Напряжение и кальция Dual Channel Оптический Картирование Искусственный HL-1 мерцательной миоцитов монослоя

Уникальный кальция (Ca) и напряжения (V _м) техника двухканальный оптический отображение ^1-5 становится эффективным инструментом одновременно записывать V _м и Ca сигналы в обоих интактных сердцах и культурных монослоев клеток. Эта методика дает возможность получить мощный информацию о взаимосвязи между переходных кальция и потенциалов действия, чтобы лучше понять основные электрофизиологические механизмы аритмий сердца.

Искусственный монослоя клеток оказались полезными сотовой моделью для изучения сердечной электрофизиологии и основной механизм развития аритмий. ^4,6-8 HL-1 клетки хорошо характеризуется предсердий миоцитов культура линия. HL-1 клетки также поддерживать однозначно дифференцированные генотип и фенотип, который включает в себя морфологические, электрофизиологические и фармакологические характеристики взрослых предсердий миоцитов. Эти клетки экспрессируют кардиальные гены и белки, в том числе IMPORTANT сердца ионные каналы (т.е. L- и Т-типа кальциевых каналов) ⁹ и зрелые изоформы саркомерных белков сократительных обычно находятся у взрослых предсердий миоцитов, как другие, и мы уже ранее сообщали. ^10-13 Кроме того, HL-1 клетки могут быть культивируют для формирования 2-мерный (2-D) миоцитов монослой. Таким образом, преимущества использования культивируемых HL-1 монослои включают: 1) относительно низкую стоимость и проще поддерживать миоцитов культуры линии, чем выделение и культивирование первичных новорожденных миоцитов; 2) сливная монослой клеток снижает структурные сложности, которые возникают при 3-D структуры сердца; 3) монослой клеток может устранить интерференцию интерстициального фиброза, что происходит в интактной сердца. Это может быть использован для анализировать конкретные электрофизиологические функции группы миоцитов без вмешательства фибробластов и интерстициальных матрицы; 4) оценка функциональных последствий от фармакологической или генетической манипуляции в кульКлеточные монослои тывается может быть эффективно достигнуты. Таким образом, HL-1 клетки стали широко использоваться сотовой моделью для изучения различных аспектов миоцитов физиологии, а также стимуляции, вызванной аномальные электрические деятельности. ^13-16 Тем не менее, специальная обработка и уход, необходимые для культуры здорового монослоя клеток, которые реагируют на внешние электрическое стимуляции для изучения оптических отображение. Кроме того, двойной флуоресцентный процедура окрашивания красителем может легко повредить целостность культивируемых сливающихся монослоев клеток. Таким образом, выполняя V _м / CA двухканальный оптический отображение в культуре HL-1 монослоя была большой проблемой.

Цель этого метода состоит в том, чтобы обеспечить основные этапы для успешного выполнения двухканальный оптический отображение в культуре HL-1 монослоя. Здесь мы в подробностях на оптимизированного протокола для подготовки HL-1 монослой клеток, в двухканальном оптического картирования культурно монослоя клеток и обработки картографических данных.

1. Решение Подготовка

1. Норадреналин решение (NP)
   1. Растворите 40 мг NP в 25 мл 30 мМ аскорбиновой кислоты (0,1475 г аскорбиновой кислоты в 25 мл очищенной Milli-Q (MQ) воды. Избегайте прямого воздействия света во время этого приготовления раствора, так как норэпинефрина (НП) чувствителен к свету.
   2. Фильтр решение NP с шприцевой фильтр 0,22 мкм. Алиготе решение в 1 мл стерильной микропробирок и хранить при температуре -20 ° C. После того, как замороженные, НП устойчива в течение одного месяца.
2. Доп мыть и Final Клейкомб СМИ
   1. Начнем с 43,5 мл Клейкомб среды и дополнения с 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5 мл пенициллина / стрептомицина, 0,5 мл NP и 1: 100 разбавленным L-глютамин, чтобы 50 мл конечного дополненной Клейкомб среды. Избегайте прямого воздействия света при этом приготовления раствора из-за Клейкомб среда чувствительна к свету.
   2. Подготовка среды мытья Клейкомб с использованием того же рецепта, как SUPреализованная Клейкомб способом, за исключением добавления 5% FBS и опустить NP и L-глютамин компонентов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: дополнить Заключительные и Wash Клейкомб СМИ хороши в течение двух недель при хранении при 4 ° С без прямого воздействия света.
3. Соя ингибирующей трипсин решение
   1. Растворите 25 мг ингибитора трипсина сои в 100 мл Ca-Mg и свободного свободной фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко (PBS).
   2. Фильтр решение с помощью шприца фильтр 0,22 мкм.
      Примечание: стерилизуют раствор стабилен в течение одного месяца при хранении при 4 ° С.
4. Желатин / Фибронектин блюдо раствор для покрытия
   1. Растворить 0,1 г желатина в 500 мл воды MQ сделать 0,02% желатина.
   2. Автоклав, то разбавить 1 мл фибронектина в 199 мл 0,02% желатина и аккуратно перемешать.
   3. Аликвоты 6 мл раствора желатина в отдельные пробирки и хранят при -20 ° С.
5. Солевой раствор Хэнкса
   1. Использование переполохПластина, растворяют следующие соли в воде MQ (ммоль / л), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH ₂ PO ₄ (0,4409), NaH ₂ PO ₄ (0,4000), MgSO ₄ (0,8142), D-GLC (5,051), NaHCO ₃ (4,162), HEPES (5,042), CaCl ₂ (1,261).
6. Решение чувствительным к кальцию краситель (Rhod2)
   1. Развести 1 мг Rhod2 сухого порошка в 400 мкл 20% Pluronic F-127 в ДМСО, чтобы окрасить Rhod2 маточного раствора и хранят при -20 ° С.
   2. Развести эту маточного раствора 1: 1000 солевым раствором Хэнкса, чтобы сделать окончательный рабочий раствор перед началом эксперимента.
7. Решение Напряжение чувствительны краситель (Rh237)
   1. Развести 5 мг Rh237 с 2 мл ДМСО, чтобы маточного раствора и хранят при -20 ° С. Развести маточного раствора 1: 1000 солевым раствором Хэнкса, чтобы сделать окончательный рабочий раствор перед началом эксперимента.

И #160; Примечание: 1-4 решения основаны на HL-1 протокол для культивирования клеток Клейкомб с незначительной модификацией.

2. пассажи и Культивирование HL-1 мерцательной миоцитов на покровные

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HL-1 могут быть получены от доктора Клейкомб (Университет штата Луизиана).

1. Выращивают HL-1 клеток в колбы Т25 и корма с 5 мл дополненной среде Клейкомб в день. Прохождение клетки в колбы Т25 каждые пять дней в соответствии с HL-1 протокол для культивирования клеток Клейкомб (описано ниже) ^10.
2. Место круглые покровные (диаметр 20 мм) в культуральных планшетах 12-луночные 24 ч перед клеток в колбе T25 полностью вырожденная и готов к пассируют, а затем покрыть покровные с желатином / фибронектина в течение ночи при 37 ° С.
3. На следующий день, аспирации и отбросить желатин / фибронектин из культуральных планшетах и ​​заменить 1,5 мл с добавлением Окончательный Клейкомб среды в каждой лунке.
4. Разбить ячейки из Т25 КУЛЬТУРАе колбу после достижения полного слияния в день 5. Аспирируйте среда из T25 колбу, содержащую сливающийся культуры и промыть культуру кратко с PBS при 37 ° С.
5. Аспирируйте PBS и добавляют 3 мл 0,05% трипсина / EDTA при 37 ° С с помощью пипетки трипсина / EDTA на дне колбы Т25, чтобы избежать прямого контакта с клетками. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 мин.
6. Удалить трипсин / ЭДТА стремлением и добавить еще 1,3 мл трипсина / ЭДТА за T25 колбу. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. Проверьте под микроскопом, и если клетки все еще привязаны к колбе, нажмите, чтобы полностью вытеснить остальные ячейки.
7. Добавить 1,3 мл соевого ингибитора трипсина в клетки и передачи клеток из колбы в 15 мл центрифужную пробирку. Промойте пустую флягу с 5 мл Wash Клейкомб среды. Добавьте полоскание с клетками в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин.
8. После центрифугирования, аспирации супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок клетокв 6 мл дополненной Окончательный Клейкомб среды.
9. Семенной каждую лунку 12-луночного планшета с 0,5 мл клеточной суспензии из клеток пассажей. Поток клеток с пресной Дополнен Final Клейкомб среды ежедневно.
   Примечание: тщательно контролировать рост клеток, как правило, клеточные монослои достичь сливающийся статус на 4 день, и спонтанные действия остается видимым. Затем, культивируют монослой будет готов для оптического картирования в день 4-5.

3. Загрузка кальция и напряжения чувствительных красителей клеток

1. Для исследований оптических отображения, аккуратно удалите покровное из культуры клеток пластины 12-а и промыть раствором поваренной соли Хэнкса.
2. Для окрашивания клеток Са чувствительной краситель Rhod2, инкубировать клеточный монослой на покровное с 3 мл кислородом (барботирования с 5% CO _2/95% O ₂₎ газа Rhod2 рабочего раствора при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин ,
3. Для окрашивания клеток с V _м чувствительной красительRh237, погружать Rhod2 загруженной клеточный монослой в 3 мл рабочего раствора кислородом Rh237 при 37 ° С в водяной бане в течение еще 15 мин.

4. Dual Channel Оптический Mapping

1. Поместите клеточный монослой, который дважды окрашивали V _м и Са красителей, в обращении камеры на перевернутой флуоресцентного микроскопа. Используйте систему циркуляция нагретого, чтобы поддерживать температуру клеточной камере при 35 ± 1 ° С. Тщательно контролировать температуру перфузат, регулируя скорость циркулирующего потока через камеру, чтобы избежать градиент более 0,3 ° C через камеру.
   1. Перед записью V сигналы Са _м / промойте клеточный монослой свежим раствором Хенкса в течение приблизительно 5 минут, чтобы удалить оставшуюся краску от предыдущих шагов окрашивания.
2. Пейс здоровым клеточные монослои с использованием биполярного электрода, состоящий из стеклянной пипетки, заполненной солевым раствором Хэнкса и Silvэ проволочкой, намотанной вокруг кончика пипетки, как описано выше ^12,17.
3. Pace здоровые клеточные монослои при длине цикла 200-500 мс и импульсного шириной 2 мс, ожидая порог стимуляции примерно в 1 мВ.
   Примечание: Для каждой партии культивируемых монослоев, по меньшей мере, две не обработанных монослои должны быть использованы для проверки состояния клеток партии. Здоровые монослоя контроля должны быть в состоянии захвачен электрической стимуляции при длине цикла 200-500 мс. Если контрольные монослои не быть электрически темп, это говорит о том, что вся партия клеток, не могут быть пригодны для экспериментов оптических карт.
4. Для возбуждения как V _м и Ca чувствительные красители, используйте светодиодный источник света (520 нм длины волны) в сочетании с фильтром возбуждения (510 нм / 40) и дихроичным зеркалом (561 нм).
   1. Сбор флуоресцентные сигналы, испускаемые клетками с помощью объектива 40X и раскола с дихроичным зеркалом (594 нм) в V _м компонента и компонента Ca.Фильтр излучаемого света в _м канале V с длинным фильтр (700 нм) и излучаемого света в канале Ca с полосовым фильтром (585/40 нм).
   2. Сбор отфильтрованной флуоресцентный свет с помощью двух CCD камер (80 х 80 пикселей, 1000 кадров в секунду; Redshirt томография).
   3. Чтобы избежать фотообесцвечивания красителя, делать записи менее 2 сек на каждом поле зрения, чтобы ограничить время воздействия света. Здесь, как правило, изображение четыре различных областях для каждого монослоя.

5. Обработка данных V _м или Са Recordings

1. Для обоих V _м и сигналов Са (80 х 80 пикселей), средние значения интенсивности из двадцати пяти (5 х 5) соседние пиксели в одно значение интенсивности в различные моменты времени записи, чтобы снизить фоновый шум.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После усреднения данных, каждый время записи точка индивидуального потенциала действия или Ca переходного дает матрицу данных, содержащий 16 х 16 усредненные значения интенсивности (усредненныйканалы передачи данных) с пространственным разрешением 50 мкм.
2. Определить время активации (AT) записанного V _м или сигналов Са.
   1. Чтобы определить время активации (AT) индивидуального потенциала действия или Ca переходного, определить время 50% от пиковой амплитуды от V _м или сигналов Са, используя алгоритм MATLAB на основе заказ как описано выше. ¹²
   2. Вручную корректировать анализируемый ОВД устранить любые ошибки, которые могут возникнуть в процессе анализа программы.
   3. Храните определяется на матрице (16 х 16 в среднем каналы передачи данных) записанных потенциала действия и переходного кальция, соответственно, в используемого программного обеспечения.
3. Рассчитать потенциал действия или кальция переходных скорость проведения (CV) векторов на матрицу при использовании метода анализа векторное поле, как описано выше с незначительными изменениями ^12,18.
   1. Рассчитайте CV вектор канала передачи данных по отношению к его окрестностях в точках данных (5 ×; 5 соседних среднем каналы передачи данных), чтобы имитировать плавное многочлен поверхность времена активации (на поверхности) с помощью наименьших квадратов алгоритм в рамках программы MATLAB ^12,18.
   2. Рассчитать вектор проводимости, используя приведенные ниже формулы
      Формула-1:
      
      Формула 2:
      θ = агс [(Dy / DT) / (DX / DT)]
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ve является CV вектор прогнозируется на уровне х и у осей; DX / DT является проекция CV вектора в оси х; ду / дТ является проекция CV вектора в оси у. Т поверхности при; х, у, обратитесь к 2-D координат; T _х = дТ / дх является частная производная от Т по х; T _у = дТ / ∂y является частная производная от Т по отношению к у; θ является окончательное направление вектора CV.
   3. Группа все векторы матрицы AT на 36 путей, каждый из которых охватывает десять градусов сектора на компасе. </ Li>
   4. Выберите путь, содержащий большое население векторов CV среди 36 путей проводимости. Рассчитайте среднее резюме этого пути, чтобы представить резюме монослоя.

6. Визуализация волнового фронта распространения

1. Нормализация интенсивности сигнала индивидуального потенциала действия или Ca переходного в различных точках времени записи по отношению к пиковому значению, используя программное обеспечение MATLAB.
2. Временно хранить нормированные данные интенсивности каждого записываемого момент времени в матрицу 16 × 16 интенсивности в программном обеспечении MATLAB используется.
3. Построить цветную карту интенсивности с сохраненной интенсивности матрицы каждой записи временной точке, используя функцию surf.m.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В картой интенсивности, красный представляет высокую интенсивность V _м или сигналов Са и синий отражает низкую интенсивность флуоресценции сигналов.
4. Создайте файл .avi с помощью функции avifile.m.
5. Сохранить все входыntensity карты в разных точках времени записи потенциала действия или Ca переходного используя функцию addframe.m.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, будет генерироваться два отдельных AVI файлы V _м и распространения ЦА.

Культивируют сливной монослой проявляет регулярной внутренней ритм, как показано в кино 1. Мы тогда выполняется V _м / Ca двухканальный оптический отображение в полностью сливной HL-1 монослоя. 1А показан пример следы V _м и сигналов Са из записал сингл бить. Представительства изохронном карты равномерно распространяется V _м и сигналов Са, используя двухканальный оптической системы отображения показаны на рисунках 1б и 1в. Типичные хронологические изображения равномерно распространяющихся потенциалов действия и кальция переходные были получены из одной и той же HL-1 культуры монослоя. Наконец, Фильмы 2 и 3 приведены примеры анимации равномерно распространяется потенциала действия (Видео 2) и переходного кальция (Видео 3) в HL-1 сливной монослоя.

-page = "всегда">
Рисунок 1: () Пример следы V _м (синий) и Ca (красный) из электрически темп такт при длине цикла (CL) 500 мсек. (B) образ нашей системе оптической отображения для HL-1 монослоя. (С) изохронный карта распространения потенциала действия с той же темп такт в течение всего поля зрения. (D) изохронный карта Ca переходного распространения из того же темп такт по всему полю зрения. В обоих изохронных карт, промежуток времени представлена ​​с цветами, начиная с темно-синей, как инициации и темно-красного в 50 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

/52542/52542fig2highres.jpg "/>
На рисунке 2: () Серии карт распределения V _м при 60, 80, 140 и 200 мс после начала записи. (B) Карты распределения Са на 60, 80, 140, и 200 мс после начала записи.

Фильм 1: представитель фильм, записанный с сливной HL-1 монослоя в культуре пять суток, под световым микроскопом с целью 40X.

Фильм 2 : Представитель фильм распространяющейся потенциала действия от темп такт на КЛ 500 мс.

Фильм 3 : представитель фильм распространяющейся Ca переходного от PACред бить в КЛ 500 мс.

Эта статья описывает основные аспекты оптического картирования культурно HL-1 предсердий миоцитов монослоя окрашенных кальция и напряжения чувствительных флуоресцентных красителей. Она включает в себя культивирование оптимальный HL-1 монослой клеток, настройку отображения оборудования, отображения культурный монослоя и анализа данных.

Для успешного карту культивируемые клетки, ключ, чтобы подготовить равномерно распределенную клеточный монослой. Когда посева клеток на к покровные, убедитесь, что равномерно разогнать клетки. Всегда карте полностью выращенных и полностью сливающиеся монослоев клеток, так как они лучше всего реагируют на электрической стимуляции. Важно также, чтобы клетки окисленных при загрузке красители, но пузырьков кислорода не должны вступать в непосредственный контакт с клетками, так как это может убить или сместить их от покровного стекла. Снижение концентрации красителя и уменьшения интенсивности света будет уменьшаться амплитуды сигнала и уменьшить соотношение сигнал-шум, в то время как увеличение Концентрац красителейна и повышения интенсивности света увеличится амплитуды сигнала, но и увеличить уровень шума. Таким образом, оптимальный баланс концентрации флуоресцентного красителя и возбуждения силы света должны быть определены для повышения отношения сигнал-шум сигналов записи. Кроме того, во время записи оптического картирования, обязательно, чтобы избежать воздействия на клеточный монослой для длительных экспозициях концентрированного света, так как это может привести к фотодинамической повреждения клеток в пределах легкой подвергается области. И, наконец, система оптического отображения, который обеспечивает высокую временную и пространственную разрешающую способность записи сигналов требуется для получения данных высокого качества.

В то время как двухканальный оптический отображение в интактных сердцах имеет большой потенциал для изучения сердечной электрофизиологии из-за его способности к одновременному напряжения и кальция сигналов собирать, одно ограничение является то, что этот метод собирает информацию из 3-D поверхности в виде 2-D проекции карте. Полученные 2-D данные интактных сердца с игнорируется информации из 3-D curvatЮр сердца может привести к ошибкам в анализе данных, особенно при анализе скорости проведения. С преимуществами использования ферментированного 2-D HL-1 клеточной модели, мы можем представить себе регулярные и нерегулярные ритмы, оценки Ca переходных и потенциала действия кинетики, определить скорость проведения и охарактеризовать Са и потенциала действия модели распространения (Uniform или не- равномерного распространения), не вмешиваясь от 3-D структуры интактного сердца. Таким образом, успешно отображение как переходные кальция и потенциалы действия в культурно HL-1 предсердий миоцитов монослоя, как бесплатный подхода можно значительно повысить понимание электрофизиологических свойств предсердий миоцитов и механизмах, лежащих мерцательной аритмии.