Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحفيز الصور بواسطة ليزر Femtosecond ينشط إشارات الكيناز (ERK) أو أحداث الميتوكوندريا في الخلايا المستهدفة

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

الليزر femtosecond مركزة بإحكام يمكن أن توفر التحفيز الدقيق للخلايا من خلال أن يقترن في مجهرية البؤرية تمكين المراقبة في الوقت الحقيقي وتحفيز الصور. يمكن للتحفيز الضوئي تنشيط الأحداث الجزيئية الخلية بما في ذلك ERK مسار الإشارات وومضات الميتوكوندريا من أنواع الأكسجين التفاعلية.

Abstract

السيطرة المباشرة على الأحداث الجزيئية الخلوية المحددة مهمة لعلوم الحياة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات أن تحفيز الليزر femtosecond يمكن تنشيط مسارات الإشارات الجزيئية الخلوية متعددة في وقت واحد. في هذا البروتوكول، نبين أنه من خلال اقتران الليزر femtosecond في المجهر البؤري، يمكن تحفيز الخلايا على وجه التحديد عن طريق الليزر مركزة بإحكام. يتم تنشيط بعض العمليات الجزيئية التي يمكن ملاحظتها في وقت واحد في وقت لاحق. نقدم بروتوكولات مفصلة للتحفيز الضوئي لتنشيط إشارة خارج الخلية ينظم kinase (ERK) إشارة المسار في خلايا هيلا. يمكن أيضًا تحفيز ومضات الميتوكوندريا من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وغيرها من أحداث الميتوكوندريا إذا ركزت نبض الليزر فيمتوثانية على بنية أنبوبية الميتوكوندريا معينة. ويشمل هذا البروتوكول المعالجة المسبقة للخلايا قبل التحفيز الضوئي، وتقديم التحفيز الضوئي بواسطة فلاش ليزر فيمتوثانية على الهدف، ومراقبة / تحديد التغيرات الجزيئية بعد ذلك. ويمثل هذا البروتوكول أداة بصرية لجميع البحوث البيولوجية ذات الصلة.

Introduction

تكنولوجيا السيطرة على جزيئات الإشارات الخلوية هي جزء مهم من تطور علوم الحياة. تقليديا، الطريقة الأكثر شيوعا هو العلاج البيوكيميائيبواسطة الأدوية أو المواد البيولوجية 1،2،3. على مدى العقد الماضي، اختراع علم الوراثة البصرية يفتح حقبة جديدة لتعديل الإشارات الجزيئية الخلوية. الانسياق مع البروتينات الحساسة الخفيفة عن طريق هندسة الجينات يجعل الضوء يصبح أداة قوية لتعديل مختلف أنشطة البروتين في الخلية المستهدفة. وقد حققت هذه التكنولوجيا تقدما مشجعا مثل الإثارة وتثبيط الإشارة العصبية، وتعزيز التعبير الجيني، والتلاعب أنماط الإشارات الخلوية، مما يؤدي إلى مصائر الخلايا المختلفة والتحقيق المرضي4،5 ،6،7،8،9. ومع ذلك، يمكن للضوء أن يعمل فقط عن طريق نقل الخلايا مع البروتينات البصرية. في المرحلة الحالية، هناك طرق نادرة تمكن الضوء من السيطرة على الجزيئات الخلوية مباشرة إلى جانب علم الوراثة البصرية.

الليزر Femtosecond وقد البحوث البيولوجية المتقدمة من خلال توفير كفاءة الإثارة متعددة الفوتون مع الحفاظ على سلامة بيولوجية جيدة. من خلال نشر استراتيجيات معالجة الصور المتنوعة، حققت العديد من الإنجازات مثل الفحص المجهري متعدد الفوتونات، والجراحة الدقيقة والتطبيقات الوراثية البصرية متعددة الفوتون اتّبع10،11،12،13 ،14،15،16. وتظهر التحقيقات الأخيرة أن تحفيز الليزر femtosecond قد ثبت كطريقة بصرية عالية الكفاءة للحث مباشرة على أحداث الإشارات الجزيئية. وقد وجد أن الأشعة الليزر ية فيمتوثانية شديدة التركيز على الشبكية الإندوبلازما (ER) قادرة على استنفاد الكالسيوم في ER وتنشيط قنوات الكالسيوم المنشطة من الكالسيوم (CRAC) لتشكيل إشارات الكالسيوم في الخلايا17. يمكن أن تنتشر إشارة الكالسيوم هذه المنشطة بالصورة بين أنواع متعددة من الخلايا18،19،20. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه أيضا القدرة على تنشيط مسارات إشارة الخلية مثل العامل النووي للخلايا T المنشطة (NFAT) وERK إشارة المسار21،22. من خلال ضبط كثافة وتوطين التعرض بالليزر femtosecond في الخلايا، على سبيل المثال، مع التركيز على الليزر على الميتوكوندريا، فإنه يمكن أن تؤثر على مورفولوجيا الميتوكوندريا والأحداث الجزيئية23،24، 25.على وجه التحديد، يمكن أن تكون متحمسة رشقات نارية من توليد ROS الميتوكوندريا عن طريق التحفيز الضوئي، والذي هو لاحظ ومضات الفلورسنت في الميتوكوندريا (ميتوفلاشز).

وبالتالي، فإن تكنولوجيا التحفيز الضوئي ذات إمكانات جيدة يمكن تطبيقها على نطاق واسع في البحوث البيولوجية ذات الصلة. بل هو أيضا فرصة جيدة لتوسيع تطبيقات الليزر femtosecond في السيطرة على جزيئات الإشارات الخلوية والوظائف إلى جانب الفحص المجهري. هنا، ونحن نقدم التفاصيل التقنية لتحفيز الصور. يتم تحقيق التحفيز الضوئي عن طريق ربط ليزر femtosecond إلى مجهر البؤري لتوفير خلية هدف واحد مع التحفيز الضوئي فلاش قصيرة. فإنه يمكن بدء كفاءة ويمكن التحكم فيها تفعيل ERK في الخلية. إذا كان التحفيز الضوئي يقع على بنية أنبوبي الميتوكوندريا، يمكن التحكم في إمكانات غشاء الميتوكوندريا، مورفولوجيا، ROS، والمسام الانتقالية نفاذية، عن طريق التحفيز الضوئي. بناء على هذا المخطط تحفيز الصور، ونحن نقدم طريقة مفصلة لتنشيط ERK مسار الإشارات والتأثير على أحداث الميتوكوندريا متعددة في خلايا هيلا. يوضح هذا البروتوكول عملية تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في الخلايا المستهدفة.

يتم إنشاء نظام التحفيز الضوئي على المجهر البؤري مع اقتران الليزر femtosecond في ذلك للتحفيز في وقت واحد والفحص المجهري المستمر. الليزر femtosecond (الطول الموجي: 1040 نانومتر، معدل التكرار: 50 ميغاهيرتز، عرض النبض: 120 fs، أقصى قدرة متوسط الناتج: 1 W) ينقسم إلى شعاعين قبل اقتران. واحد يتم توجيهها من خلال تلسكوب التتابع تتكون من زوج من العدسات. ثم ينعكس مباشرة في الفتحة الخلفية لهدف (60x, N.A. = 1.2, غمر المياه) لتشكيل التركيز الحد الانعراج (Stim-A). وينعكس الآخر إلى المسار البصري المسح الضوئي من المجهر البؤري للعمل كوضع المسح الضوئي اثنين فوتون (Stim-B). Stim-A يقدم نقطة تركيز ثابتة في وسط مجال الرؤية (FOV). Stim-B هي منطقة مسح بؤري جزئية مصممة مسبقًا في FOV. يظهر Stim-A وStim-B في الشكل 1A. توفر كاميرا CCD تحت المرآة الديكروية (DM) تصويرًا ميدانيًا مشرقًا لرصد تركيز ليزر femtosecond.

هناك بعض الضروريات الحاسمة للتجارب التالية. في هذا البروتوكول، يتم استخدام مصدر ليزر ألياف femtosecond (1040 نانومتر، 50 ميغاهرتز، 120 fs) كمثال. في الممارسة العملية، يمكن استخدام معظم المذبذبات femtosecond التجارية طالما أن عرض النبض أقصر من 200 FS وينبغي أن تكون كثافة الطاقة الذروة فوق مستوى 1011 ~ 1012 W/cm2. على سبيل المثال، تي: ليزر الياقوت يستخدم عادة للميكروسكوب متعدد الفوتونات قادر على استبدال الليزر femtosecond أظهرت في الشكل 1B. قوة الليزر وبعض المعلمات التحفيز الضوئي الأخرى تحتاج إلى ضبطها لأن المعلمات البصرية (عرض النبض، الطول الموجي، ومعدل التكرار) تختلف كثيرا في مختلف الليزر femtosecond التي تحفز بالتالي مختلف الكفاءة الإثارة multiphoton.

جنبا إلى جنب مع التحفيز بالليزر femtosecond، يوفر الفحص المجهري البؤري التصوير الخلوي المستمر لرصد الديناميات الجزيئية في الوقت الحقيقي في كل من وسائط Stim-A و Stim-B. يتم التحكم في كل من مخططات التحفيز الضوئي (Stim-A وStim-B) بواسطة مصراع ميكانيكي مع دقة ميلي ثانية (الشكل1).

في وضع Stim-A، يتم إصلاح موقف التركيز بالليزر في وسط FOV. يُستخدم مقراب ترحيل لضمان تركيز ليزر femtosecond على مستوى التصوير البؤري عن طريق ضبط المسافة بين عدسات في الاتجاه الرأسي (اتجاه انتشار الليزر، العمودي إلى مستوى التصوير البؤري، كما هو موضح في الشكل1). من خلال التصوير مشرق الميدان من كاميرا CCD، يمكن قياس قطر التركيز بالليزر (~ 2 ميكرومتر، الشكل 2B). يتم التحكم في فترات التحفيز وأوقات التعرض بواسطة مصراع أثناء عملية التصوير البؤري.

في وضع Stim-B، يمكن تعيين منطقة التحفيز مسبقًا يدويًا في برنامج التحكم في التصوير البؤري لأي شكل مثل الخط أو المضلع أو الدائرة. تتم مزامنة الغالق مع عملية المسح الضوئي البؤري. يفتح في الوقت المصمم ة مسبقا التي يتم تعيينها من خلال برنامج التحكم التصوير البؤري. ثم يتم مسح منطقة التحفيز بواسطة ليزر femtosecond كتنظير مجهري. وهكذا، يتم تحفيز العينة فقط عن طريق الليزر femtosecond عندما تدخل عملية المسح الضوئي البؤري إطار تصوير معين.

يمكن إنشاء نظام التحفيز الضوئي على كل من المجاهر المعدنية المقلوبة ومستقيمة وفقا لمواضيع التجربة. الخلايا في المختبر المستزرعة في أطباق بيتري هي أفضل للعمل مع المجاهر المقلوبة. الحيوانات، وخاصة أدمغة الحيوانات الحية، هي أكثر ملاءمة مع المجاهر تستقيم. في هذه الدراسة، نأخذ المجهر المقلوب كمثال. وتجدر الإشارة إلى أن غطاء طبق بيتري لا يفتح خلال التجارب بأكملها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تحذير: ويشمل البروتوكول الوارد أدناه استخدام ليزر فيمتوثانية من تقرير الجرد الوطني والمواد الكيميائية السامة. يرجى الانتباه إلى جميع الأضرار المحتملة الناجمة عن إجراءات التجربة. يرجى قراءة صحائف بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية ذات الصلة أو غيرها من المواد قبل الاستخدام. يرجى اتباع تعليمات السلامة من مرافق الليزر أو استشارة المهنيين للحصول على التوجيه قبل تشغيل مصدر الليزر.

1. الإعداد التجريبي

  1. إعداد نظام التحفيز الضوئي
    ملاحظة: يتكون النظام من ليزر فيمتوثانية وليزر (في نطاق مرئي للإثارة الفلورية) مسح المجهر البؤري. في الشكل 1، يتم استخدام ليزر فيمتوثانية الألياف (1040 نانومتر، 50 ميغاهيرتز، 120 fs، 1 W) لاقتران. المعلمات غير ثابتة أو ضرورية. ويمكن استبداله بـ Ti: Sapphire laser أو غيرها من المذبذبات التجارية فيفيمتوثانية في نطاق NIR.
    1. لحن على الليزر femtosecond والمجهر البؤري.
      ملاحظة: يرجى تعيين قوة الليزر femtosecond على مستوى منخفض (~ 50 مليواط/ ثانية) في عملية ضبط المسار البصري.
    2. استخدام المرايا العاكسة (RM1 و RM2 أظهرت في الشكل 1B)لتوجيه شعاع الليزر femtosecond من خلال مصراع الميكانيكية. افتح الغالق
    3. تعيين 50/50 شعاع الخائن (BS، الشكل 1B)لتقسيم شعاع الليزر femtosecond إلى شعاعين منفصلين (شعاع الإرسال وشعاع انعكاس). توجيه RM2 وBS لجعل شعاع الليزر femtosecond يتزامن مع شعاع الليزر المسح الضوئي.
      ملاحظة: (1) يتم استخدام قزحية مرجعية (قزحية 1، الشكل 1B)خلف المرآة ثنائية الأبعاد طويلة التمرير (DM، 700 نانومتر قطع على الطول الموجي، الشكل 1B)لتحديد موقع مسار الليزر المسح الضوئي. (2) يمكن للنظام العمل فقط في وضع Stim-A أو Stim-B، على التوالي. لوضع Stim-A، يمكن إزالة BS. بالنسبة لـ Stim-B، يمكن استبدال BS بـ RM.
    4. تعيين تلسكوب ترحيل يتكون من زوج من العدسات لتوسيع عرض شعاع الإرسال، والذي يتكون من الفتحة الخلفية للهدف.
      ملاحظة: (1) يتم تعيين القزحية المرجعية 2 و 3 (الشكل1B)لcollimate شعاع الليزر femtosecond (الشكل1B). (2) يعتمد تكبير مقراب التتابع على القطر الأصلي لشعاع الليزر فيمتوالثانية وقطر الفتحة الخلفية للهدف.
    5. توجيه RMs (RM 3-5، الشكل 1B)لمحاذاة شعاع الموسعة في المجهر. توجيه RM 4 و RM 5 لضبط تركيز الليزر femtosecond إلى مركز FOV.
    6. قياس كفاءة انتقال الهدف من الليزر femtosecond.
      ملاحظة: يرجى قياس قوة الليزر في Stim-A وStim-B على التوالي بسبب مسارات اختراق مختلفة من الليزر في هذين الوضعين. وسوف تستخدم الطاقة في العينة لتوضيح إجراءات التجربة ذات الصلة أدناه.
    7. ضبط قبالة مصراع، ليزر femtosecond والمجهر البؤري حتى تبدأ التجارب.
      ملاحظة: في التجارب التالية، Stim-A وStim-B لا تعمل معا. إذا كنت تستخدم Stim-A، فإن شعاع الليزر femtosecond من Stim-B يحتاج إلى حظر. من ناحية أخرى، يجب حظر شعاع Stim-A إذا كان النظام يعمل في وضع Stim-B.
  2. إعداد وسط الثقافة: Dulbecco تعديل النسر المتوسطة (DMEM) الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
  3. إعداد ERK2-GFP بلازميد الحمض النووي، ميتو-GFP DNA بلازميد والميتوكوندريا مصفوفة استهداف دائري بروتين الفلورسنت الأصفر المنضوض (mt-cpYFP) بلازميد الحمض النووي. الحفاظ على بلازميدس في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. إعداد رباعي ميثيل رودامين (TMRM, 100 μM), وpolyethylenimine (PEI 1 ملغ/مل). الاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها.
  5. إعداد 5٪ بارافورماليد، 0.5٪ تريتون X-100، المضادة للeIF4E (eukaryotic عامل بدء الترجمة 4E)، الأجسام المضادة (الفوسفور S209، 1 ملغ / مل)، المضادة للباكس الأجسام المضادة (1 ملغ / مل)، المضادة للسيتوكروم C الأجسام المضادة (1 ملغ / مل)، الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للأرنب IgG H & L، اليكسا فلور 488، 1 ملغ / مل)، و 1٪ BSA مع 0.1٪ توين20. احتفظ بهذه الكواشف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها.
  6. إعداد المواد المعقمة: زجاجات زراعة الخلايا، أطباق بيتري مع أسفل الشريحة الزجاجية (الشكل3A)،أطباق مع قاع زجاجي، ومطبوع 500 ميكرومتر شبكة موقع الخلية (الشكل3B،لتوطين الخلايا المحفزة ضوئيا)، 1.5 مل و 10 أنابيب مل، و 1 مل، 100 ميكرولتر و 10 ميكرولتر ماصات ونصائح.
  7. إعداد معدات مختبر ثقافة الخلايا القياسية: حاضنة زراعة الخلايا تعيين في 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية، ومجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

2. خلية ثقافة و [ترنسّكأيشن]

ملاحظة: يستخدم خلية هيلا (خط الخلية المستمدة من خلايا سرطان عنق الرحم التي اتخذت في فبراير 8, 1951 من هنرييتا لاز)26 كمثال في هذا البروتوكول.

  1. ممر الخلية
    1. إزالة وسط الثقافة من زجاجة ثقافة الخلية التي تحتوي على ما يكفي من الخلايا.
    2. غسل الزجاجة مع 2 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). إزالة PBS.
    3. إضافة 1 مل من التربسين ببطء وانقر على الزجاجة قليلا. وضع زجاجة مرة أخرى في الحاضنة وحضانة الخلايا 3 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    4. إزالة التربسين. إضافة 2-3 مل من وسط الثقافة. ماصة المتوسطة عدة مرات لمساعدة الخلايا على فصل. نقل المتوسطة مع الخلايا إلى أنبوب 10 مل.
    5. خذ 10 ميكرولتر من العينة من الأنبوب لعد الخلايا.
    6. البذور ~ 25،000 خلية في طبق بيتري (الشكل3A)وإضافة وسط الثقافة تصل إلى 1 مل.
    7. وضع الطبق تحتوي على الخلايا مرة أخرى في الحاضنة. حضانة الخلايا 24 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل الانعطاف.
  2. نقل الخلايا
    1. استخدام 0.5 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي (ERK2-GFP، ميتو-GFP أو MT-cpYFP) لالتغوط لكل طبق. إضافة 0.5 ميكروغرام من بلازميد و 2.5 ميكروغرام من جزيرة الأمير إدوارد إلى 50 ميكرولتر من DMEM في أنبوب 1.5 مل. حضانة وسائل الإعلام المختلطة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. خذ الطبق مع الخلايا من الحاضنة. استبدال وسط الثقافة بـ 1 مل من DMEM.
    3. إضافة الحمض النووي / PEI وسائل الإعلام المختلطة في الخلايا قطرة قطرة. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة
    4. احتضان الخلايا 3 ح في 37 درجة مئوية واستبدال DMEM الحمض النووي / PEI وسائل الإعلام المختلطة مع 1 مل من وسط الثقافة.
    5. حضانة الخلايا المنقولة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل تجارب التحفيز الضوئي.

3. تفعيل ERK2 عن طريق التحفيز الضوئي للليزر Femtosecond

  1. تشغيل الليزر femtosecond وضمان إغلاق مصراع.
  2. قم بتشغيل المجهر البؤري المسح بالليزر وفتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر. تعيين مستوى الطاقة من الليزر 488 نانومتر في 0.1 mW. تعيين حجم التصوير كما 512 × 512 بكسل. تعيين وقت الفاصل الزمني لكل بكسل كـ 2.4 ميكروثانية. قم بتعيين وقت الفاصل الزمني بين إطارين في 6 s لتقليل ابيضاض الصور وتلف الخلايا. قم بتعيين إطارات التصوير الإجمالية في حوالي 300 إطار لتوفير نسخة مجهرية مستمرة تبلغ حوالي 30 دقيقة في تجربة فردية.
    ملاحظة: ويمكن تعديل الفاصل الزمني لإطارين متجاورين، وإجمالي إطارات التصوير، ووقت التصوير من الفحص المجهري المستمر وفقا للمتطلبات التجريبية. إذا استمرت تجربة فردية أكثر من 2 ساعة، يرجى تعيين نظام حضانة CO2 (كما هو موضح في الشكل4) للمجهر كما هو موجود في الخطوة 3.3 لتوفير بيئة 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية للحفاظ على بقاء الخلية. إذا كانت التجربة الفردية محدودة في غضون 2 ساعة، فإن نظام حضانة ثاني أكسيد الكربون ليس ضرورياً.
  3. تشغيل نظام الحضانة CO 2، تشغيل كل سخان وتعيين درجة حرارة العمل في 37 درجة مئوية. انتظر حتى ترتفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 حتى 5%. وضع مرحلة الحاضنة على مرحلة المجهر كما هو مبين في الشكل 4A.
  4. إعداد خلايا الهلا المنقولة مع ERK2-GFP كما هو موضح في الخطوة 2.
    ملاحظة: في تجربة فردية، يتم تطبيق مخطط Stim-A أو Stim-B لتقديم التحفيز الضوئي إلى الخلايا. وتقدم الخطوتان 3-5 و3-6 خطوات مفصلة في إطار Stim-A وStim-B على التوالي.
  5. تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في الخلايا المستهدفة باستخدام وضع Stim-A
    ملاحظة: قبل إجراء التحفيز الضوئي، يرجى التأكد من أن قطر التركيز حوالي 2 ميكرومتر. ويرد وصف هذه العملية في الخطوتين 3-5-1 و3-5-2.
    1. خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا مُنقلة بـ ERK2-GFP من الحاضنة وضع الطبق على مرحلة المجهر.
    2. بدء وضع المسح السريع من خلال برنامج التشغيل المجهر. ضبط الهدف للحصول على صور فلورية واضحة من الخلايا. توقف عن المسح الضوئي السريع. التبديل إلى وضع التصوير حقل مشرق من قبل كاميرا CCD (الشكل2A). فتح مصراع وضبط المسافة بين اثنين من عدسات تلسكوب التتابع لضمان قطر التركيز الليزر femtosecond أن يكون ~ 2 ميكرومتر (الشكل2B). أغلق الغالق لإكمال التعديل.
      ملاحظة: يمكن تسمية سهم مرجعي للإشارة إلىتركيز الليزر (الشكل 2). في هذه الأثناء، يمكن أيضا تعيين سهم مرجعي في وسط نافذة التصوير الفلورسنت للإشارة إلى موقف التركيز من الليزر femtosecond.
    3. تعيين قوة الليزر femtosecond في 15-40 م2 (810 نانومتر، 65 fs، 80 ميغاهيرتز)، أو 20-60 م.م.وات (1040 نانومتر، 120 fs، 50 ميغاهيرتز) في العينة. تعيين وقت فتح مصراع في 0.05-0.2 ق.
    4. استخدم وضع المسح السريع لتحديد خلية مستهدفة تم التعبير عنها بشكل جيد ERK2-GFP.
    5. نقل المرحلة من أجل توطين منطقة سيتوسول من الخلية المستهدفة المحددة في وسط FOV تحت التصوير حقل مشرق من كاميرا CCD (الشكل2A).
    6. انقر فوق أسفل البدء لبدء تقدم التصوير المجهري المستمر.
    7. افتح الغالق في أي فتحة زمنية محددة مسبقًا لتقديم تحفيز الليزر femtosecond المصمم في الخطوة 3.5.3 في الخلية المستهدفة.
      ملاحظة: (1) يمكن إجراء التحفيز الضوئي في أي وقت في تسلسل الفحص المجهري البؤري الذي يتحكم فيه الغالق. (2) يمكن تسليم التحفيز الضوئي لعدة مرات في نفس الموقف أثناء تسلسل الفحص المجهري البؤري.
    8. انتظر حتى تكتمل عملية التصوير. حفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات.
  6. تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في الخلايا المستهدفة باستخدام وضع Stim-B
    1. تعيين قوة الليزر femtosecond في 15-40 م.م.م (810 نانومتر)، 20-60 م.م.م (1040 نانومتر) في العينة.
    2. خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا مُنقلة بـ ERK2-GFP من الحاضنة ووضعها على مرحلة المجهر.
    3. استخدم وضع المسح السريع لتحديد خلية مستهدفة تم التعبير عنها بشكل جيد ERK2-GFP.
    4. تعيين عملية التصوير البؤري كخطوة 3.2. حدد إطار مسح خاص كإطار تحفيز في عملية التصوير. حدد معلمة إطار المحاكاة.
      1. تعيين منطقة المسح الضوئي (2 × 2-3 × 3 ميكرومتر2)في منطقة السيتوسول بالقرب من النواة في الخلية المستهدفة.
      2. تعيين إجمالي وقت المسح الضوئي في 0.1-0.2 ق. مزامنة مصراع الليزر femtosecond مع المسح الضوئي البؤري وفقا لمنطقة التحفيز الضوئي المعرفة مسبقا، والتي تكون مفتوحة فقط عندما يسقط المسح الضوئي بالليزر في إطار التحفيز وإغلاق على الفور عندما يخرج.
        ملاحظة: (1) يمكن تعيين منطقة التحفيز الضوئي إلى أي حجم. (2) يمكن إجراء التحفيز الضوئي في أي فتحة زمنية محددة مسبقا في تسلسل الفحص المجهري البؤري. (3) يمكن إجراء التحفيز الضوئي لعدة مرات على نفس أو مناطق مختلفة محددة مسبقا في FOV في هذا التسلسل المجهري البؤري.
    5. انقر فوق أسفل البدء لبدء تقدم التصوير المجهري المستمر.
    6. انتظر حتى تكتمل عملية التصوير. حفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات.
  7. إيقاف الليزر femtosecond والمجهر البؤري بعد التجربة.

4. تفعيل eIF4E (الركيزة ERK) من قبل محاكاة الليزر Femtosecond

  1. إعداد خلية هيلا
    1. اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.5.
    2. البذور ~ 20،000 الخلايا في طبق بيتري مع شبكات موقع الخلية (الشكل3B)لتوطين الخلايا المحفزة للصورة. إضافة وسط الثقافة تصل إلى 1 مل.
    3. وضع الطبق مع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة. حضانة الخلايا 24 ساعة في 37 درجة مئوية قبل العلاج بالليزر femtosecond.
  2. تشغيل الليزر femtosecond وضمان إغلاق مصراع.
  3. قم بتشغيل المجهر البؤري المسح بالليزر وفتح برنامج المجهر.
  4. إعداد نظام حضانة ثاني أكسيد الكربون كبيان في الخطوة 3-3.
  5. تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في الخلايا المستهدفة باستخدام وضع Stim-A
    1. تعيين قوة الليزر femtosecond في 15-40 م.م.م (810 نانومتر)، 20-60 م.م.م (1040 نانومتر) في العينة. تعيين وقت فتح مصراع في 0.05-0.2 ق.
    2. خذ الطبق مع الخلايا من الحاضنة وجبلفي حاضنة CO2 على مرحلة المجهر.
    3. نقل الهدف في الاتجاه الرأسي لتحديد موقع طائرة التصوير تحت التصوير حقل مشرق من كاميرا CCD. نقل مرحلة العينة في الاتجاه الأفقي لضمان عدم وجود خلية في وسط FOV. فتح مصراع وضبط المسافة بين اثنين من عدسات تلسكوب التتابع لضمان قطر التركيز الليزر femtosecond في ~ 2 ميكرومتر. أغلق الغالق لإكمال التعديل.
    4. نقل مرحلة المجهر لتحديد عشوائيا 5 ~ 10 الشبكات. ويمكن الإشارة إليها وتوطينها من قبل الشبكات في الجزء السفلي من أطباق بيتري تحت التصوير حقل مشرق من كاميرا CCD. وضع علامة/تسجيل إحداثيات الشبكات المحددة في الطبق.
    5. تحفيز جميع الخلايا الموجودة في الشبكات المحددة واحدا تلو الآخر يدويا تحت التصوير حقل مشرق من كاميرا CCD.
  6. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. حضانة الخلايا 24 ساعة في 37 درجة مئوية قبل الفحص المجهري الفلورة المناعية. إيقاف الليزر femtosecond والمجهر البؤري بعد إجراء photostimualtion.
  7. الفحص المجهري للفلورة المناعية من eIF4E الفوسفورية في الخلايا مع التحفيز الضوئي لتأكيد تنشيط ERK
    1. خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا مع علاج التحفيز الضوئي في الخطوة 4.5 من الحاضنة. إزالة وسيط الثقافة. غسل الخلايا مع PBS مرة واحدة. إزالة PBS.
    2. أضف 1 مل من 5% بارافورمالدهايد (4 درجة مئوية) إلى الطبق. إصلاح الخلايا مع 5٪ بارافورمالدهايد لمدة 10 دقيقة. غسل الخلايا مع PBS لمدة 5 دقائق مرتين. إزالة PBS.
    3. أضف 1 مل من 0.5% تريتون X-100 في الطبق. حضانة الخلايا 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت تريتون X-100. غسل الخلايا مع PBS لمدة 5 دقائق مرتين. إزالة PBS.
    4. إضافة 1 مل من 1٪ BSA العازلة في الطبق. حضانة الخلايا 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت BSA.
    5. تمييع الأجسام المضادة للeIF4E (الفوسفور S209) في 1 مل من PBS مع 1٪ BSA إلى تركيز نهائي من 1 ميكروغرام / مل. إضافة المخزن المؤقت في الطبق. حضانة الخلايا لمدة 10-12 ساعة عند 4 درجة مئوية. إزالة المخزن المؤقت.
    6. غسل الخلايا مع PBS لمدة 5 دقائق مرتين. إزالة PBS.
    7. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب IgG H & L في 1 مل من PBS مع 1٪ BSA إلى تركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل. إضافة المخزن المؤقت في الطبق. حضانة الخلايا 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت.
    8. غسل الخلايا مع PBS. إزالة PBS.
    9. أضف 1 مل من PBS إلى الطبق.
    10. قم بتشغيل المجهر البؤري للمسح الضوئي بالليزر. افتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر. تعيين مستوى الطاقة من الليزر 488 نانومتر في 0.1 mW. تعيين حجم التصوير كما 512 × 512 بكسل. تعيين وقت الفاصل الزمني لكل بكسل كـ 2.4 ميكروثانية.
    11. وضع الطبق مع خلايا تلطيخ الفلورسنت المناعي على مرحلة المجهر. حدد موقع المربعات المحددة تحت التصوير بالمجال الساطع لكاميرا CCD.
    12. بدء المسح الضوئي البؤري للإطار الواحد. حفظ الصور الفلورية من خلايا التحفيز الضوئي.
    13. نقل المرحلة عشوائيا لتحديد المناطق مع عدم وجود تحفيز الليزر femtosecond. بدء المسح الضوئي البؤري للإطار الواحد. حفظ الصور الفلورية من أي خلايا التحفيز كبيانات التحكم.
  8. إيقاف المجهر البؤري بعد التجربة.

5. تفعيل ميتوفلاشز وغيرها من الأحداث الميتوكوندريا عن طريق التحفيز الضوئي

ملاحظة: لمراقبة الديناميات المورفولوجية الميتوكوندريا، يتم نقل خلايا هيلا مع ميتو-GFP في الخطوة 5.1 للإشارة الفلورسنتالميتوكوندريا. لمراقبة الـ mitoflashes، يتم نقل خلايا Hela مع mt-cpYFP في الخطوة 5.1.

  1. إعداد خلايا الهلا المنقولة مع ميتو-GFP أو MT-cpYFP بعد الخطوة 2.
  2. تشغيل الليزر femtosecond وضمان إغلاق مصراع.
  3. قم بتشغيل المجهر البؤري للمسح بالليزر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر. تعيين مستوى الطاقة من الليزر 488 نانومتر في 0.1 mW. تعيين حجم التصوير كما 512 × 512 بكسل. تعيين إجمالي وقت التصوير لكل إطار كـ 2.2 ثانية. تعيين وقت الفاصل الزمني بين إطارين في 0 s. تعيين إطارات التصوير الإجمالية كـ 200 إطار لتوفير الفحص المجهري المستمر ~440 ثانية في تجربة فردية.
    ملاحظة: ويمكن تعديل الفاصل الزمني لإطارين متجاورين، وإجمالي إطارات التصوير، ووقت التصوير من الفحص المجهري المستمر وفقا للمتطلبات التجريبية.
  4. إعداد نظام حضانة ثاني أكسيد الكربون كما هو موضح في الخطوة 3-3 إذا لزم الأمر.
  5. تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في ميتوشوندريون الهدف باستخدام وضع Stim-A
    1. خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا مُنقلة مع ميتو-جب أو mt-cpYFP من الحاضنة ووضع الطبق على مرحلة المجهر.
    2. تحقق من حالة الليزر femtosecond كالخطوة 3.5.2. تأكد من أن التركيز على ليزر femtosecond يقع في وسط FOV. تعيين سهم مرجع في وسط إطار التصوير الفلورسنت للإشارة إلى موضع التركيز.
    3. تعيين قوة الليزر femtosecond في 5-30 م2 (810 نانومتر)، 10-40 م.م.وات (1040 نانومتر) في العينة. تعيين وقت فتح مصراع في 0.05-0.1 ق.
    4. استخدم وضع المسح السريع لتحديد خلية مستهدفة تم التعبير عنها جيدًا من Mito-GFP أو mt-cpYFP.
    5. حدد ميتوشوندريون واحد عشوائيا في الخلية المستهدفة كموضوع تجريبي. نقل مرحلة المجهر من أجل توطين الهيكل الأنبوبي الميتوكوندريا الهدف في وسط FOV (تشير إلى السهم المرجعي) عن طريق وضع المسح السريع.
    6. انقر فوق أسفل البدء لبدء تقدم التصوير المجهري المستمر.
    7. فتح مصراع في أي وقت محدد مسبقا لتقديم التحفيز الليزر femtosecond المصممة في الخطوة 5.5.3 في الهيكل الأنبوبي الميتوكوندريا الهدف.
      ملاحظة: (1) يمكن التحكم في التعرض بالليزر femtosecond على بنية أنبوبي الميتوكوندريا عن طريق مصراع في أي وقت أثناء الفحص المجهري البؤري. (2) إجراء واحد فقط التعرض ليزر femtosecond في تجربة واحدة لأن واحد فيمتوثانية تحفيز الليزر قد اضطراب حالة الميتوكوندريا على مدى فترة طويلة.
    8. انتظر حتى تكتمل عملية التصوير. حفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات.
  6. إيقاف الليزر femtosecond والمجهر البؤري بعد التجربة.

6. تذبذب إمكانات غشاء الميتوكوندريا على الميتوكوندريا الهدف في خلايا الهيلا عن طريق التحفيز بالليزر Femtosecond

  1. إعداد خلايا الهلا باتباع الخطوات 2.1.1-2.1.6.
  2. حضانة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التجربة.
  3. إعداد حل تلطيخ TMRM: تمييع TMRM في 1 مل من DMEM مع FBS 10٪ إلى تركيز نهائي من 100 nM.
  4. خذ الطبق مع الخلايا المعدة في الخطوة 5.2.1 و 5.2.2 من الحاضنة. إزالة وسيط الثقافة. أضف محلول تلطيخ TMRM المعد في الخطوة 6.3 إلى الطبق. وصمة عار لمدة 15-20 دقيقة في 37 درجة مئوية في الحاضنة. إزالة الحل تلطيخ. غسل الخلايا مع PBS مرة واحدة. إضافة 1 مل من وسط الثقافة في الطبق.
  5. تشغيل الليزر femtosecond وضمان إغلاق مصراع.
  6. قم بتشغيل المجهر البؤري للمسح بالليزر. افتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 532 نانومتر. تعيين مستوى الطاقة من الليزر 532 نانومتر في 0.1 مواط/ وات. تعيين حجم التصوير على أنه 512 × 512 بكسل ووقت إنشاء الإطار في 2.2 ثانية.
    ملاحظة: ويمكن تعديل الفاصل الزمني لإطارين متجاورين، وإجمالي إطارات التصوير، ووقت التصوير من الفحص المجهري المستمر وفقا للمتطلبات التجريبية.
  7. إعداد نظام حضانة ثاني أكسيد الكربون الموصوف في الخطوة 3-3 إذا لزم الأمر.
  8. استخدام وضع Stim-A لتقديم تحفيز الليزر femtosecond في ميتوشوندريون الهدف. اتبع الخطوات 5.5.1-5.5.8 لإكمال التجربة.
    ملاحظة: في الخطوة 6.8، حدد mitochondrion التي ملطخة جيدا مع TMRM كما mitochondrion الهدف.
  9. إيقاف الليزر femtosecond والمجهر البؤري بعد التجربة.

7. تغييرات من باكس والسيتوكروم C على الميتوكوندريا الهدف في خلايا الهيلا عن طريق التحفيز بالليزر Femtosecond

ملاحظة: في هذه التجربة، بذور الخلايا في أطباق بيتري مع شبكات موقع الخلية (الشكل3B)لتوطين الخلية التي يتم علاجها بواسطة الليزر femtosecond. وصمة عار الخلايا مع TMRM لتوطين mitochondrion التي يتم اختيارها ليتم تحفيزها بواسطة الليزر femtosecond.

  1. إعداد خلايا الهلا في طبق بيتري مع شبكات موقع الخلية (الشكل3B)كما هو موضح في الخطوة 4.1.
  2. وصمة عار الخلايا مع TMRM كما هو موضح في الخطوتين 6.3 و 6.4.
  3. تشغيل الليزر femtosecond وضمان إغلاق مصراع.
  4. قم بتشغيل المجهر البؤري للمسح بالليزر. افتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 532 نانومتر. تعيين مستوى الطاقة من الليزر 532 نانومتر في 0.1 مواط/ وات. تعيين حجم التصوير على أنه 512 × 512 بكسل ووقت إنشاء الإطار في 2.2 ثانية.
  5. تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في ميتوشوندريون الهدف باستخدام وضع Stim-A
    1. تعيين قوة الليزر femtosecond في 5-30 م2 (810 نانومتر)، 10-40 م.م.وات (1040 نانومتر) في العينة. تعيين وقت فتح مصراع في 0.05-0.1 ق.
    2. خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا ملطخة من الحاضنة ووضع الطبق على مرحلة المجهر.
    3. استخدام وضع المسح السريع لتحديد الخلية المستهدفة التي هي ملطخة جيدا مع TMRM.
    4. نقل المرحلة من أجل ترجمة الهيكل الأنبوبي الميتوكوندريا الهدف في وسط FOV باستخدام وضع المسح السريع. وضع علامة على إحداثيات الشبكة التي توجد الخلية المحددة ضمن التصوير بالحقول الساطعة.
    5. انقر فوق أسفل البدء لبدء تقدم التصوير المجهري المستمر.
    6. فتح مصراع في أي وقت محدد مسبقا من التصوير المجهري التقدم يدويا لتقديم التحفيز الليزر femtosecond المصممة في الخطوة 7.5.1 في الهيكل الأنبوبي الميتوكوندريا الهدف.
    7. انتظر حتى تكتمل عملية التصوير. وضع علامة على ميتوشوندريون المحدد الذي يتم محاكاة بواسطة الليزر femtosecond. حفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات.
    8. إيقاف الليزر femtosecond والمجهر البؤري بعد التجربة. إعداد الفحص المجهري المناعي من باكس أو السيتوكروم C على خلايا التجربة.
  6. الفحص المجهري للمناعة من باكس أو السيتوكروم C على فيمتوثانية ليزر معالجة ميتوشوندريون.
    1. خذ الطبق من مرحلة المجهر.
    2. وضع تلطيخ كامل للفلورسنت المناعي من الباكس أو السيتوكروم C اتبع الخطوات 4.7.1-4.7.9.
      ملاحظة: استخدم مضاد ًا للباكس أو مضادًا للسيتوكروم C بدلاً من مضاد eIF4E في الخطوة 4.7.5 لإنهاء تلطيخ الفلورسنت المناعي من Bax أو cytochrome C في الخطوة 7.6.2.
    3. قم بتشغيل المجهر البؤري المسح بالليزر وفتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر و 532 نانومتر. تعيين مستوى الطاقة من 488 نانومتر و 532 نانومتر الليزر في 0.1 mW. تعيين حجم التصوير كما 512 × 512 بكسل ووقت إنشاء الإطار في 2.2 s.
    4. وضع الطبق مع خلايا تلطيخ الفلورسنت المناعي على مرحلة المجهر. حدد موقع الشبكة المحددة تحت التصوير بالمجال الساطع لكاميرا CCD. تحديد موقع الخلية التي يتم علاجها بواسطة الليزر femtosecond.
    5. بدء المسح الضوئي البؤري للإطار الواحد. حدد موقع ميتوشوندريون الذي يحفزه الليزر فيمتوثانية. حفظ الصورة الفلورية من خلية التحفيز الضوئي لمزيد من تحليل البيانات.
  7. إيقاف المجهر البؤري بعد التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن إجراء التحفيز الضوئي في وقت واحد جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري المسح الضوئي المستمر. يمكن أن يبدأ التحفيز الضوئي في أي فتحة زمنية محددة مسبقًا في تسلسل الفحص المجهري البؤري الفاصل الزمني. يمكن للميكروسكوب البؤري مراقبة الجزيئات الخلوية عن طريق التصوير الفلوري. ويمكن تحديد الاستجابات الجزيئية لتحفيز الصور والديناميات الأخرى بهذه الطريقة. نظريا، إذا تم تنشيط ERK، وسوف يكون انتقال الفوسفورمن السيتوبلازم إلى نواة الخلية27. يمكن تنظيم مصير الخلية المحددة من خلال أنماط معينة من هذه الإشارة ERK28. في الدراسات الحديثة، وقد وفرت التشكيل البصري على أساس optogentics مراقبة دقيقة عالية من إشارة ERK في المدة والحجم وكشف أن ديناميات انتقال إشارة ERK المضطربة يدفع الانتشار غير السليم في الخلايا السرطانية7، 8. هنا، نقوم بإظهار نقل ERK2 إلى نواة بعد علاج الخلية مع ومضة قصيرة من الليزر femtosecond باستخدام الطريقة المعروضة في هذا البروتوكول. كما هو مبين في الشكل 5A،ERK2-GFP الفلورة تصل إلى الحد الأقصى بعد عدة دقائق من محاكاة الليزر femtosecond. سيتم إزالة الفسفورية جزيئات ERK2 بعد تفعيل ركائز المصب في النواة، ومن ثم ERK2 يعود إلى السيتوبلازم المشار إليها عن طريق خفض الفلورة GFP النووية. يمكن تنشيط ERK2 لعدة مرات عن طريق التحفيز الضوئي متعددة (الشكل5B). ولذلك، فهي قادرة على التعامل مع نمط إشارة ERK2 على وجه التحديد عن طريق التحكم في الفاصل الزمني بين المحفزات المتعددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنشيط ERK2 في الخلايا المجاورة حول الخلية المحفزة في بعض الأحيان (الشكل5C). وتشير هذه الملاحظة إلى أن بعض الجزيئات القابلة للاختراق يمكن أن تطلقها الخلية المعالجة بالليزر الفيمتوالثانية لتنشيط ERK2 في الخلايا المجاورة. يمكن تأكيد الفسفور من البروتين المصب ERK2 eIF4E وتصورها عن طريق الفحص المجهري الفلورة المناعية (الشكل5D). تشير هذه النتيجة إلى أن تحفيز الليزر femtosecond يمكن تنشيط مسار إشارة ERK بنجاح. أكثر نتيجات مفصّلة في[ونغ] [س.], [إت ل.].

ومضات الأكسدة الميتوكوندريا (ميتوفلاشز) هي رشقات نارية تأكسدية في الميتوكوندريا التي تجذر من الديناميات الجزيئية الميتوكوندريا المعقدة. في العقد الماضي، يتم تحقيق mitoflashes لتكون الحدث إشارة الميتوكوندريا عنصري واتخاذ جزء مهم في وظائف الخلية multitudinous29،30،31. تقليديا ، عادة ما يلاحظ الميتوكوندريا عن طريق الصدفة عند علاج الخلايا مع المواد الكيميائية لتوفير الإجهاد غير المباشر لالميتوكوندريا29،30. من خلال تنفيذ هذا المخطط تحفيز الصور، ونحن نحقق بطريقة يمكن التحكم فيها ودقيقة لإثارة mitoflashes على مستوى أنبوبي الميتوكوندريا واحد. يظهر الإثارة mitoflash الناجحة في الشكل 6A. ومن المثير للاهتمام، خصائص ميتوفلاشز مثل ذروة النبض، والعرض وفترات الاستجابة32 ترتبط ارتباطا وثيقا بقوة الليزر femtosecond. تحليل كمي أكثر تفصيلا من mitoflashes متحمس من قبل التحفيز الليزرfemtosecond هو في وانغ S., وآخرون. هذا التحفيز الضوئي إلى الميتوكوندريا يظهر أيضا أصناف من الديناميات الجزيئية الميتوكوندريا، بما في ذلك تجزئة واستعادة مورفولوجيا الميتوكوندريا (الشكل6B)،وتذبذب إمكانات غشاء الميتوكوندريا ( الشكل 6جيم). على غرار ميتوفلاشز تنشيط الصورة، هذه الأحداث الميتوكوندريا لها أداء مختلف مع كثافة قوة مختلفة من التحفيز الضوئي. وهو يختلف عن تفعيل مسار إشارة ERK. تأثير الليزر femtosecond مقيد ة للغاية على أنبوب الميتوكوندريا واحد. نتائج أكثر تفصيلا هي في وانغ Y., وآخرون. 24 وشي ف. وآخرون. 25.

Figure 1
الشكل 1: مخطط التحفيز الضوئي الذي تم إنشاؤه على اقتران ليزر فيمتوثانية في مجهر بؤري. (أ) المسارات البصرية من (ب) التحفيز الضوئي ونظام التصوير البؤري. يتم تقسيم الليزر femtosecond في البداية من قبل الخائن شعاع 50/50 إلى اثنين من الحزم. يتم توسيع الإرسال بواسطة تلسكوب ترحيل ثم ينعكس في الهدف لتشكيل Stim-A. يتم محاذاة شعاع انعكاس من خلال نظام المسح المجهر لتشكيل Stim-B. يتم استخدام كاميرا CCD لتوفير التصوير مشرق فيليد لمراقبة الخلايا والتركيز على الليزر femtosecond في وضع Stim-A. Stim-A = تركيز ثابت في وسط FOV; Stim-B = إطار مسح خاص في منطقة مصممة مسبقا. DM = مرآة dichroic، BS = شعاع الخائن، RM = مرآة عاكسة. الطول الموجي لليزر المسح الضوئي البؤري هو 488 نانومتر/532 نانومتر/635 نانومتر، والفاصل الزمني النموذجي للموجات الموجية للفلورة هو <560 nm/560-625 nm/> 625 nm. يمكن استبدال ليزر فيمتوثانية الألياف (1,040 نانومتر, 120 fs, 50 ميغاهيرتز, 1 W) بواسطة Ti = الياقوت الليزر (810 نانومتر, 80 ميغاهيرتز, 65 fs, 1 W) أو غيرها من المذبذبات الليزر femtosecond التجارية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: في وضع Stim-A، تركز عملية توطين وحجم تركيز الليزر فيمتوثانية على الخلية المستهدفة في طائرة التصوير البؤري تحت التصوير الساطع. (أ) يتم حظر ليزر Femtosecond بواسطة الغالق. (ب) ليزر فيمتوثانية على. السهم: يتم تعيين السهم المرجعي في وسط FOV للتأكد من أن تركيز الليزر femtosecond يحدد الموضع الصحيح. شريط مقياس = 10 درجة.

Figure 3
الشكل 3: طبق بيتري المستخدم في زراعة الخلايا، وتجارب الانفوية والتحفيز الضوئي. (أ) طبق بيتري 35 مم بقطر 15 مم وقاع زجاجي سمك 0.17 مم. (B) طبق بيتري 35 مم مع قاع زجاجي وشبكة موقع خلية مطبوعة 500 م. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نظام حضانة ثاني أكسيد الكربون. (أ) مرحلة حاضنة CO2 و (ب) لوحة التحكم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تنشيط الصور ERK باستخدام وضع Stim-A. (أ) حافز صورة واحدة (1,040 نانومتر, 40 مواطوات, 0.1 s) يحفز ERK2-GFP نقل إلى نواة ومن ثم العودة إلى السيتوبلازم. (B) ERK2 نمط إشارة بوساطة التعرض ليزر femtosecond واحد (السهم الأحمر، 1040 نانومتر، 40 مليواط، 0.1 ثانية) واثنين من التحفيز الضوئي (الأسهم الخضراء، 810 نانومتر، 30 مليواط، 0.1 ثانية). (C) تنشيط ERK في الخلايا المحيطة عن طريق التعرض ليزر فيمتوثانية قصيرة واحدة في الخلية المستهدفة (السهم الأبيض، 810 نانومتر، 24 مللي واط، 0.2 ثانية). (د) الفلورة المناعية من eIF4E-P يظهر زيادة كبيرة 24 ساعة بعد محاكاة ضوئية واحدة (810 نانومتر، 25 مواط، 0.2 ث). شريط مقياس = 10 ميكرومتر (A)، و 20 ميكرومتر (B، C). الفلورة من ERK2-GFP وeIF4E-P متحمس من قبل 488 نانومتر الليزر الإثارة وجمعها في <560 نانومتر قناة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: أحداث الميتوكوندريا المتعددة الناجمة عن التحفيز الضوئي في إطار وضع Stim-A. (أ) إثارة mitoflash على أنابيب الميتوكوندريا المحفزة بواسطة حافز واحد (810 نانومتر، 16 مليواط، 0.1 ث). (ب) الميتوكوندريا المورفولوجية التجزؤ والترميم الناجمة عن التحفيز الضوئي واحد (1,040 نانومتر, 30 mW, 0.1 s). (C) تذبذب إمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق تحفيز الليزر فيمتوثانية واحدة (1040 نانومتر، 20 مللي واط، 0.1 ثانية). تشير الأسهم في (A) (B) و(C) إلى موضع التحفيز الضوئي. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. الفلورة من ميتو-GFP أو MT-cpYFP متحمس من قبل 488 نانومتر الليزر الإثارة وجمعها في <560 نانومتر قناة. الفلورة من TMRM متحمس من قبل 532 نانومتر الليزر الإثارة وجمعها في قناة 560-625 نانومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

0.05 s 0.1 s 0.2 s 0.5 s
810 نانومتر، 65 fs، 80 ميغاهيرتز 20 - 65 مواط / واط 10 - 60 مواط / واط 5 - 50 م.م.م. 5 - 40 م.م.م.
1040 نانومتر، 120 fs، 50 ميغاهيرتز 30 - 100 مواط / واط 20 - 80 مواط / واط 15 - 70 مواط /2 10 - 60 مواط / واط

الجدول 1: مدة التحفيز الموصى بها ومتوسط قوة الليزر femtosecond في وضع Stim-A.

0.05 s 0.1 s 0.2 s 0.5 s
810 نانومتر، 65 fs، 80 ميغاهيرتز 25 - 40 مواط /2 20 - 30 مواط / واط 15 - 25 مواط /20 10 - 25 مواط /20
1040 نانومتر، 120 fs، 50 ميغاهيرتز 40 - 60 مواط/. 30 - 50 مواط/. 25 - 40 مواط /2 20 - 30 مواط / واط

الجدول 2: مدة التحفيز الموصى بها ومتوسط قوة الليزر فيمتوثانية في وضع Stim-A في 2 × 2-3 × 3 ميكرومتر 2 في الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقوم بإظهار استراتيجية تحفيز الصور من خلال الجمع بين ليزر femtosecond مع نظام المجهر البؤري المسح الضوئي بالليزر. يمكن أن يعمل التحفيز الضوئي مباشرة كنسخة مجهرية بفوتونين من خلال تعريف Stim-B وفقًا لذلك. نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام ومضة قصيرة من الليزر femtosecond لتحريك إشارات ERK أو mitoflashes في الخلايا المستهدفة. يمكن تنفيذ طرق التحفيز المختلفة وفقا للأغراض التجريبية المختلفة والنظم. Stim-A يمكن إعدادها بسهولة على أساس المجهر البؤري. يمكن تركيز الليزر femtosecond على مستوى الحد الانعراج في مركز FOV. الهدف تحت الخلوي يحتاج إلى نقل إلى موضع التركيز بالليزر femtosecond يدويا، ويمكن تحفيزها لفترات تعسفية، مستقلة تماما عن الفحص المجهري البؤري. لذلك، Stim-A يمكن حماية العينة التي هي خارج منطقة التركيز تماما ومناسبة لتحفيز الصور لمدة طويلة. يمكن تعريف منطقة التحفيز Stim-B مسبقًا على أنها أي منطقة في FOV. يمكن أن يتم تنفيذه تلقائياً. ولكن مدة التحفيز ووقت التعرض يمكن أن تتبع فقط جنبا إلى جنب مع المسح الضوئي البؤري. بعد تعيين وقت الجلوس من كل بكسل وحجم الإطار الإجمالي، يتم إصلاح مدة التحفيز في إطار مجهري واحد في الواقع. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ التحفيز الضوئي بشكل دوري إطار حسب الإطار. ويمكن أيضا أن تستخدم لتنشيط الحساسية الضوئية والبروتينات البصرية التي تتطلب مدة أقل التعرض ولكن مساحة كبيرة.

أحد الاعتبارات الحاسمة في هذا البروتوكول هو كيفية تحديد المعلمات من التحفيز بالليزر femtosecond. وفقا لدراساتنا السابقة، يتم حث النشاط الجزيئي الخلوي في الغالب عن طريق exaction multiphoton17،21،22،23،24،25. عموما يرتبط كفاءة exaction multiphoton مع جميع معلمات الليزر femtosecond بما في ذلك الطول الموجي، وعرض النبض، ومعدل التكرار. وترتبط الاستجابة الخلوية كذلك مع قوة الليزر، موقف التحفيز / المنطقة، ومدة التعرض في وقت واحد. من حيث المبدأ، ويتعارض كفاءة التحفيز مع سلامة الخلايا. يساهم التحفيز الضوئي الأقوى مثل ارتفاع متوسط الطاقة ومدة التحفيز الأطول وطاقة الليزر الناتجة الإجمالية الأكبر في زيادة كفاءة التحفيز ولكنه يجلب مخاطر أعلى لتلف الخلايا. وبما أن هذه المعلمات هي أيضا نسبية مع بعضها البعض، وجميعها تسهم في التحفيز وتأثير الضرر، فإنه من المستحيل استخدام معلمة واحدة فقط، مثل مجموع طاقة الليزر الحادث، أو الليزر متوسط الطاقة، لتحديد أنها آمنة أم لا. وبالنظر إلى كفاءة تنشيط الإشارة وسلامة الخلايا، نقدم هنا متوسط الطاقة الموصى بها ومدة التحفيز لممصدرين ليزر فيمتوثانية للرجوع إليهما في الجدول 1 والجدول 2. إلى جانب ذلك، ينبغي تغيير المعلمات من تحفيز الليزر femtosecond وفقا للنظام البصري الفعلي والعينة البيولوجية.

وفقا للمناقشات المذكورة أعلاه، ونحن نعتزم تقديم نطاقات أكثر تفصيلا فعالة من المعلمات التحفيز الضوئي. يمكن تغيير الطول الموجي للليزر femtosecond في نطاق NIR المستخدمة لتحفيز الصور. يجب أن يكون عرض النبض قصيرًا لتوفير قوة ذروة عالية وكفاءة عالية غير خطية. لا ينصح بمدة نبض طويلة لهذا البروتوكول. عادة، عرض النبض النموذجي للميكروسكوب الفوتون اثنين (<200 fs) هو الخيار الصحيح. معدل تكرار الليزر ليس عاملا رئيسيا. معدل التكرار حتى MHz مناسب لهذا البروتوكول. العامل الأكثر أهمية للاستجابات الجزيئية الخلوية هو قوة الليزر ومدة التحفيز من الليزر femtosecond. لتفعيل ERK، وفقا لعملنا السابق22،ومتوسط الطاقة في 15 مليواط /نانومتر (810 نانومتر) أو 20 مليواط /نانومتر (1,040 نانومتر) ومدة التعرض في 0.2 s كافية لتوفير التحفيز الكافي لتنشيط إشارات ERK مع الحفاظ على قدرة الخلايا الفائقة في خلايا هيلا. على العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي متوسط الطاقة أكثر من 80 مليواط /نانومتر (810 نانومتر) أو 120 مليواط /نانومتر (1,040 نانومتر) ومدة التعرض أطول من 1 s إلى تلف لا رجعة فيه للخلايا. الميتوكوندريا هي عموما أكثر حساسية لتحفيز الصور. التحفيز مع متوسط الطاقة أعلى من 40 مليواط / 810 نانومتر) أو 80 مليواط / 1,040 نانومتر) ومدة التعرض أكثر من 0.2 ق قد يسبب ضررا كبيرا مثل تجزئة لا رجعة فيها في ميتوتشوندريون حفز أو حتى في جميع الميتوكوندريا عبر الخلية بأكملها. وتجدر الإشارة إلى أن حساسية الصورة من الميتوكوندريا لتحفيز الصور يختلف كثيرا في أنواع الخلايا المختلفة. على سبيل المثال، في خلايا HeLa، تحتاج طاقة الليزر فقط حوالي 6 مليواط (810 نانومتر، مدة 0.1 s). جميع الميتوكوندريا يمكن أن استجابة لتحفيز الصور في شكل تجزئة، mitoflashes، وتذبذبات MMP. ولكن في الخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان، تحتاج إلى زيادة الطاقة إلى حوالي 15 مليواطو (810 نانومتر، 0.1 ق مدة)، ولا يزال حوالي نصف حفز الميتوكوندريا تظهر أي استجابة لتحفيز الصور. في وضع Stim-B، قد يؤثر عامل آخر على كفاءة تنشيط الصورة وتلف الخلايا هو منطقة التحفيز. قد يسبب التحفيز الضوئي تلفالخلايا من خلال تقديم على منطقة تحفيز صغيرة. ولكن نفس التحفيز قد تفشل في تنشيط ERK عن طريق تقديم على منطقة تحفيز أكبر. نوصي بأن تكون منطقة التحفيز في الخلية المستهدفة حوالي 2 × 2-3 × 3 ميكرومتر2 ولا تتجاوز 25 ميكرومتر2.

توطين منطقة التحفيز مهم أيضا لتطبيق هذا البروتوكول. وفقا للأعمال السابقة17،22، التحفيز الضوئي في تلك المنطقة يمكن أن تستنفد مخزن Ca2 + في ER بشكل فعال وتفعيل قناة CRAC. بعد ذلك، يمكن لتدفق Ca2+ تنشيط مسار إشارات ERK في وقت لاحق. ولذلك، نوصي بتقديم التحفيز الضوئي على منطقة ER في خلايا Hela لتحقيق كفاءة تنشيط ERK عالية. يمكن تمييز منطقة ER بسهولة عن السيتوبلازم أو النواة تحت الفحص المجهري للمجال الساطع من خلال هدف تباين المرحلة. من أجل إدخال أحداث إشارات الميتوكوندريا، يمكن تركيب تركيز ليزر femtosecond بسهولة على بنية الميتوكوندريا المختارة بعد الإجراءات ذات الصلة.

طرق التحفيز الضوئي الموصوفة في هذا البروتوكول هي أيضا قادرة على استخدامها للتأثير على الأحداث الخلوية متعددة أخرى مثل تحفيز Ca2+ و إشارات ROS17،20،21. وتجدر الإشارة إلى أن جميع تلك الأعمال السابقة قدمت تقييم سلامة الخلايا بعد التحفيز الضوئي. على سبيل المثال، التغيرات المورفولوجية الهامة للخلايا، والثرثرة، وتفتيت الميتوكوندريا وتورم الخلية بأكملها، وانخفاض معدل انتشار الخلايا، وبعض التغيرات غير العادية الأخرى في الفلورة أثناء الفحص المجهري البؤري جميعها تنطوي على ارتفاع تلف الخلية. يجب أن يكون حذرا جدا لمراقبة حالة الخلية. ومع ذلك، مع السيطرة بشكل جيد على قوة الليزر ومعلمات التحفيز، يمكن الحفاظ على صلاحية الخلية في مستوى عال جدا في وقت واحد مع كفاءة التحفيز العالية. وبالتالي، فإن هذه الطريقة من الصور من الليزر femtosecond هو من إمكانات جيدة لمزيد من توسيع إلى مزيد من المناطق وتطبيقها في التطبيقات ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81571719 و 81661168014 و 81673014 و 81870055) ولجنة العلوم والتكنولوجيا البلدية في شنغهاي (18QA1402300 و16XD1403100)، والخطة الوطنية البحث والتطوير الرئيسية (2017YFA0104600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 149، ليزر فيمتوثانية، تحفيز الصور، كيناز خارج الخلية التي تنظم الإشارة (ERK)، الميتوكوندريا، ميتوفلاش، الصور الحيوية
تحفيز الصور بواسطة ليزر Femtosecond ينشط إشارات الكيناز (ERK) أو أحداث الميتوكوندريا في الخلايا المستهدفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H.… More

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter