Spänning och Kalcium Dual Channel Optisk Kartläggning av odlade HL-1 förmaks myocyt Monolayer

En unik kalcium (Ca) och spänning (V _m) dual channel optisk kartläggning teknik ^1-5 växer fram som ett effektivt verktyg för att samtidigt spela in V _m och Ca-signaler i både intakta hjärtan och odlade cellmonoskikt. Denna teknik gör det möjligt att få kraftfulla uppgifter om förhållandet mellan kalcium transienter och aktionspotentialer för att bättre förstå de bakomliggande elektrofysiologiska mekanismer av hjärtarytmier.

Odlade cellmonoskikt har visat sig vara en användbar cellulär modell för att studera hjärtats elektrofysiologi och den underliggande mekanismen för arytmier. ^4,6-8 HL-1-celler är en väldefinierad förmaks myocyte kultur linje. HL-1 celler upprätthåller också ett unikt differentierad genotyp och fenotyp som inkluderar morfologiska, elektro och farmakologiska egenskaper hos vuxna förmaks myocyter. Dessa celler uttrycker hjärt gener och proteiner, inklusive important hjärt jonkanaler (dvs, L- och T-typ calciumkanalblockerare) ⁹ och mogna isoformer av sarcomeric kontraktila proteiner som normalt hos vuxna förmaks myocyterna som andra och vi har tidigare rapporterat. ^10-13 Dessutom kan HL-1 celler vara odlas för att bilda en 2-dimensionell (2-D) myocyt monolager. Således fördelarna med att använda odlade HL-1 monolager inkluderar: 1) relativt lägre kostnad och lättare att underhålla en myocyt kulturlinje än att isolera och odla primära neonatala myocyter; 2) ett sammanflytande monoskikt av celler minskar de strukturella komplexiteten som resulterar från den 3-dimensionella strukturen av hjärtat; 3) ett cellmonoskikt kan eliminera påverkan av interstitiell fibros som förekommer i den intakta hjärtat. Detta kan användas för att dissekera specifika elektrofysiologiska funktioner en grupp myocyter utan inblandning av fibroblaster och interstitiell matrix; 4) utvärdering av funktionella konsekvenser från farmakologisk eller genmanipulation i Culturerade ceUmonolager effektivt kan uppnås. Därför har HL-1 celler blivit en allmänt använd cellulär modell för att studera olika aspekter av myocyt fysiologi samt stimulerings-inducerad onormala elektriska aktiviteter. ^13-16 är dock speciell hantering och skötsel som krävs för att kulturen friska cellmonoskikt som svarar på extern elektrisk stimulering för optiska kartläggningsstudier. Dessutom kan dubbla fluorescerande färgämne färgningsförfarandet enkelt skada integriteten för odlade konfluenta cellmonoskikt. Således har utför V _m / CA tvåkanals optisk kartläggning i odlade HL-1-monolager varit en stor utmaning.

Målet med denna metod är att ge de viktigaste stegen för att framgångsrikt utföra dual channel optisk kartläggning i odlade HL-1-monolager. Här har vi gett omfattande information om ett optimerat protokoll för beredning HL-1 encellsskiktet, dual channel optisk kartläggning av en odlad cell monolager, och kartläggning databehandling.

1. Lösning Förberedelse

1. Noradrenalin (NP) lösning
   1. Lös 40 mg NP i 25 ml 30 mM askorbinsyra (0,1475 g askorbinsyra i 25 ml renat Milli-Q (MQ) vatten. Undvik direkt ljusexponering under denna lösning preparat, eftersom noradrenalin (NP) är ljuskänsligt.
   2. Filtrera NP-lösning med en 0,22 fim sprutfilter. Alikvotera lösningen i 1 ml sterila mikrorör och förvara vid -20 ° C. När frysta, är NP stabil i en månad.
2. Kompletterat Tvätta och Final Claycomb media
   1. Börja med 43,5 ml Claycomb medium och komplettera med 5 ml fetalt bovint serum (FBS), 0,5 ml av penicillin / streptomycin, 0,5 ml av nonylfenol och 1: 100 utspädd L-glutamin för att göra 50 ml slutlig kompletterat Claycomb medium. Undvik direkt ljusexponering under denna lösning beredning, eftersom Claycomb medium är ljuskänslig.
   2. Bered tvätt Claycomb mediet med användning av samma recept som den suppletteras Claycomb medel utom lägga 5% FBS och utelämna NP och L-glutamin komponenter.
      OBS: kompletterat Final och Wash Claycomb media är bra för två veckor vid förvaring vid 4 ° C utan direkt ljusexponering.
3. Sojaböntrypsin hämmande lösning
   1. Lös 25 mg sojaböntrypsininhibitor i 100 ml Ca-fri och Mg-fritt Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
   2. Filtrera lösningen med användning av en 0,22 fim sprutfilter.
      OBS: Den steriliserade lösningen är stabil i en månad vid förvaring vid 4 ° C.
4. Gelatin / Fibronektin skålen beläggningslösning
   1. Lös 0,1 g gelatin i 500 ml MQ vatten för att göra 0,02% gelatin.
   2. Autoklav, sedan späd 1 ml fibronektin i 199 ml 0,02% gelatin och blanda försiktigt.
   3. Alikvot 6 ml gelatinlösning i separata rör och förvara vid -20 ° C.
5. Hanks salt lösning
   1. Med hjälp av en uppståndelseplatta, upplösa följande salter i MQ vatten (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH ₂ PO ₄ (0,4409), NaH ₂ PO ₄ (0,4000), MgSO ₄ (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCOa ₃ (4.162), HEPES (5,042), _CaCl2 (1.261).
6. Kalcium känsligt färgämne (Rhod2) lösning
   1. Späd 1 mg Rhod2 torrt pulver i 400 pl av 20% Pluronic F-127 i DMSO för att göra en Rhod2 dye stamlösning och förvaras vid -20 ° C.
   2. Späd denna stamlösning 1: 1000 med Hanks salt lösning för att göra en slutlig arbetslösning innan experimentet.
7. Spänning känsligt färgämne (Rh237) lösning
   1. Späd 5 mg Rh237 med 2 ml DMSO för att göra förrådslösning och förvaras vid -20 ° C. Späd stamlösningen 1: 1000 med Hanks salt lösning för att göra en slutlig arbetslösning innan experimentet.

& #160; OBS: 4/1 lösningar baseras på Claycomb HL-1 cellodling protokoll med mindre modifiering.

2. Passaging och Odling HL-1 Förmaks Myocyter på täckglas

OBS: De HL-1 celler kan erhållas från Dr. Claycomb (Louisiana State University).

1. Grow HL-1-celler i T25-kolvar och foder med 5 ml kompletterat Claycomb medium dagligen. Passage cellerna i T25-kolvar var femte dag enligt Claycomb HL-1 cellkultur-protokollet (beskrivet nedan) ^10.
2. Placera runda täckglas (20 mm diameter) i 12-brunnars odlingsplattor 24 tim innan cellerna i T25 kolven är helt sammanflytande och redo att passe, och sedan täcka täck med gelatin / fibronektin natten vid 37 ° C.
3. Nästa dag, aspirera och kassera gelatin / fibronektin från odlingsplattorna och ersätta med 1,5 ml kompletterat Slutlig Claycomb medium i varje brunn.
4. Split celler från en T25 culture kolv efter att ha nått fullt sammanflödet på dag 5. Sug mediet från T25 kolven innehållande sammanflytande kultur och skölj kulturen hastigt med PBS vid 37 ° C.
5. Aspirera PBS och tillsätt 3 ml 0,05% trypsin / EDTA vid 37 ° C genom att pipettera trypsin / EDTA till botten av T25 kolven för att undvika direkt kontakt med cellerna. Inkubera vid 37 ° C under 1 min.
6. Ta bort trypsin / EDTA genom aspiration och lägga till ytterligare 1,3 ml trypsin / EDTA per T25-kolv. Inkubera vid rumstemperatur under 1 min. Undersök i mikroskop och om cellerna fortfarande sitter kolven trycker till fullo få bort kvarvarande celler.
7. Lägg 1,3 ml sojaböntrypsininhibitor till cellerna och överförings celler från kolven in i en 15 ml centrifugrör. Skölj tom flaska med 5 ml Wash Claycomb medium. Fyll på glans till cellerna i 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 500 xg under 5 minuter.
8. Efter centrifugering, aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendera cellpelleteni 6 ml kompletterat Final Claycomb medium.
9. Seed varje brunn i en 12-brunnars platta med 0,5 ml cellsuspension från cell passaging. Mata cellerna med färskt kompletterat Final Claycomb medel dagligen.
   OBS: Noga övervaka tillväxten av cellerna, typiskt cellmono når sammanflytande status på dag 4 och de spontana aktiviteter förblir synliga. Då kommer den odlade monoskikt vara redo för optisk kartläggning på dag 4-5.

3. Loading Kalcium och spänningskänsliga Färgämnen till cellerna

1. För optiska kartläggningsstudier, försiktigt bort täckglaset från 12 brunnar cellodling platta och skölj med Hanks salt lösning.
2. Att färga celler med Ca känsligt färgämne Rhod2, inkubera cellmonoskikt på täckglas med 3 ml av syresatt (bubbling med 5% _CO2 / 95% _O2 gas) Rhod2 arbetslösning vid 37 ° C i ett vattenbad under 30 min .
3. Att färga cellerna med V _m känsligt färgämneRh237, doppa Rhod2 laddad cellmonoskiktet in i 3 ml av oxygenerad Rh237 arbetslösning vid 37 ° C i ett vattenbad under ytterligare 15 minuter.

4. Dual Channel Optisk Mapping

1. Placera encellsskiktet, som är dubbel färgas med V _m och Ca färgämnen, in i en cirkulationskammare på ett inverterat fluorescensmikroskop. Använd en uppvärmd cirkulationssystem för att hålla temperaturen i cellkammaren vid 35 ± 1 ° C. Styra försiktigt temperaturen på perfusatet genom justering av hastigheten hos den cirkulerande flödet genom kammaren för att undvika en gradient av mer än 0,3 ° C över kammaren.
   1. Innan inspelningen V _m / Ca-signaler, tvätta encellsskiktet med färsk Hanks lösning för ca 5 minuter för att avlägsna de återstående färgämnet från tidigare färgningssteg.
2. Pace frisk cellmonoskikt med användning av en bipolär elektrod som består av en glaspipett fylld med Hanks salt-lösning och en siler tråd lindad runt pipettspetsen som tidigare beskrivits ^12,17.
3. Pace friska cellmonoskikt vid en cykellängd 200-500 msek och pulsbredd på 2 ms, förväntar sig en stimuleringströskel vid ungefär 1 mV.
   OBS: För varje parti odlade monolager, bör åtminstone två icke-behandlade monolager användas för att testa tillståndet hos cell partiet. Friska kontrollmonolager ska kunna fångas upp av elektrisk stimulering vid cykellängder på 200-500 ms. Om kontrollmonolager undgå att elektriskt tempo, tyder detta på att hela cellen partiet inte kan vara lämpliga för optiska kartläggningsexperiment.
4. Att excitera både V _m och Ca känsliga färgämnen, använda en LED-ljuskälla (520 nm våglängd) i kombination med en excitationsfilter (510 nm / 40) och en dikroisk spegel (561 nm).
   1. Samla de fluorescerande signaler som sänds ut av cellerna via en 40X objektiv och split med en dikroisk spegel (594 nm) i en _{V-m-komponent} och en Ca-komponent.Filtrera det emitterade ljuset i V _m kanal med en långpassfilter (700 nm) och det emitterade ljuset i Ca-kanalen med ett bandpassfilter (585/40 nm).
   2. Samla filtrerade fluorescerande ljus med två CCD-kameror (80 x 80 pixlar, 1000 fps, redshirt Imaging).
   3. För att undvika färgblekning, göra inspelningar för mindre än 2 sekunder på varje synfält för att begränsa tiden för ljusexponering. Här, typiskt bild fyra olika områden för varje monolager.

5. databehandling av V _m eller Ca Record

1. För både V _m och Ca-signaler (80 x 80 pixlar), genomsnitt intensitetsvärdena för tjugofem (5 x 5) grann pixlar i en intensitetsvärdet vid olika inspelnings tidpunkter för att reducera bakgrundsbrus.
   OBS: Efter datamedelvärdes, varje inspelningstid punkt för en enskild åtgärd potential eller Ca gående ger en datamatris som innehåller 16 x 16 genomsnitt intensitetsvärden (medelvärdedatakanaler) med en rumsupplösning på 50 um.
2. Definiera aktiveringstid (AT) i inspelade V _m eller Ca-signaler.
   1. För att definiera en aktiveringstiden (AT) för en enskild åtgärd potential eller Ca gående, bestämma tidpunkten för 50% av topp amplitud V _m eller Ca signaler med hjälp av en skräddarsydd MATLAB-baserade algoritmen som tidigare beskrivits. ¹²
   2. Manuellt korrekturläsa det analyserade AT för att eliminera eventuella fel som kan uppstå under analysprogrammet.
   3. Förvara definieras på Matrix (16 x 16 genomsnitt datakanaler) av inspelade aktionspotential och kalcium övergående, respektive i den programvara som används.
3. Beräkna aktionspotentialens eller kalciums transienta ledningshastigheten (CV) -vektorer på AT matris med vektorfältet analysmetod såsom tidigare beskrivits med mindre modifikationer ^12,18.
   1. Beräkna CV vektor av en datakanal i förhållande till dess omgivande AT datapunkter (5 ×; 5 angränsande genomsnitt datakanaler) för att simulera en slät polynom yta av aktiveringstider (AT yta) med en minsta kvadratalgoritmen inom MATLAB-programmet ^12,18.
   2. Beräkna ledningsvektor med hjälp av nedanstående formler
      Formel 1:
      
      Formel 2:
      θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)]
      OBS: Ve är ett CV vektor projiceras på x- och y-axlarna; dx / dT är projektionen av CV vektorn i x-axeln; dy / dT är projektionen av CV vektorn i y-axeln. T är AT ytan; x, y hänvisar till 2-D-koordinater; T _x = ∂t / ∂x är den partiella derivatan av T med avseende på x; T _y = ∂t / ∂y är den partiella derivatan av T med avseende på y; θ är den slutliga inriktningen av ett CV vektor.
   3. Grupp alla vektorerna AT matrisen till 36 vägar, som var och en täcker en tio-gradig sektor på kompassen. </ Li>
   4. Välj den väg som innehåller den största befolkningen av CV vektor bland de 36 ledningsrubbningar. Beräkna den genomsnittliga CV av denna väg för att representera CV av monolager.

6. Visualisering av Wave Fram Förökning

1. Normalisera signalstyrkan för en enskild åtgärd potential eller Ca transient vid olika inspelnings tidpunkter i förhållande till sitt toppvärde med hjälp av MATLAB programvara.
2. Lagra temporärt de normaliserade intensitetsdata för varje inspelad tidpunkt i en 16 x 16 intensitetsmatris i MATLAB programvara som används.
3. Konstruera en färgkodad intensitetskarta från den lagrade intensitetsmatrisen varje inspelningstid punkt med surf.m funktionen.
   OBS: I intensitetskartan, representerar röd hög intensitet V _m eller Ca-signaler, och blått speglar låg intensitet av fluorescens signaler.
4. Skapa en .avi-fil med avifile.m funktionen.
5. Spara allt jagntensity kartor på olika punkter av aktionspotentialen eller Ca transient inspelningstiden med addframe.m funktionen.
   OBS: Vid denna punkt, kommer två separata avi-filer i V _m och Ca förökning genereras.

En odlade sammanflytande monolager uppvisar en regelbunden inneboende rytm vilket visas i Movie 1. Vi sedan utfört V _m / Ca tvåkanals optisk kartläggning i en helt sammanflytande HL-1 monolager. Figur 1A visar exempel spår av V _m och Ca-signaler från en inspelad singel slå. Representativa isokronisk kartor över jämnt förökade V _m och Ca-signaler med hjälp av dubbla kanaler optiska kartsystem visas i figurerna 1B och 1C. Representativa kronologiska bilder av enhetligt förökade aktionspotentialer och Ca transienter erhölls från samma HL-1 kulturmonolager. Slutligen Filmer 2 och 3 ger animation exempel på ett enhetligt förökade aktionspotential (film 2) och kalcium övergående (film 3) i HL-1 sammanflytande monolager.

-sidan = "always">
Figur 1: (A) Exempel spår av V _m (blå) och Ca (röd) från en elektriskt stimulerat slag vid en cykellängd (CL) av 500 msek. (B) En bild av vårt optiska kartsystem för HL-1-monolager. (C) En isokronisk karta över aktionspotentialens förökning från samma stimulerat slag i hela synfältet. (D) En isokronisk karta över Ca transient utbrednings från samma stimulerat slag i hela synfältet. I båda isokronisk kartor, är tid förfaller representerad med färger, som börjar med mörkblå som initiering och mörkt rött på 50 ms. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

/52542/52542fig2highres.jpg "/>
Figur 2: (A) En serie kartor över V _m fördelning vid 60, 80, 140, och 200 msek efter starten av inspelningen. (B) Kartor över Ca fördelning på 60, 80, 140 och 200 msek efter starten av inspelningen.

Film 1: En representant film som spelats in från en sammanflytande HL-1 monolager vid kultur dag fem, under ett ljusmikroskop med en 40X objektiv.

Film 2 : En representativ film av en fortplantas aktionspotential från en stimulerat slag på en CL 500 msek.

Film 3 : En representativ film av en fortplantas Ca transient från en paced slog på en CL 500 msek.

Den här artikeln beskriver de viktigaste aspekterna av optisk kartläggning i en kultiverad HL-1 förmaks myocyt monolager färgas med kalcium och spänningskänsliga fluorescerande färger. Det innefattar att odla en optimal HL-1 encellsskiktet, konfigurering av utrustning för kartläggning, mappa en kultiverad monolager, och dataanalys.

För att framgångsrikt kart odlade celler, är nyckeln till att förbereda en jämnt fördelad cellmonolager. När sådd cellerna på att täck, se till att jämnt sprida cellerna. Karta Alltid fullvuxna och helt sammanflytande cellmonoskikt, eftersom dessa kommer bäst svara på elektrisk stimulering. Det är också viktigt att hålla cellerna syre samtidigt laddar färgämnena, men syrebubblor bör inte komma i direkt kontakt med cellerna eftersom det kan döda eller rubba dem från täckglas. Sänkning färgämneskoncentration och minska ljusintensiteten minskar signalstorleken och minska signalbrusförhållandet, och samtidigt öka färgämnes concentratipå och förbättra ljusintensiteten ökar signal magnitud men också öka bruset. Därför måste en optimal balans av fluorescerande färgämneskoncentration och excitationsljus segheten bestämmas för att förbättra signal-brusförhållandet av inspelningssignaler. Dessutom under optisk kartläggning inspelning, se till att undvika att utsätta encellsskiktet till långa exponeringar av koncentrerat ljus eftersom det kan orsaka fotodynamisk cellskador inom ljuset exponerade området. Slutligen ett optiskt kartsystem som ger hög tids- och rumsupplösning för inspelning signaler krävs för att erhålla data av hög kvalitet.

Medan tvåkanalig optisk kartläggning i intakta hjärtan har stor potential för att studera hjärtats elektrofysiologi på grund av dess förmåga att samtidiga collect spännings och kalciumsignaler, är en begränsning som denna teknik samlar in information från en 3-D yta som en 2-D projektion kartan. Erhållna 2-D data från intakta hjärtan med ignoreras information av 3-D curvature av hjärtat kan resultera i fel i dataanalyser, speciellt i ledningshastighet analys. Med fördelarna med att använda en kultiverad 2-D HL-1 cellulära modellen, har vi möjlighet att visualisera regelbundna och oregelbundna rytmer, bedöma Ca gående och action potentiella kinetik, bestämma ledningshastighet och karakterisera Ca och handlingspotential utbredningsmönster (uniform eller icke enhetlig förökning) utan att störa från 3-D struktur av en intakt hjärta. Därför lyckas kartlägga både kalcium transienter och aktionspotentialer i en kultiverad HL-1 förmaks myocyt monolager som en gratis tillvägagångssätt kan avsevärt förbättra förståelsen för de elektrofysiologiska egenskaperna hos förmaks myocyter och de bakomliggande mekanismerna för förmaks arrhythmogenesis.