Summary
यहाँ हम बैक्टीरियल कोशिकाओं रहने के लिए कार्यात्मक आणविक परिसरों का पता लगाया जा करने के लिए, ट्रैक किए गए है और मात्रा निर्धारित सक्षम पर एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है.
Abstract
जीवित कोशिकाओं के तंत्र में पूर्ण अंतर्दृष्टि प्रमुख प्रक्रियाओं है कि प्रकाश में लाना और एक सेलुलर स्तर पर घटनाओं प्रत्यक्ष जांच से ही प्राप्त किया जा सकता है. जैविक प्रणालियों की कतरनी जटिलता को तारीख करने के लिए सटीक प्रयोग एकल अणु का कारण है अभी तक भी मांग हो सकता है, बजाय अपेक्षाकृत कच्चे तेल की थोक पहनावा औसत माप का उपयोग एकल सिस्टम के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित. हालांकि, कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं सिर्फ एक के स्तर पर जीवित कोशिका या कुछ अणुओं में पाए जाते हैं, पहनावा माप आम तौर पर इन घटनाओं के stochastic और विषम प्रकृति मुखौटा. यहाँ, उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और विश्लेषणात्मक छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर हम प्रदर्शन कैसे एकल अणुओं की एक सटीक करने के लिए एक एकल में रहने वाले बैक्टीरिया कोशिका और कैसे हम जैविक मशीनों के कामकाज में आणविक परिसरों के भीतर गतिशीलता का पालन कर सकते हैं के भीतर प्रोटीन की निगरानी करने के लिए. तकनीक सीधे प्रासंगिक physiologically हैं. वे न्यूनतम perturbative और जैविक नमूने के अध्ययन के तहत गैर इनवेसिव कर रहे हैं और पूरी तरह से रहने वाले सामग्री में जांच के लिए अभ्यस्त, बायोफिज़िक्स के अन्य एकल अणु दृष्टिकोण करने के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं सुविधाएँ. इसके अलावा, जैविक नमूनों के अध्ययन का स्तर जो लगभग असंशोधित कक्ष ("जीनोमिक एन्कोडिंग") उपभेदों, के रूप में काफी अधिक प्रोटीन की तुलना में स्वाभाविक रूप से घटित होता पैदा करने के लिए और अधिक आम है, लेकिन कम आदर्श दृष्टिकोण करने का विरोध किया समान हैं पर सभी fluorescently टैग प्रोटीन का उत्पादन ('प्लाज्मिड अभिव्यक्ति'). इस प्रकार, जो जांच की जाएगी वास्तविक जैविक नमूने काफी प्राकृतिक जीवों के लिए करीब हैं, और इसलिए टिप्पणियों को और अधिक वास्तविक शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक है.
Protocol
- इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की Escherichia कोलाई बैक्टीरियल कोशिकाओं को व्यक्त जमी शेयरों के 50 μl पहली और defrosted aerobically 5 मिलीलीटर लेग विकास रातोंरात मीडिया में 37 डिग्री पर सी. मिलाते हुए सुबह के साथ बड़े हो, इस संतृप्त संस्कृति के 50 μl निकाला जाता है और कम से कम ग्लूकोज M63 संस्कृति, मीडिया, 4 से 6 घंटे के लिए 30 डिग्री सी पर incubating में उप सुसंस्कृत. यहाँ हम दो अलग अलग सेल उपभेदों, जिनमें से एक एक इलेक्ट्रॉन परिवहन व्यक्त का उपयोग कर प्रदर्शित साइटोक्रोम GFP, अन्य जो एक बैक्टीरियल flagellar GFP के लिए इनकार मोटर में शामिल प्रोटीन व्यक्त लिए जुड़े हुए हैं.
- कक्ष की काटा या तो बढ़ रही उप - संस्कृति से सीधे हो सकता है अगर उन्हें immobilized नमूने के रूप में देखने, या वे बैक्टीरियल flagella truncate अगर "सीमित" शर्तों के तहत देखने के लिए sheared हो सकता है.
- कर्तन उप संस्कृति का एक 5ml आमतौर पर एक दो बाँझ बाँझ पाइपिंग द्वारा शामिल हो गए सीरिंज से मिलकर डिवाइस में रखकर शामिल है. कर्तन प्रत्येक सिरिंज पंप में धक्का संकीर्ण टयूबिंग के माध्यम से संस्कृति को धक्का बारी द्वारा किया जाता है. यह 50-100 बार किया जाता है, आवश्यक कर्तन की हद पर निर्भर करता है. संस्कृति तो गोली कोशिकाओं, जो कम से कम मीडिया में resuspended है flagella टुकड़े हटाने के लिए centrifuged है.
- हम तो 20 मिनट के लिए इथेनॉल में KOH का एक संतृप्त समाधान में डुबो कर BK7 कांच coverslips साफ तैयार है, तो de-ionized पानी और इथेनॉल में अच्छी तरह से rinsing और एच. कम से कम 1 के लिए हवा में सूखे छोड़ने
- हम एक सरल प्रवाह सेल का निर्माण माइक्रोस्कोप में कोशिकाओं को घर. यह पैराफिन तेल की लाइनों को एक BK7 गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर आरेखण और फिर एक सुरंग सैंडविच बनाने शीर्ष पर साफ coverlips रखकर, और नीचे धीरे दबाने संदंश की एक जोड़ी के साथ, 5-10 μl की एक प्रवाह कक्ष मात्रा देने शामिल .
- Immobilized कोशिकाओं का पालन हम पाली एल Lysine के एक 0.1% w / ध् समाधान के साथ इंजेक्शन द्वारा प्रवाह सेल, भरने और यह कमरे के तापमान पर कम से कम 1 मिनट के लिए सेते के लिए अनुमति देते हैं. हम तो बाहर प्रवाह सेल के एक छोर से मीडिया इंजेक्शन और दूसरे से टिशू पेपर के साथ wicking द्वारा 100 μl न्यूनतम मीडिया का उपयोग कर फ्लश.
- हम तो कम से कम मीडिया में 1:500 200 एनएम व्यास लाटेकस microspheres (Polysciences) के कमजोर पड़ने coverslip सतह के निशान के 20 μl के माध्यम से बाती. प्रवाह सेल ऐसी है कि coverslip नीचे, एक सतह के एक सरल आर्द्रता चैम्बर में स्पष्ट मंच पर रखा का सामना करना पड़ रहा है उलटा है, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated. अनबाउंड मोती तो 100 μl कम से कम मीडिया के माध्यम से wicking धुल रहे हैं.
- अगर हम सीमित कोशिकाओं का पालन करना चाहते हैं हम पाली एल lysine कदम छोड़ देते हैं और बजाय 5 मिलीग्राम / एमएल विरोधी flagellin एंटीबॉडी के साथ प्रवाह सेल को भरने. प्रवाह सेल नमी कक्ष में 10 मिनट के लिए जगह है और है तो के माध्यम से wicking द्वारा प्लावित है.
- सेल संस्कृति के 20 μl तो प्रवाह सेल के माध्यम से दुष्ट है, या तो sheared नमूना का उपयोग अगर immobilized कोशिकाओं को देखने में सीमित कक्षों या unsheared नमूना देख.
- प्रवाह सेल उलटा है और 20 मिनट के लिए आर्द्रता चैम्बर में रखा जाता है. अनबाउंड कोशिकाओं तो 100 μl कम से कम मीडिया के माध्यम से wicking द्वारा बाहर धोया हैं.
- विसर्जन के तेल की एक बूंद coverslip के ऊपर सतह के केंद्र में रखा गया है और प्रवाह सेल पर तो है धीरे रखा कस्टम बनाया प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का नमूना धारक को, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस के साथ ऑप्टिकल संपर्क बनाने.
- खुर्दबीन इलेक्ट्रॉन गुणा कैमरा पर बंद है और -70 डिग्री सी करने के लिए ठंडा हो कैमरा सेट, सॉफ्टवेयर फ्रेम स्थानान्तरण मोड में 25 हर्ट्ज की एक विशिष्ट फ्रेम दर पर छवियों प्राप्त करने के लिए सेट है, शुरू में लाभ नियंत्रण पर disenabling कैमरा.
- brightfield रोशनी पर बंद है और छवि को ध्यान में लाया जाता है, एक उपयुक्त कक्ष या कक्षों के समूह के लिए उनके अपने लंबे अक्ष coverslip सतह के समानांतर के साथ अटक होने के आधार पर imaged किया जा चयन. पतले ध्यान केंद्रित करने के लिए सुनिश्चित करें कि 200 एनएम लाटेकस coverslip सतह करने के लिए अटक मोती बस ध्यान में निकाला जाता है.
- एक छवि अनुक्रम brightfield में अधिग्रहण कर लिया है सेल शरीर की रूपरेखा रिकॉर्ड. brightfield रोशनी बंद है और कैमरे के लाभ अधिकतम करने के लिए सक्षम है.
- कुल आंतरिक प्रतिबिंब (या TIRF) प्रतिदीप्ति उचित तरंगदैर्ध्य पर एक लेजर बीम (यहाँ, हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्तेजना के लिए, हम एक 473 एनएम लेजर का उपयोग करें) का उपयोग एक मानक अधिग्रहण के लिए है तो पूर्व निर्धारित के रूप में वापस केन्द्र के विमान में ध्यान केंद्रित करने के लिए उद्देश्य लेंस लेकिन ऑप्टिक अक्ष से विस्थापित laterally सेल नमूना में प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए एक क्षणभंगुर क्षेत्र उत्पन्न.
- कैमरा अधिग्रहण शुरू कर दिया है और बैक्टीरिया के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्तेजित लेजर शटर खोला. विभिन्न मूल्यों के साथ प्रयोग के द्वारा विशेष जांच के तहत जैविक प्रणाली के लिए लेजर और अधिग्रहण की तीव्रता की गति के लिए मानकों को अनुकूलित करने की आवश्यकता है, लेकिन एक ठेठ रेंज relevant मोबाइल कोशिका झिल्ली में प्रोटीन परिसरों का अध्ययन ~ व्यास 30 सुक्ष्ममापी एक परिपत्र उत्तेजना क्षेत्र पर 1-10 मेगावाट लेजर शक्ति 5-40 एमएस के फ्रेम प्रति एक जोखिम समय के साथ कर रहे हैं. नमूने photobleached, आमतौर पर ~ 10 एस तक प्रकाशित कर रहे हैं
- इस प्रोटोकॉल सीमित कोशिकाओं में जो सेल के शरीर coverslip और एक flagellar ठूंठ के बीच लगाव की एक बिंदु के बारे में rotating है के लिए दोनों, और immobilized कोशिकाओं जो सख्ती से coverslip सतह के लिए तय कर रहे हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कुछ सेल उपभेदों जो परिसरों की एक उच्च प्रतिलिपि संख्या है एक प्रारंभिक सीमित - विवर्तन TIRF इमेजिंग के लिए पहले सेल के एक ध्रुव पर केंद्रित लेजर ब्लीच से लाभ. यह ब्लीच photobleaching (या FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली में इस्तेमाल किया है कि के बराबर है. हमारे कस्टम सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग उत्तेजना लेज़र प्रकाश की कुछ एक दूसरे से स्वतंत्र FRAP प्रकार विरंजन के लिए इस्तेमाल किया रास्ते में बंद हो तंग आ सकते हैं. आम तौर पर 1-10mW लेजर बिजली रेंज 10-300 एमएस में एक ठेठ ब्लीच समय के साथ प्रयोग किया जाता है. व्यक्तिगत परिसरों जो बाद में उस क्षेत्र में फैलाना अधिक कल्पना आसानी से की अनुमति सेल के प्रक्षालित क्षेत्र में बहुत अधिक इमेजिंग विपरीत में यह परिणाम है.
- सेल cytoplasm में परिसरों जो ज्यादा कोशिका झिल्ली एक अलग रोशनी "slimfield" कहा जाता मोड कार्यरत है में उन लोगों की तुलना में तेजी से फैलाना visualizing के लिए. यहाँ एक ध्यान केंद्रित लेजर laterally सिर्फ एक एकल कोशिका धरना विस्तार है. यह एक बहुत ही गहन अनुमति आम तौर पर एक millisecond के बहुत तेजी से जोखिम लिया जा करने के लिए क्षेत्र पैदा करता है.
- डाटा अधिग्रहण के बाद, छवियों कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर (8.5 LabVIEW में कोडित) में खिलाया जाता है. यह स्वचालित रूप से एक आम तौर पर कुछ नैनोमीटर के एक सटीक करने के लिए कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट स्पॉट की स्थिति का पता लगाता है और उनके आकार और चमक अर्क है. brightnessof एक ट्रैक किए गए आणविक परिसर के समय के लिए सम्मान के साथ photobleaching ट्रेस तो stoichiometry अनुमान के लिए प्रयोग किया जाता है यानी, कितने व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक एकल आणविक जटिल बना.
प्रतिनिधि परिणाम:
जब प्रोटोकॉल किया जाता है सही ढंग से कोशिकाओं की छवियों brightfield में देखा एक सफेद / ग्रे सेल शरीर (चित्र 1a) के खिलाफ अंधेरे सेल निकायों के perimeters के साथ, बहुत अलग है. प्रतिदीप्ति का उपयोग immobilized कोशिकाओं में, हम आमतौर पर चौड़ाई में 250-300 एनएम (चित्रा 1b) के अलग स्थानों तीव्रता, देख सकते हैं. स्वस्थ, सीमित कोशिकाओं brightfield छवियों में पगहा अनुलग्नक के बिंदु के आसपास बारी बारी से देखा जाएगा. प्रतिदीप्ति उत्तेजना के तहत हमारे मामले में कुछ आणविक परिसरों भी अनुलग्नक के बिंदु पर देखा जा सकता है, flagellar मोटर के साथ टैग प्रोटीन का एक स्थानीयकरण का संकेत है. ये धब्बे व्यक्तिगत आणविक परिसरों कर रहे हैं और उन्हें देखा की संख्या रोशनी मोड इस्तेमाल किया और परिसरों के कई कैसे कर रहे हैं वास्तव में किसी भी एक समय पर कक्ष में मौजूद पर निर्भर करेगा. स्पॉट की गतिशीलता के अध्ययन के तहत विशिष्ट जैविक तंत्र पर निर्भर करता है. यदि स्पॉट का घनत्व शुरू बहुत ही उच्च, के रूप में लेबल यहां इस्तेमाल किया cytochromes के साथ मामला है, तो प्रदर्शन के एक प्रारंभिक FRAP ब्लीच इमेजिंग विपरीत में सुधार कर सकते हैं.
चित्रा 1. (ए) brightfield और (ख) एक स्थिर Escherichia कोलाई सेल के लिए TIRF छवि (झूठी रंग) एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जो बैक्टीरिया के flagellar मोटर्स में शामिल हो जाता है के लिए जुड़े हुए प्रोटीन व्यक्त . कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
देखभाल करने के लिए "अधिक कतरनी" सीमित बैक्टीरिया को देख के लिए इस के बाद से, सेल नहीं flagellar मोटर्स की कार्यक्षमता क्षीण कर सकते हैं लिया जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है एक घंटे से ज्यादा समय के लिए कोशिकाओं को खुर्दबीन स्लाइड पर एक बार के बाद से वे ऑक्सीजन समाप्त हो सकता है का उपयोग. काफी अनुकूलन करने के लिए खोजने के लिए सबसे अच्छा खुर्दबीन इमेजिंग शर्तों जांच के तहत अपने विशिष्ट जैविक प्रणाली के लिए catered करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह शुद्ध GFP अकेले का उपयोग करने के लिए अपने विशेष खुर्दबीन प्रणाली के लिए आवश्यक सही तीव्रता लेजर उत्तेजना का पता लगाने इमेजिंग करने का प्रयास करने के लिए बुद्धिमान हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम प्रो जूडिथ आर्मिटेज (ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय, ब्रिटेन) और प्रो. कॉनरोड Mullineaux (लंदन के क्वीन मैरी विश्वविद्यालय, ब्रिटेन) के समूहों से जीवाणु उपभेदों की तरह दान स्वीकार करते हैं. आईएमडी जैव रसायन विभाग (ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय) और OCISB द्वारा संयुक्त रूप से वित्त पोषित है, एआर एक इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) डीटीसी छात्रावस्था के द्वारा वित्त पोषित है, एनडी जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) से वित्त पोषित है, एमसीएल है रॉयल सोसायटी विश्वविद्यालय के अनुसंधान फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है.
References
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
