Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एक्टिनोबैक्टीरियोफेज संक्रमण को चिह्नित करने के लिए एक अनुकूलित ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट परख

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65482
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Ouachita Baptist University, 2Department of Mathematical Sciences, University of Arkansas

Summary

एक ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट विधि को बैक्टीरियोफेज की उपस्थिति में दीर्घकालिक जीवाणु विकास को मापने के लिए वर्णित किया गया है, जो एक्टिनोमाइसेट्स और अन्य धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए उपयुक्त है। इस विधि में वाष्पीकरण और ढक्कन संघनन को कम करने के लिए संशोधन और वायरस संक्रमण मैट्रिक्स की गणना करने के लिए आर कोड शामिल है, जिसमें वक्र के नीचे का क्षेत्र, विकास अधिकतम और सापेक्ष विषाणु शामिल हैं।

Abstract

बैक्टीरियोफेज प्राकृतिक वातावरण का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं, और उनके पास बैक्टीरिया की आबादी को आकार देने की एक शक्तिशाली क्षमता है। यह समझने के लिए कि व्यक्तिगत फेज एक्टिनोमाइसेट्स जैसे धीमी गति से बढ़ने वाले जीवाणु मेजबानों के साथ कैसे बातचीत करते हैं, फेज की उपस्थिति में दीर्घकालिक जीवाणु विकास को निर्धारित करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि की आवश्यकता होती है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माइक्रोप्लेट रीडर उच्च-थ्रूपुट बार-बार माप की अनुमति देते हैं, लेकिन विस्तारित समय के लिए एक छोटी मात्रा को इनक्यूबेट करना तकनीकी चुनौतियां पेश कर सकता है। यह प्रक्रिया 96 घंटे के लिए उप-नमूनाकरण के बिना फेज और बैक्टीरिया के सह-संवर्धन की अनुमति देने के लिए एक मानक 96-वेल माइक्रोप्लेट को अनुकूलित करती है, जिसमें स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अवशोषण मूल्यों का उपयोग करके हर 8 घंटे में बैक्टीरिया की वृद्धि दर्ज की जाती है। इन ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों का विश्लेषण संक्रमण मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए आर का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें प्रतिशत वृद्धि अवरोध, सापेक्ष विषाणु और स्टेसी-सेबालोस सूचकांक शामिल हैं। यहां उल्लिखित विधियां विस्तारित अवधि के माइक्रोप्लेट विकास वक्र प्रयोगों का संचालन और विश्लेषण करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करती हैं और इसमें वाष्पीकरण और ढक्कन संघनन को कम करने के लिए संशोधन शामिल हैं। ये प्रोटोकॉल धीमी गति से बढ़ने वाले जीवाणु मेजबानों और उनके बैक्टीरियोफेज के बीच बातचीत के माइक्रोप्लेट-आधारित परख की सुविधा प्रदान करते हैं।

Introduction

बैक्टीरियोफेज या फेज वायरस हैं जो बैक्टीरिया को संक्रमित करते हैं। वे ग्रह1 पर सबसे अधिक जैविक संस्थाएं हैं, और यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि बैक्टीरियोफेज बैक्टीरिया के विकास और पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं 2,3,4. बैक्टीरियोफेज होस्ट रेंज 8 और संक्रमण गतिशीलता5,6 का वर्णन, माप और विश्लेषण करने के लिए कई विधियां मौजूद हैं, जिनमें आगर-आधारित विधियां जैसे डबल-लेयर एगर विधि7 और ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट विधियां 8,9,10,11,12 शामिल हैं।. प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान हैं। उनकी दक्षता के कारण, डबल-लेयर एगर विधि का उपयोग करके चढ़ाना परीक्षण मेजबान रेंज परख के लिए "स्वर्ण मानक" हैं, लेकिन यह विधि समय- और श्रम-गहन9 है। रैपिड माइक्रोप्लेट विधियां, जो 24 घंटे या उससे कम समय में परिणाम देती हैं, तेजी से बढ़ते जीवाणु मेजबानों जैसे एस्चेरिचिया कोलाई 9,10,11,12 के लिए उत्कृष्ट परिणाम देती हैं, लेकिन एक्टिनोमाइसेट्स7,13,14,15 जैसे धीमी गति से बढ़ने वाले जीवाणु मेजबानों में बैक्टीरियोफेज संक्रमण की प्रगति को प्रदर्शित करने के लिए बहुत संक्षिप्त हैं।

तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए डिज़ाइन किए गए एक ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट परख को वाष्पीकरण के बिना धीमी गति से बढ़ने वाले मेजबान जीवाणु में संक्रमण की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए आवश्यक कई दिनों तक नहीं चलाया जा सकता है और कृत्रिम रूप से उच्च जीवाणु घनत्व देता है। इस प्रकार, धीमी गति से बढ़ने वाली जीवाणु प्रजातियों के लिए बैक्टीरियोफेज संक्रमण गतिशीलता पर तुलनीय उच्च-थ्रूपुट डेटा प्राप्त करने के लिए इन बैक्टीरिया के लिए अनुकूलित विशेष तकनीकों की आवश्यकता होती है।

यहां प्रस्तुत माइक्रोप्लेट विधि वाष्पीकरण को कम करती है, इस प्रकार धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया को एक विस्तारित 96 घंटे की अवधि के लिए फेज के साथ सह-सुसंस्कृत करने की अनुमति देती है और फेज संक्रमण गतिशीलता और मेजबान सीमा में जांच को सक्षम करती है। यह विधि स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स16 को भी प्रदर्शित करती है, एक ऑप्टिकल घनत्व-आधारित मीट्रिक जो असमान मेजबान-वायरस प्रणालियों के बीच विषाणु तुलना की अनुमति देता है।

Protocol

जबकि यह प्रोटोकॉल गॉर्डनिया टेरा के लिए लिखा गया है, इसका उपयोग गॉर्डनिया लैकुने, गॉर्डनिया रुब्रिपर्टिंक्टा और गॉर्डनिया वेस्टफेलिका के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है।

1. बैक्टीरिया की तैयारी

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, गॉर्डनिया टेरा सीएजी 3 की एक कॉलोनी को 200 मिलीलीटर पेप्टोन खमीर कैल्शियम शोरबा18 (पीवाईसीए) के साथ 1 एल बाँझ चकरा फ्लास्क में टीका लगाने के लिए अच्छे सूक्ष्मजीवविज्ञानी अभ्यास17 का उपयोग करें जिसमें 0.01 मिलीग्राम / एमएल साइक्लोहेक्सिमाइड होता है (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. फ्लास्क को 30 डिग्री सेल्सियस पर 250 आरपीएम पर हिलाने के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि कल्चर संतृप्त न हो जाए या 3 दिनों के लिए7।
  3. पीवाईसीए शोरबा में संतृप्त जी टेरा कल्चर को क्रमिक रूप से पतला करें, और पीवाईसीएप्लेटों 19,20 पर 10-4, 10-5, और 10-6 तनुकरण में से प्रत्येक स्प्रेड-प्लेट 100 μL को पतला करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अपरिवर्तित संतृप्त संस्कृति को ठंडा करें।
  4. स्प्रेड प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए उल्टा इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेशन बाद, एक "गिनने योग्य प्लेट" की पहचान करें, 20-200 कॉलोनियों वाली एक प्लेट। उस प्लेट पर कॉलोनियों की संख्या की गणना करें, और प्रति मिलीलीटर (सीएफयू / एमएल) 19,20 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गणना करें।
  6. PYCa शोरबा के साथ संतृप्त संस्कृति को 4.0 x 106 cfu / mL बैक्टीरिया तक पतला करें।

2. फेज की तैयारी

नोट: रिपोर्ट किए गए प्रतिनिधि परिणाम गॉर्डनिया फेज डेलरियो21 के साथ प्राप्त किए गए थे, जो जी टेरा पर पृथक एक समशीतोष्ण बैक्टीरियोफेज है। इन विधियों का उपयोग अन्य गॉर्डनिया फेज के साथ भी सफलतापूर्वक किया गया है।

  1. एक पृथक बैक्टीरियोफेज के साथ शुरू करते हुए, फेज बफर7 में फेज नमूने को 1 x 10−8 कमजोर पड़ने तक क्रमिक रूप से पतला करें। संतृप्त जी टेरा कल्चर के 0.3 एमएल को संक्रमित करके प्रत्येक फेज कमजोर पड़ने के 10 μL के साथ एक डबल-लेयर एगर फेज टिटर परख7 का प्रदर्शन करें। 5-10 मिनट के कमरे के तापमान इनक्यूबेशन के बाद, बैक्टीरिया-फेज मिश्रण को 3 मिलीलीटर पीवाईसीए शीर्ष आगर के साथ मिलाएं, और पीवाईसीए एगर प्लेटों पर डालें।
  2. प्लेटों को 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर उलटा इनक्यूबेट करें या जब तक कि प्लेक7 न बन जाएं।
  3. इनक्यूबेशन बाद, एक "गिनने योग्य प्लेट" की पहचान करें, 20-200 सजीले टुकड़े वाली एक प्लेट। उस प्लेट पर सजीले टुकड़े की संख्या की गणना करें, और प्रति मिलीलीटर (पीएफयू / एमएल) 7 में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों की गणना करें।

3. माइक्रोप्लेट तैयारी

नोट: इस विधि के लिए फ्लैट-बॉटम 96-वेल माइक्रोप्लेट्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया जाना चाहिए। सभी प्लेट तैयारी और लोडिंग को जैव सुरक्षा कैबिनेट में पूरा किया जाना चाहिए, और अच्छे सूक्ष्मजीवविज्ञानी अभ्यास17का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. ट्राइटन-एक्स 100 के 100 μL, 100% आइसोप्रोपेनोल के 40 मिलीलीटर और विआयनीकृत पानी22 के 160 मिलीलीटर के संयोजन से एंटी-फॉग ढक्कन कोटिंग समाधान तैयार करें। मिश्रण करने के लिए हिलाएं, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बाँझ 96-वेल माइक्रोप्लेट ढक्कन की अंदर की सतह पर 6 मिलीलीटर ढक्कन कोटिंग समाधान जोड़ें, ढक्कन को किनारों से पकड़ें और यह सुनिश्चित करने के लिए इसे घुमाएं कि यह समाधान द्वारा कवर किया गया है। घोल को ढक्कन पर 20 सेकंड के लिए बैठने दें, फिर घोल को बंद कर दें, और ढक्कन को एक कोण पर एक आटोक्लेव पेपर तौलिया पर तब तक घुमाएं जब तक कि ढक्कन पूरी तरह से सूख न जाए, जिसमें आमतौर पर 35-45 मिनट लगते हैं। किनारों से ढक्कन पकड़ने के लिए सावधान रहें।
  3. प्रत्येक 96-वेल माइक्रोप्लेट के लिए पानी में 0.1% एगरोज़ का 20 मिलीलीटर तैयार करें, अगारोस को पिघलाने के लिए माइक्रोवेविंग करें।
  4. एक बार जब अगारोस 50-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है, तो प्लेट के कुओं के बीच के सभी स्थानों में 0.1% एगरोज़ का 100 μL और पंक्ति A और पंक्ति H और स्तंभ 1, स्तंभ 2, स्तंभ 11, और स्तंभ 1223 (चित्र 1) में 200 μL अगारोस का 200 μL डालें।

4. बैक्टीरिया और फेज के साथ प्लेट लोड करना

नोट: सभी प्लेट तैयारी और लोडिंग को जैव सुरक्षा कैबिनेट में पूरा किया जाना चाहिए, और अच्छे सूक्ष्मजीवविज्ञानी अभ्यास17 का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. 96-वेल प्लेट मेंप्रत्येक कुएं में 75 μL 2.0 x 106 cfu / mL बैक्टीरिया होंगे। 4.0 x 10 6 cfu / mL बैक्टीरियल कल्चर 1: 1 को 2x PYCa शोरबा के साथ 2.0 x 106 cfu / mL तक पतला करें। प्रति 96-वेल प्लेट में 5 एमएल तैयार करें।
  2. फेज बफर7 का उपयोग करके फेज लाइसेट को पतला करें ताकि 2.0 x 106 पीएफयू / एमएल, 2.0 x 105 पीएफयू / एमएल, और 2.0 x 104 पीएफयू / एमएल सांद्रता में से प्रत्येक 1 एमएल बनाया जा सके। यह माइक्रोप्लेट9 के भीतर 1, 0.1 और 0.01 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता की अनुमति देगा।
  3. माइक्रोप्लेट को लोड करने के लिए, एक प्लेट लें जो एंटी-फॉग समाधान और अगारोस के साथ तैयार की गई थी, और चित्र 1 के बाद कॉलम 3-10 में 2.0 x 106 सीएफयू / एमएल बैक्टीरिया के पिपेट 75 μL लें।
  4. कॉलम 3 और कॉलम 4 के लिए, चित्र 1 का अनुसरण करते हुए, नो-फेज पॉजिटिव कंट्रोल के रूप में सेवा करने के लिए प्रत्येक कुएं में बाँझ फेज बफर के 75 μL जोड़ें, और प्रत्येक जोड़ के बाद मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। कॉलम 5 और कॉलम 6 में 2.0 x 106 pfu /mL फेज का 75 μL, कॉलम 7 और कॉलम 8 में 2.0 x 105 pfu/mL फेज का 75 μL, और कॉलम 9 और कॉलम 10 में 2.0 x 104 pfu/mL फेज का 75 μL, प्रत्येक जोड़ के बाद मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप िंग करें।
  5. गैस विनिमय की अनुमति देते हुए प्लेट को आंशिक रूप से सील करने के लिए लेबलिंग टेप में 0.5 के साथ प्लेट के दोनों छोटे किनारों को टेप करें।

5. इनक्यूबेशन और अवशोषण माप

  1. एक बार जब प्लेटें बैक्टीरिया और फेज से भरी होती हैं, तो उन्हें 250 आरपीएम पर माइक्रोप्लेट शेकर पर रखें, और 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 96 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें, 16 घंटे से शुरू होने वाले हर 8 घंटे में माइक्रोप्लेट रीडर पर 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व माप लें। माप के बीच प्लेटों को शेकर में वापस करें।
    नोट: 4, एच 6 घंटे, 8 घंटे और 12 घंटे की माप अवधि का मूल्यांकन किया गया था, जो घंटे 0 से शुरू होता है, और यह निर्धारित किया गया था कि संक्रमण के बाद 16 घंटे से शुरू होने वाली 8 घंटे की नमूना अवधि ने गॉर्डनिया-फेज इंटरैक्शन को सबसे अच्छा कैप्चर किया।
  3. पूरे प्रयोग के दौरान संक्षेपण के लिए ढक्कन की निगरानी करें। यदि संघनन देखा जाता है, तो ढक्कन को चरण 3.2 के अनुसार लेपित दूसरे ढक्कन से बदलें।
  4. प्रोटोकॉल अनुभाग 6 का पालन करते हुए नियंत्रण और संक्रमित विकास वक्र उत्पन्न करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. स्टेसी-सेबलोस-इंडेक्स गिटहब रिपॉजिटरी (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) में स्प्रेडशीट लेआउट के बाद, प्रत्येक फेज कमजोर पड़ने के लिए औसत और मानक विचलन की गणना करने के लिए एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करें।
  2. नियंत्रण और संक्रमित विकास वक्र बनाएं, और DescTools 24, dplyr 25, ggplot226, और readxl 27 पैकेजों के साथ R (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके संक्रमण मैट्रिक्स की गणना करें और स्टेसी-सेबलोस-इंडेक्स गिटहब रिपॉजिटरी (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) में आर स्क्रिप्ट का पालन करें।
    1. एयूसीकॉन असंक्रमित नियंत्रण वक्र के तहत क्षेत्र है, जबकि एयूसीआईएनएफ संक्रमित वक्र16 के तहत क्षेत्र है। एयूसी की गणना करें, और फिर निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके वक्र मानों, पीआईएयूसी16 के तहत क्षेत्र के आधार पर प्रतिशत वृद्धि अवरोध की गणना करें:
      (1 - [एयूसीइनफ / एयूसीकॉन]) × 100
    2. प्रत्येक वक्र पर धराशायी क्षैतिज रेखाएं चरम वृद्धि को दर्शाती हैं, जिसमें असंक्रमित विकास शिखर को एन एसिम्प्टोट (कॉन) लेबल किया जाता है और संक्रमित विकास शिखर को एनएसिम्प्टोट (आईएनएफ) लेबल किया जाता है। एनएसिम्प्टोट मानों की पहचान करें, और फिर निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके इन चरम विकास मानों, पीआईअधिकतम16 के आधार पर प्रतिशत वृद्धि अवरोध की गणना करें:
      (1 - [एन एसिम्प्टोट (inf)/N एसिम्प्टोट (con)]) × 100
    3. पीआईएयूसी और पीआईअधिकतम मानों से स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स, आईएससी16 की गणना करें, निम्नानुसार:
      (पीआईएयूसी × पीआईअधिकतम) 0.5
      समय16 के साथ स्टेसी-सेबालोस सूचकांक को एकीकृत करके सापेक्ष विषाणु की गणना करें।

Representative Results

एक प्रयोग सफल होता है यदि परिणामी विकास वक्र समय के साथ सकारात्मक नियंत्रण बैक्टीरिया की आबादी में वृद्धि दिखाता है जिसमें अवशोषण में अचानक उतार-चढ़ाव नहीं होता है। उत्पादक फेज संक्रमण के साथ और बिना 1 के एमओआई पर एक सफल प्रयोग के उदाहरण क्रमशः चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। 0.01 के एमओआई पर एक उत्पादक संक्रमण को चित्रा 4 में दर्शाया गया है। सभी तीन आंकड़ों में देखा गया सकारात्मक नियंत्रण विकास पैटर्न (हरा वक्र) इंगित करता है कि बैक्टीरिया बढ़ रहे हैं, वे विकास के दौरान झुरमुट नहीं कर रहे हैं, और कोई दूषित पदार्थ मौजूद नहीं हैं। क्लंपिंग और संदूषण को एक ही समय बिंदु पर असामान्य रूप से उच्च अवशोषण द्वारा इंगित किया जाता है। मानक विचलन आमतौर पर एक प्रयोग के समय के साथ बढ़ता है; हालांकि, नियंत्रण और संक्रमित वक्रों के बीच अतिव्यापी भारी वृद्धि या मानक विचलन एक या अधिक कुओं में संदूषण या झुरमुट का संकेत दे सकता है।

एक उत्पादक फेज संक्रमण को दर्शाने वाला विकास वक्र, जिसे चित्रा 2 द्वारा दर्शाया गया है, फेज के साथ कुओं में समय के साथ बैक्टीरिया के अवशोषण को कम करता है। जीवाणु घनत्व में यह कमी नहीं देखी जाएगी यदि जीवाणु फेज की मेजबान सीमा के बाहर है, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।

सभी प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए संक्रमण मैट्रिक्स दिखाए गए हैं, जिसमें चित्रा 2 और चित्रा 4 में उत्पादक संक्रमणों के लिए अपेक्षाकृत बड़ा आई एससी और फेज के लिए चित्रा 3 में एक बहुत छोटा आईएससी है जो मेजबान जीवाणु को कुशलतापूर्वक संक्रमित नहीं करता है।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोप्लेट लेआउट। ग्रे क्षेत्र 0.1% अगारोस से भरे हुए हैं। कॉलम 3 और कॉलम 4 में खाली कुएं नो-फेज पॉजिटिव कंट्रोल कुएं हैं जिनमें केवल फेज बफर और 2.0 x 106 सीएफयू / एमएल बैक्टीरिया होते हैं। डॉटेड कुओं में फेज और 2.0 x 106 सीएफयू / एमएल बैक्टीरिया होते हैं; कॉलम 5 और कॉलम 6 में बड़े बिंदु 2.0 x 106 पीएफयू / एमएल फेज के साथ 1 के एमओआई को इंगित करते हैं; कॉलम 7 और कॉलम 8 में मध्यम बिंदु 2.0 x 105 पीएफयू / एमएल फेज के साथ 0.1 के एमओआई को इंगित करते हैं; और कॉलम 9 और कॉलम 10 में छोटे बिंदु 2.0 x 104 पीएफयू / एमएल फेज के साथ 0.01 के एमओआई को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 1 के एमओआई पर एक फेज के साथ एक सफल विकास वक्र प्रयोग जो मेजबान जीवाणु को उत्पादक रूप से संक्रमित करता है। औसत अवशोषण मान (± मानक विचलन) असंक्रमित बैक्टीरिया (हरे) और बैक्टीरिया के लिए फेज जोड़ा (नीला) के साथ दिखाया गया है। संक्षेप: एयूसी = वक्र के नीचे का क्षेत्र; पीआईएयूसी = वक्र के नीचे के क्षेत्र से गणना की गई प्रतिशत वृद्धि निषेध; एनएसिम्प्टोट = चरम विकास मूल्य; पीआईअधिकतम = प्रतिशत वृद्धि निषेध की गणना चरम विकास मूल्यों से की जाती है; आईएससी = स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स। यह ग्राफ समशीतोष्ण गॉर्डनिया फेज डेलरियो का प्रतिनिधित्व करता है जो जी टेरा को संक्रमित करता है, जिस जीवाणु पर इसे अलग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 1 के एमओआई पर एक फेज के साथ एक सफल विकास वक्र प्रयोग जो मेजबान जीवाणु को कुशलतापूर्वक संक्रमित नहीं करता है। औसत अवशोषण मान (± मानक विचलन) असंक्रमित बैक्टीरिया (हरे) और बैक्टीरिया के लिए फेज जोड़ा (नीला) के साथ दिखाया गया है। संक्षेप: एयूसी = वक्र के नीचे का क्षेत्र; पीआईएयूसी = वक्र के नीचे के क्षेत्र से गणना की गई प्रतिशत वृद्धि निषेध; एनएसिम्प्टोट = चरम विकास मूल्य; पीआईअधिकतम = प्रतिशत वृद्धि निषेध की गणना चरम विकास मूल्यों से की जाती है; आईएससी = स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स। यह ग्राफ डेलरियो द्वारा जी रूब्रिपर्टिंक्टा संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 0.01 के एमओआई पर फेज के साथ एक सफल विकास वक्र प्रयोग। औसत अवशोषण मान (± मानक विचलन) असंक्रमित बैक्टीरिया (हरे) और बैक्टीरिया के लिए फेज जोड़ा (नीला) के साथ दिखाया गया है। संक्षेप: एयूसी = वक्र के नीचे का क्षेत्र; पीआईएयूसी = वक्र के नीचे के क्षेत्र से गणना की गई प्रतिशत वृद्धि निषेध; एनएसिम्प्टोट = चरम विकास मूल्य; पीआईअधिकतम = प्रतिशत वृद्धि निषेध की गणना चरम विकास मूल्यों से की जाती है; आईएससी = स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स। यह ग्राफ डेलरियो द्वारा जी टेरा संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट विधि बैक्टीरियोफेज होस्ट रेंज और संक्रमण गतिशीलता11 में जांच की अनुमति देती है और बैक्टीरियोफेज विषाणु के माप के रूप में स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स16 की उपयोगिता दिखाती है। हालांकि इस विधि का उपयोग किसी भी बैक्टीरियोफेज-होस्ट सिस्टम के साथ किया जा सकता है, लेकिन इसे विशेष रूप से एक्टिनोमाइसेट्स जैसे धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के साथ उपयोग के लिए तेजी से माइक्रोप्लेट विकास परख 9,10,11 को अनुकूलित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। वाष्पीकरण और ढक्कन संघनन को संबोधित करने के लिए संशोधनों के बिना धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए रैपिड माइक्रोप्लेट परख का उपयोग नहीं किया जा सकता है। यह विधि इन आवश्यक संशोधनों का वर्णन करती है और पहली बार, बैक्टीरियोफेज संक्रमण का वर्णन करने के लिए स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स और संबंधित मैट्रिक्स16 का उपयोग दर्शाती है।

वाष्पीकरण बहु-दिवसीय 96-वेल प्लेट विकास वक्र परख में एक महत्वपूर्ण चुनौती हो सकती है; यह विधि सीमा कुओं और कुओं के बीच रिक्त स्थान में अगारोस जोड़कर उस समस्या को हल करती है। अगारोस मार्जिन, एंटी-फॉग ढक्कन उपचार22 के साथ संयुक्त, माइक्रोप्लेट के भीतर आवश्यक आर्द्रता प्रदान करता है और विश्वसनीय ऑप्टिकल घनत्व माप की अनुमति देता है। अतिरिक्त आर्द्रता के बिना, आवश्यक लंबी इनक्यूबेशन अवधिके दौरान पर्याप्त किनारे प्रभाव वाष्पीकरण होता है, जिससे कृत्रिम रूप से उच्च ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग होती है। एंटी-फॉग ढक्कन उपचार एक आवश्यक संशोधन है क्योंकि ढक्कन संघनन कृत्रिम रूप से ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों को भी बढ़ा सकता है। इनक्यूबेशन अवधि के दौरान प्लेटों को हिलाना एक अनुशंसित संशोधन है, क्योंकि एक्टिनोमाइसेट बैक्टीरिया विकास के दौरान टकरा सकते हैं, कृत्रिम रूप से उच्च ऑप्टिकल घनत्व मान दे सकते हैं और संक्रमण की बहुलता को प्रभावी ढंग से कम कर सकते हैं।

संक्रमण की गतिशीलता को दर्शाने वाले प्रयोगों में बैक्टीरिया से फेज का अनुपात महत्वपूर्ण है, क्योंकि संक्रमण प्रभाव दिखाने के लिए पर्याप्त फेज होना चाहिए, लेकिन इतने अधिक नहीं कि मेजबान बैक्टीरिया की आबादी तुरंत9 दुर्घटनाग्रस्त हो जाए या लाइसोजेनी की आवृत्ति नाटकीय रूपसे बढ़ जाए। इस पद्धति में, लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे प्रभावी पाया गया अनुपात 1 का एमओआई था, लेकिन 0.1 और 0.01 के एमओआई के साथ उपयोग करने योग्य परिणाम भी प्राप्त किए गए थे। इस विधि को लागू करते समय, बैक्टीरिया की एक एकाग्रता चुनने और 0.01-1 9,10,11 की एमओआई रेंज में कई फेज सांद्रता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।

यहां वर्णित यह तकनीक बैक्टीरियोफेज-होस्ट इंटरैक्शन को प्रत्येक माप अंतराल29 पर एक बड़े कल्चर फ्लास्क से उप-नमूने के बजाय उच्च-थ्रूपुट माइक्रोप्लेट परख में धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए मूल्यांकन करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित करके कि माइक्रोप्लेट विकास परख 9,10,11 को कैसे अनुकूलित किया जा सकता है, यह तकनीक धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए अन्य माइक्रोप्लेट-आधारित बैक्टीरियोफेज परख की उपयोगिता को बढ़ाती है, जिसमें फेज लक्षण वर्णन 5,6,12 और विकास अध्ययन30,31 शामिल हैं। अंत में, यह विधि बैक्टीरियोफेज संक्रमण का वर्णन करने के लिए स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स16 के उपयोग को प्रदर्शित करती है। इस मीट्रिक को शुरू में एक आर्कियल वायरस मॉडल सिस्टम से डेटा के साथ विकसित किया गया था और इसकी गणना ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों से की जाती है, इस प्रकार इसे असमान वायरस सिस्टम में व्यापक उपयोगिता मिलती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनएसएफ डीबीआई जीवविज्ञान एकीकरण संस्थान (बीआईआई) अनुदान (पुरस्कार संख्या 2119968; पीआई-सेबलोस) और अर्कांसस आईएनबीआरई कार्यक्रम द्वारा, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज, (एनआईजीएमएस), पी 20 GM103429 नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से अनुदान के साथ। लेखक ों ने औचिता बैपटिस्ट विश्वविद्यालय में पैटरसन समर अंडरग्रेजुएट रिसर्च प्रोग्राम के समर्थन की भी सराहना की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Omni-Pur 2090 for filling border wells of microplate 
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch Corning 3931 replacement microplate lid
Isopropanol Fisher Chemical A461-4 for lid coating
Microplate reader Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform Thermo Fisher Scientific 88-861-023 to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well Falcon (a Corning Brand) 351172 microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar Homemade 1 g peptone
15 g yeast extract
15 g agar
990 mL dd H2O
4.5 mL 1 M CaCl2
2.5 mL 40% dextrose
1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth Homemade, from Reference 16 1 g peptone
15 g yeast extract
990 mL dd H2O
4.5 ml 1 M CaCl2
2.5 mL 40% dextrose
1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar Homemade 1 g peptone
15 g yeast extract
4 g agar
990 mL dd H2O
4.5 mL 1M CaCl2
2.5 mL 40% dextrose
Petri plates Thermo Fisher Scientific FB0875713 for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer Homemade, from Reference 7 10 mL 1 M Tris, pH 7.5
10 mL 1 M MgSO4
4 g NaCl
980 ml dd H2O
R software https://www.r-project.org/ version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure Thermo Fisher Scientific 4116-1000 for bacterial culture
Triton X-100 Sigma Aldrich 9036-19-5 for lid coating

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mushegian, A. R. Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer. Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).
  2. Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. Interactions between bacterial and phage communities in natural environments. Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).
  3. Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. Phage life cycles behind bacterial biodiversity. Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).
  4. Weitz, J. S., et al. Phage-bacteria infection networks. Trends in Microbiology. 21 (2), 82-91 (2013).
  5. Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. High-throughput analysis of growth differences among phage strains. Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).
  6. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence. PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).
  7. Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home (2012).
  8. Martinez-Soto, C. E., et al. PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods. Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).
  9. Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach. PLoS One. 14 (5), e0216292 (2019).
  10. Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence. Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).
  11. Sørensen, P. E., et al. Classification of in vitro phage-host population growth dynamics. Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).
  12. Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity. Biochemical Engineering Journal. 161, 107652 (2020).
  13. Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).
  14. Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).
  15. Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro. BMC Research Notes. 12 (1), 519 (2019).
  16. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough. Journal of General Virology. 102 (1), 001515 (2021).
  17. Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).
  18. Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).
  19. Van Alst, A. J., LeVeque, R. M., Martin, N., DiRita, V. J. Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units (2023).
  20. Wise, K. Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology. , Available from: https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf (2006).
  21. Mathes, H. N., et al. Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas. Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323 (2023).
  22. Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers. PLoS One. 16 (1), 0245205 (2021).
  23. Evoluted New Media. Beating the edge effect. Laboratory News. , Available from: http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect (2011).
  24. Signorell, A. DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=DescTools (2023).
  25. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K., Vaughan, D. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2023).
  26. Wickham, H., et al. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2 (2023).
  27. Wickham, H., Bryan, J. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=readxl (2023).
  28. Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118 (2021).
  29. Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice. Communications Biology. 5, 48 (2022).
  30. Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol. Viruses. 11 (3), 241 (2019).
  31. Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli. PeerJ. 4, e2060 (2013).

Tags

जीव विज्ञान अंक 196
एक्टिनोबैक्टीरियोफेज संक्रमण को चिह्नित करने के लिए एक अनुकूलित ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christenson, E. I., Zhang, Q.,… More

Christenson, E. I., Zhang, Q., Plymale, R. An Adapted Optical Density-Based Microplate Assay for Characterizing Actinobacteriophage Infection. J. Vis. Exp. (196), e65482, doi:10.3791/65482 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter