (1.040 nm, 40 mW, 0,1 s) induce la traslocazione ERK2-GFP nel nucleo e poi di nuovo al citoplasma. (B) Modello di segnale ERK2 mediato da esposizione laser a singolo femtosecondo (freccia rossa, 1.040 nm, 40 mW, 0,1 s) e due fotostimolazioni (frecce verdi, 810 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) Attivazione di ERK nelle cellule circostanti mediante esposizione laser a singolo femtosecondo corto nella cella bersaglio (freccia bianca, 810 nm, 24 mW, 0,2 s). (D) L'immunofluorescenza di eIF4E-P mostra un aumento significativo 24 h dopo la fotosimulazione singola (810 nm, 25 mW, 0,2 s). Barra della scala: 10 m (A) e 20 m (B, C). La fluorescenza di ERK2-GFP e eIF4E-P è eccitata dal laser di eccitazione a 488 nm e raccolta nel canale <560 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Più eventi di mitocondri indotti dalla fotostimolazione in modalità Stim-A. (A) Eccitazione del mitoflash sul tubulo mitocondriale stimolato da singolo stimolo (810 nm, 16 mW, 0,1 s). (B) Frammentazione e restauro morfologico mitocondriale indotta da una singola fotostimolazione (1.040 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) Oscillazione del potenziale della membrana mitocondriale mediante stimolazione laser a singolo femtosecondo (1040 nm, 20 mW, 0,1 s). Le frecce in (A) (B) e (C) indicano la posizione delle fotostimolazioni. Barra della scala: 10 m. La fluorescenza di Mito-GFP o mt-cpYFP è eccitata dal laser a eccitazione a 488 nm e raccolta nel canale <560 nm. La fluorescenza di TMRM è eccitata dal laser di eccitazione di 532 nm e raccolta nel canale 560-625 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Durata di stimolazione raccomandata e potenza media del laser femtosecondo in modalità Stim-A.

Tabella 2: Durata raccomandata della stimolazione e potenza media del laser femtosecondo in modalità Stim-A a 2 x 2-3 x 3 m ^{2 Il} nome del sistema nella cella.

Dimostriamo una strategia di fotostimolazione combinando un laser a femtosecondi con un sistema al microscopio confocale a scansione laser. La fotostimolazione può funzionare direttamente come una microscopia a due fotoni definendo Stim-B di conseguenza. Forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un breve flash del laser a femtosecondi per attivare la segnalazione elamentatrici nelle celle bersaglio. Le diverse modalità di stimolazione possono essere eseguite secondo diversi scopi sperimentali e sistemi. Stim-A può essere facilmente impostato sulla base di un microscopio confocale. Il laser femtosecondo può essere focalizzato a livello di limite di diffrazione al centro FOV. Il bersaglio subcellulare deve essere spostato manualmente nella posizione di messa a fuoco laser del femtosecondo e può essere stimolato per durate arbitrarie, totalmente indipendente dalla microscopia confocale. Pertanto, Stim-A può proteggere perfettamente il campione che si trova fuori dall'area di messa a fuoco ed è adatto per la fotostimolazione a lunga durata. La regione di stimolazione di Stim-B può essere predefinita come qualsiasi area del FOV. Può essere eseguita automaticamente. Ma la durata della stimolazione e il tempo di esposizione possono seguire solo con la scansione confocale. Dopo aver impostato il tempo di peritura di ogni pixel e la dimensione totale del fotogramma, la durata della stimolazione in un singolo fotogramma di microscopia è effettivamente fissata. La fotostimolazione può anche essere eseguita periodicamente fotogramma per fotogramma. Può anche essere utilizzato per attivare fotosensibilizzanti e proteine optogenetiche che richiedono meno durata dell'esposizione ma ampia area.

Una considerazione fondamentale in questo protocollo è come determinare i parametri della stimolazione laser del femtosecondo. Secondo i nostri studi precedenti, l'attività molecolare cellulare è per lo più indotta da multifotone exaction^{17,21,22,23,24,25}. Generalmente l'efficienza dell'estraazione multifotona è correlata a tutti i parametri laser del femtosecondo, tra cui la lunghezza d'onda, la larghezza dell'impulso, la velocità di ripetizione. La risposta cellulare è ulteriormente correlata contemporaneamente alla potenza laser, alla posizione/regione di stimolazione e alla durata dell'esposizione. In linea di principio, l'efficienza della stimolazione è in conflitto con la sicurezza delle cellule. La fotostimolazione più forte, come una maggiore potenza media, una durata di stimolazione più lunga e una maggiore energia laser incidente totale contribuisce a una maggiore efficienza di stimolazione, ma porta maggiori rischi di danni alle cellule. Poiché tali parametri sono anche relativi tra loro e tutti contribuiscono alla stimolazione e all'effetto danno, è impossibile utilizzare un solo parametro, come l'energia laser incidente totale, o potenza media laser, per definire che è sicuro o meno. Considerando sia l'efficienza di attivazione del segnale che la sicurezza delle cellule, qui forniamo la potenza media raccomandata e la durata di stimolazione di due sorgenti laser femtosecondi come riferimento nella tabella 1 e nella tabella 2. Inoltre, i parametri della stimolazione laser del femtosecondo dovrebbero essere cambiati in base al sistema ottico effettivo e al campione biologico.

Secondo le discussioni di cui sopra, intendiamo presentare più dettagliate gamme efficaci di parametri di fotostimolazione. La lunghezza d'onda del laser femtosecondo può essere modificata a intervalli NIR utilizzati per la fotostimolazione. La larghezza dell'impulso deve essere breve per fornire un'elevata potenza di picco e un'elevata efficienza di esazione non lineare. Per questo protocollo non è consigliata la durata dell'impulso prolungato. Di solito, la larghezza tipica dell'impulso per la microscopia a due fotoni (<200 fs) è la scelta giusta. Il tasso di ripetizione del laser non è un fattore chiave. La frequenza di ripetizione fino a MHz è adatta a questo protocollo. Il fattore più critico per le risposte molecolari cellulari è la potenza laser e la durata di stimolazione del laser femtosecondo. Per attivare ERK, secondo il nostro lavoro precedente²², la potenza media a 15 mW (810 nm) o 20 mW (1.040 nm) e la durata dell'esposizione a 0,2 s sono sufficienti per fornire una stimolazione sufficiente per attivare la segnalazione ERK pur mantenendo la vitalità delle cellule ultraalte in Cellule di Hela. Al contrario, una potenza media di oltre 80 mW (810 nm) o 120 mW (1.040 nm) e una durata di esposizione superiore a 1 s possono indurre danni irreversibili alle cellule. I mitocondri sono generalmente più sensibili alla fotostimolazione. La stimolazione con una potenza media superiore a 40 mW (810 nm) o 80 mW (1.040 nm) e la durata di esposizione superiore a 0,2 s può indurre danni significativi come la frammentazione irreversibile nel mitocondrio stimolato o anche in tutti i mitocondri in tutta la cellula. Va notato che la fotosensibilità dei mitocondri alla fotostimolazione varia molto in diversi tipi di cellule. Ad esempio, nelle celle HeLa, la potenza del laser ha bisogno solo di circa 6 mW (810 nm, durata 0,1 s). Tutti i mitocondri possono rispondere alla fotostimolazione sotto forma di frammentazione, mitragliatori e oscillazioni MMP. Ma nelle cellule staminali mesenchimale umane, la potenza deve essere aumentata a circa 15 mW (810 nm, 0,1 s di durata), e ancora circa la metà stimolata mitocondri non mostra no risposta alla fotostimolazione. Nella modalità Stim-B, un altro fattore può influenzare l'efficienza di attivazione della foto e il danno cellulare è l'area di stimolazione. La fotostimolazione può causare danni alle cellule fornendo su una piccola area di stimolazione. Ma la stessa stimolazione potrebbe non riuscire ad attivare ERK fornendo su un'area di stimolazione più ampia. Si consiglia che l'area di stimolazione nella cella bersaglio sia di circa 2 x 2-3 x 3 m² e non superi i 25 m².

Anche la localizzazione della regione di stimolazione è importante per l'applicazione di questo protocollo. Secondo i lavori precedenti^17,22, la fotostimolazione in quella zona può esaurire il negozio Ca^{2 in} ER in modo efficace e attivare il canale CRAC. Quindi, l'afflusso di Ca^{2 o più} può attivare il percorso di segnalazione ERK successivamente. Pertanto, si consiglia di fornire la fotostimolazione nella regione ER nelle cellule di Hela per ottenere un'elevata efficienza di attivazione del CIOC. La regione ER può essere facilmente distinta dal citoplasma o dal nucleo in microscopia a campo luminoso per un obiettivo di contrasto di fase. Al fine di introdurre eventi di segnalazione mitocondriale, l'attenzione del laser femtosecondo può essere facilmente montata sulla struttura mitocondriale selezionata seguendo le relative procedure.

I metodi di fotostimolazione descritti in questo protocollo possono anche essere utilizzati per influenzare altri eventi cellulari multipli, come l'induzione di segnali Ca² e ROS^17,20,21. Va notato che tutti quei lavori precedenti hanno fornito la valutazione della sicurezza cellulare dopo la fotostimolazione. Ad esempio, cambiamenti morfologici significativi delle cellule, gorbuli, frammentazione mitocondriale e gonfiore dell'intera cellula, diminuzione del tasso di proliferazione delle cellule e alcuni altri cambiamenti insoliti della fluorescenza durante la microscopia danni alle cellule. Dovrebbe essere molto attento a monitorare lo stato della cella. Tuttavia, con un buon controllo dei parametri di potenza e stimolazione del laser, la vitalità cellulare potrebbe essere mantenuta in un livello molto alto contemporaneamente con un'elevata efficienza di stimolazione. Quindi, questo metodo di fototimualtiona del laser femtosecondo è di buon potenziale per estendere ulteriormente a più aree e applicato in applicazioni pertinenti.