डिज़ाइन किए गए मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों और स्व-मान्य एन्सेंबल मॉडल (एसवीईएम) का उपयोग करके लिपिड नैनोपार्टिकल (एलएनपी) फॉर्मूलेशन अनुकूलन के लिए एक वर्कफ़्लो

विवो जीन वितरण प्रणालियों में लिपिड नैनोपार्टिकल (एलएनपी) फॉर्मूलेशन में आम तौर पर आयनेबल, हेल्पर और पीईजी लिपिड ^1,2,3 की श्रेणियों से चार घटक लिपिड शामिल होते हैं। चाहे इन लिपिडों का अध्ययन अकेले किया जा रहा हो या अन्य गैर-मिश्रण कारकों के साथ-साथ, इन योगों के प्रयोगों के लिए "मिश्रण" डिजाइनों की आवश्यकता होती है क्योंकि - एक उम्मीदवार सूत्रीकरण को देखते हुए - किसी भी एक लिपिड के अनुपात को बढ़ाने या घटाने से आवश्यक रूप से अन्य तीन लिपिडों के अनुपात के योग में कमी या वृद्धि होती है।

उदाहरण के लिए, यह माना जाता है कि हम एक एलएनपी फॉर्मूलेशन का अनुकूलन कर रहे हैं जो वर्तमान में एक सेट नुस्खा का उपयोग करता है जिसे बेंचमार्क के रूप में माना जाएगा। लक्ष्य एलएनपी की शक्ति को अधिकतम करना है, जबकि दूसरा औसत कण आकार को कम करना है। प्रयोग में विविध अध्ययन कारक चार घटक लिपिड (आयनेबल, कोलेस्ट्रॉल, डोप, पीईजी), एन: पी अनुपात, प्रवाह दर और आयनीय लिपिड प्रकार के दाढ़ अनुपात हैं। आयनीय और सहायक लिपिड (कोलेस्ट्रॉल सहित) को पीईजी की तुलना में 10-60% दाढ़ अनुपात की एक विस्तृत श्रृंखला में भिन्न होने की अनुमति है, जो इस चित्रण में 1-5% से भिन्न होगा। बेंचमार्क फॉर्मूलेशन रेसिपी और अन्य कारकों की श्रेणियां और उनकी राउंडिंग ग्रैन्यूलैरिटी पूरक फ़ाइल 1 में निर्दिष्ट की गई है। इस उदाहरण के लिए, वैज्ञानिक एक ही दिन में 23 रन (कणों के अद्वितीय बैच) करने में सक्षम हैं और यदि यह न्यूनतम आवश्यकताओं को पूरा करता है तो इसे अपने नमूना आकार के रूप में उपयोग करना चाहते हैं। इस प्रयोग के लिए सिम्युलेटेड परिणाम पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल 3 में प्रदान किए जाते हैं ।

रामपाडो और पीयर⁴ ने नैनोपार्टिकल-आधारित दवा वितरण प्रणालियों के अनुकूलन के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के विषय पर एक हालिया समीक्षा पत्र प्रकाशित किया है। कॉफमैन एट ^अल.5 ने आंशिक तथ्यात्मक और निश्चित स्क्रीनिंग डिजाइन⁶ का उपयोग करके एलएनपी अनुकूलन अध्ययनों पर विचार किया; हालांकि, इस प्रकार के डिज़ाइन अक्षम "स्लैक ^{चर" 7} के उपयोग का सहारा लिए बिना मिश्रण बाधा को समायोजित नहीं कर सकते हैं और आमतौर पर उपयोग नहीं किए जाते हैं जब मिश्रण कारक ^7,8 मौजूद होते हैं। इसके बजाय, मिश्रण बाधा को शामिल करने में सक्षम "इष्टतम डिजाइन" पारंपरिक रूप से मिश्रण-प्रक्रिया^{प्रयोगों के} लिए उपयोग किए जाते हैं। ये डिज़ाइन अध्ययन कारकों के उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट फ़ंक्शन को लक्षित करते हैं और केवल इष्टतम होते हैं (कई संभावित इंद्रियों में से एक में) यदि यह फ़ंक्शन अध्ययन कारकों और प्रतिक्रियाओं के बीच सही संबंध को पकड़ता है। ध्यान दें कि पाठ में "इष्टतम डिजाइन" और "इष्टतम फॉर्मूलेशन उम्मीदवारों" के बीच एक अंतर है, जिसमें उत्तरार्द्ध एक सांख्यिकीय मॉडल द्वारा पहचाने गए सर्वोत्तम योगों का उल्लेख करता है। इष्टतम डिजाइन मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों के लिए तीन मुख्य नुकसान के साथ आते हैं। सबसे पहले, यदि वैज्ञानिक लक्ष्य मॉडल को निर्दिष्ट करते समय अध्ययन कारकों की बातचीत का अनुमान लगाने में विफल रहता है, तो परिणामी मॉडल पक्षपाती होगा और हीन उम्मीदवार फॉर्मूलेशन का उत्पादन कर सकता है। दूसरा, इष्टतम डिजाइन कारक स्थान की बाहरी सीमा पर अधिकांश रन रखते हैं। एलएनपी अध्ययनों में, यह बड़ी संख्या में खोए हुए रन का कारण बन सकता है यदि कण लिपिड या प्रक्रिया सेटिंग्स के किसी भी चरम सीमा पर सही ढंग से नहीं बनते हैं। तीसरा, वैज्ञानिक अक्सर प्रतिक्रिया सतह की एक मॉडल-स्वतंत्र समझ हासिल करने और कारक स्थान के पहले से अस्पष्टीकृत क्षेत्रों में सीधे प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए कारक स्थान के इंटीरियर पर प्रयोगात्मक रन करना पसंद करते हैं।

एक वैकल्पिक डिजाइन सिद्धांत अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइन¹⁰ के साथ (मिश्रण-विवश) कारक स्थान के अनुमानित समान कवरेज को लक्षित करना है। ये डिज़ाइन इष्टतम डिज़ाइन⁹ के सापेक्ष कुछ प्रयोगात्मक दक्षता का त्याग करते हैं (यह मानते हुए कि पूरे कारक स्थान वैध योगों की ओर जाता है) लेकिन एक ट्रेड-ऑफ में कई लाभ प्रस्तुत करते हैं जो इस एप्लिकेशन में उपयोगी हैं। अंतरिक्ष भरने वाला डिज़ाइन प्रतिक्रिया सतह की संरचना के बारे में कोई प्राथमिक धारणा नहीं बनाता है; यह अध्ययन कारकों के बीच अप्रत्याशित संबंधों को पकड़ने के लिए लचीलापन देता है। यह डिजाइन पीढ़ी को भी सुव्यवस्थित करता है क्योंकि इसे निर्णय लेने की आवश्यकता नहीं होती है कि वांछित रन आकार समायोजित होने के रूप में कौन से प्रतिगमन शब्दों को जोड़ना या हटाना है। जब कुछ डिजाइन बिंदु (व्यंजनों) असफल योगों की ओर ले जाते हैं, तो अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइन अध्ययन कारकों पर विफलता सीमा को मॉडल करना संभव बनाते हैं, जबकि सफल कारक संयोजनों पर अध्ययन प्रतिक्रियाओं के लिए सांख्यिकीय मॉडल का समर्थन भी करते हैं। अंत में, कारक स्थान का आंतरिक कवरेज प्रतिक्रिया सतह के मॉडल-स्वतंत्र ग्राफिकल अन्वेषण की अनुमति देता है।

मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोग के मिश्रण कारक की कल्पना करने के लिए, विशेष त्रिकोणीय "त्रिगुट भूखंड" का उपयोग किया जाता है। चित्र 1 इस उपयोग को प्रेरित करता है: उन बिंदुओं के घन में जहां तीन अवयवों को 0 से 1 तक की सीमा की अनुमति है, वे बिंदु जो एक बाधा को पूरा करते हैं कि सामग्री का योग 1 के बराबर है, लाल रंग में हाइलाइट किए गए हैं। तीन अवयवों पर मिश्रण बाधा एक त्रिकोण के लिए व्यवहार्य कारक स्थान को कम कर देती है। चार मिश्रण अवयवों के साथ एलएनपी अनुप्रयोगों में, हम एक "अन्य" अक्ष के खिलाफ एक समय में दो लिपिड को प्लॉट करके कारक स्थान का प्रतिनिधित्व करने के लिए छह अलग-अलग त्रिआधारी भूखंडों का उत्पादन करते हैं जो अन्य लिपिड के योग का प्रतिनिधित्व करता है।

चित्र 1: त्रिकोणीय कारक क्षेत्र। घन के भीतर अंतरिक्ष भरने वाले भूखंड में, छोटे ग्रे डॉट्स उन योगों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो मिश्रण बाधा के साथ असंगत हैं। बड़े लाल बिंदु घन के भीतर अंकित एक त्रिभुज पर स्थित होते हैं और उन योगों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनके लिए मिश्रण बाधा संतुष्ट होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लिपिड मिश्रण कारकों के अलावा, अक्सर एक या अधिक निरंतर प्रक्रिया कारक होते हैं जैसे कि एन: पी अनुपात, बफर एकाग्रता, या प्रवाह दर। श्रेणीबद्ध कारक मौजूद हो सकते हैं, जैसे आयनीय लिपिड प्रकार, सहायक लिपिड प्रकार, या बफर प्रकार। लक्ष्य एक सूत्रीकरण (प्रक्रिया कारकों के लिए लिपिड और सेटिंग्स का मिश्रण) खोजना है जो शक्ति के कुछ माप को अधिकतम करता है और / या भौतिक रासायनिक विशेषताओं में सुधार करता है जैसे कण आकार और पीडीआई (पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स) को कम करना, प्रतिशत एनकैप्सुलेशन को अधिकतम करना, और साइड इफेक्ट्स को कम करना - जैसे कि शरीर का वजन कम करना - विवो अध्ययनों में । यहां तक कि एक उचित बेंचमार्क नुस्खा से शुरू करते समय, आनुवंशिक पेलोड में बदलाव को देखते हुए या प्रक्रिया कारकों या लिपिड प्रकारों में परिवर्तन पर विचार करते समय फिर से अनुकूलन करने में रुचि हो सकती है।

कॉर्नेल⁷ मिश्रण और मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों के सांख्यिकीय पहलुओं पर एक निश्चित पाठ प्रदान करता है, जिसमें मायर्स एट ^अल.9 अनुकूलन के लिए सबसे प्रासंगिक मिश्रण डिजाइन और विश्लेषण विषयों का एक उत्कृष्ट सारांश प्रदान करता है। हालांकि, ये काम सांख्यिकीय विवरण और विशेष शब्दावली के साथ वैज्ञानिकों को अधिभार ति कर सकते हैं। प्रयोगों के डिजाइन और विश्लेषण के लिए आधुनिक सॉफ्टवेयर एक मजबूत समाधान प्रदान करता है जो प्रासंगिक सिद्धांत से अपील किए बिना अधिकांश एलएनपी अनुकूलन समस्याओं का पर्याप्त रूप से समर्थन करेगा। जबकि अधिक जटिल या उच्च-प्राथमिकता वाले अध्ययन अभी भी एक सांख्यिकीविद् के साथ सहयोग से लाभान्वित होंगे और अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइनों के बजाय इष्टतम को नियोजित कर सकते हैं, हमारा लक्ष्य वैज्ञानिकों के आराम स्तर में सुधार करना और अक्षम वन-फैक्टर-एट-ए-टाइम (ओएफएटी) परीक्षण¹¹ की अपील किए बिना एलएनपी फॉर्मूलेशन के अनुकूलन को प्रोत्साहित करना है या बस विनिर्देशों को संतुष्ट करने वाले पहले फॉर्मूलेशन के लिए समझौता करना है।

इस लेख में, एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है जो एक सामान्य एलएनपी फॉर्मूलेशन समस्या को अनुकूलित करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है, डिज़ाइन और विश्लेषण के मुद्दों को इस क्रम में संबोधित करता है कि उनका सामना किया जाएगा। वास्तव में, विधि सामान्य अनुकूलन समस्याओं के लिए काम करेगी और एलएनपी तक ही सीमित नहीं है। रास्ते में, उठने वाले कई सामान्य प्रश्नों को संबोधित किया जाता है और सिफारिशें प्रदान की जाती हैं जो अनुभव और^{सिमुलेशन परिणामों में} आधारित होती हैं। स्व-मान्य पहनावा मॉडल (एसवीईएम) ¹³ के हाल ही में विकसित ढांचे ने मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों से परिणामों का विश्लेषण करने के लिए अन्यथा नाजुक दृष्टिकोण में काफी सुधार किया है, और हम इस दृष्टिकोण का उपयोग सूत्रीकरण अनुकूलन के लिए एक सरलीकृत रणनीति प्रदान करने के लिए करते हैं। जबकि वर्कफ़्लो का निर्माण एक सामान्य तरीके से किया जाता है जिसे अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग करके पालन किया जा सकता है, जेएमपी 17 प्रो ग्राफिकल सारांश टूल के साथ एसवीईएम की पेशकश करने में अद्वितीय है जिसे हमने मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों के अन्यथा आर्केन विश्लेषण को सरल बनाने के लिए आवश्यक पाया है। नतीजतन, प्रोटोकॉल में जेएमपी-विशिष्ट निर्देश भी प्रदान किए जाते हैं।

एसवीईएम पारंपरिक दृष्टिकोण के समान रैखिक प्रतिगमन मॉडल नींव को नियोजित करता है, लेकिन यह हमें थकाऊ संशोधनों से बचने की अनुमति देता है जो आगे के चयन या दंडित चयन (लासो) आधार दृष्टिकोण का उपयोग करके उम्मीदवार प्रभावों के "पूर्ण मॉडल" को फिट करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अतिरिक्त, एसवीईएम एक बेहतर "कम मॉडल" फिट प्रदान करता है जो डेटा में दिखाई देने वाले शोर (प्रक्रिया प्लस विश्लेषणात्मक विचरण) को शामिल करने की क्षमता को कम करता है। यह मॉडल ^{13,14,15,16,17,18} में प्रत्येक रन के सापेक्ष महत्व को बार-बार दोहराने के परिणामस्वरूप अनुमानित मॉडल ों के औसत से काम करता है। एसवीईएम मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों के मॉडलिंग के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है जो पारंपरिक एकल-शॉट प्रतिगमन की तुलना में लागू करना आसान है और बेहतर गुणवत्ता वाले इष्टतम फॉर्मूलेशन उम्मीदवारों^12,13 का उत्पादन करता है। एसवीईएम के गणितीय विवरण इस पेपर के दायरे से परे हैं और यहां तक कि प्रासंगिक साहित्य समीक्षा से परे एक सरसरी सारांश भी इस आवेदन में अपने मुख्य लाभ से विचलित होगा: यह चिकित्सकों के लिए एक सरल, मजबूत और सटीक क्लिक-टू-रन प्रक्रिया की अनुमति देता है।

प्रस्तुत वर्कफ़्लो दवा विकास²⁰ के लिए डिज़ाइन द्वारा गुणवत्ता (क्यूबीडी) ¹⁹ दृष्टिकोण के अनुरूप है। अध्ययन का परिणाम कार्यात्मक संबंधों की समझ होगी जो सामग्री विशेषताओं और प्रक्रिया मापदंडों को महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (सीक्यूए) ²¹ से जोड़ता है। डैनियल एट अल ^.22 विशेष रूप से आरएनए प्लेटफॉर्म उत्पादन के लिए क्यूबीडी फ्रेमवर्क का उपयोग करने पर चर्चा करें: हमारे वर्कफ़्लो को इस ढांचे के भीतर एक उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था और प्रक्रियाओं को हमारे संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों का पालन करते हुए किया गया था। 6-8 सप्ताह की मादा बाल्ब / सी चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था। जानवरों को एड लिबिटम मानक चाउ और पानी प्राप्त हुआ और 40-60% आर्द्रता के साथ 65-75 डिग्री फ़ारेनहाइट (~ 18-23 डिग्री सेल्सियस) के तापमान पर 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्रों के साथ मानक परिस्थितियों में रखा गया।

1. अध्ययन उद्देश्य, प्रतिक्रियाओं और कारकों को रिकॉर्ड करना

नोट: इस प्रोटोकॉल के दौरान, जेएमपी 17 प्रो प्रयोग को डिजाइन और विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। समकक्ष सॉफ्टवेयर का उपयोग समान चरणों का पालन करके किया जा सकता है। अनुभाग 1 में किए गए सभी चरणों के लिए उदाहरण और आगे के निर्देशों के लिए, कृपया पूरक फ़ाइल 1 देखें।

1. दिनांक-मुद्रित दस्तावेज़ में प्रयोग के उद्देश्य को सारांशित करें।
2. प्रयोग के दौरान मापी जाने वाली प्राथमिक प्रतिक्रियाओं (सीक्यूए) को सूचीबद्ध करें।
3. किसी भी द्वितीयक प्रतिक्रियाओं (जैसे, भौतिक रासायनिक गुणों पर डाउनस्ट्रीम प्रतिबंध) को सूचीबद्ध करें जिन्हें मापा जा सकता है।
4. प्रक्रिया मापदंडों को सूचीबद्ध करें जो प्रतिक्रियाओं से संबंधित हो सकते हैं, जिनमें वे भी शामिल हैं जो अध्ययन के उद्देश्य के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक हैं।
5. यदि अध्ययन कई दिनों तक चलेगा तो एक दिन श्रेणीबद्ध "ब्लॉकिंग" कारक शामिल है।
   नोट: यह प्रक्रिया में दिन-स्तर के बदलाव को रोकने के लिए दिनों में कारक सेटिंग्स को संतुलित करता है, जिसका मतलब अध्ययन कारकों के साथ भ्रमित होने से है।
6. अध्ययन के दौरान विविध होने वाले कारकों और उन्हें स्थिर रखने के लिए चुनें।
   नोट: कारकों के सबसे प्रासंगिक उप-समूह का चयन करने के लिए विफलता मोड प्रभाव विश्लेषण²⁰ जैसे जोखिम प्राथमिकता उपकरण का उपयोग करें (चित्रा 2)। आमतौर पर, सभी लिपिड को अलग-अलग होने की अनुमति दी जानी चाहिए; हालांकि कुछ बजट-सीमित मामलों में, पीईजी को एक निश्चित अनुपात में लॉक करना उचित है।
7. अलग-अलग कारकों और प्रत्येक के लिए प्रासंगिक दशमलव परिशुद्धता के लिए श्रेणियां स्थापित करें।
8. न्यूनतम और अधिकतम हेरिस्टिक्स का उपयोग करके अध्ययन डिजाइन आकार (कणों के अद्वितीय बैचों की संख्या) तय करें। मैन्युअल रूप से शामिल नियंत्रण बेंचमार्क रन हेरिस्टिक्स द्वारा अनुशंसित रन आकार की ओर नहीं गिने जाते हैं।
   नोट: निम्नलिखित हेरिस्टिक ्स मानते हैं कि प्रतिक्रियाएं निरंतर हैं। न्यूनतम हेरिस्टिक मानता है कि उम्मीदवार इष्टतम योगों के लिए पुष्टिकरण रन करने के अलावा, यदि आवश्यक हो, तो अनुवर्ती अध्ययन करना संभव होगा। यदि केवल पुष्टिकरण रन करना संभव होगा, तो अधिकतम हेरिस्टिक से प्राप्त रनों की संख्या के लिए बजट बनाना बेहतर है। द्विआधारी प्राथमिक प्रतिक्रियाओं के लिए, रनों की उचित संख्या निर्धारित करने के लिए एक सांख्यिकीविद् से मदद लें।
   1. न्यूनतम अनुमानी: प्रति मिश्रण कारक में तीन रन, प्रति निरंतर प्रक्रिया कारक दो, और प्रत्येक श्रेणीबद्ध कारक के प्रति स्तर पर एक रन आवंटित करें।
      नोट: चार लिपिड कारकों, दो निरंतर, और एक तीन-तरफा श्रेणीबद्ध प्रक्रिया चर के साथ एक अध्ययन के लिए, यह (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 अंतरिक्ष भरने वाले रन के सुझाव की ओर जाता है। यदि कुछ सूत्रीकरण या माप के मुद्दों के कारण विफल होने की संभावना है तो अतिरिक्त रन जोड़ें।
   2. अधिकतम अनुमानी: इष्टतम डिजाइन बनाने के लिए सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और दूसरे क्रम के लिए आवश्यक मापदंडों को इनपुट करें (मुख्य प्रभाव, सभी प्रभावों के बीच दो-तरफा बातचीत और निरंतर प्रक्रिया कारकों के लिए द्विघात प्रभाव सहित)। सॉफ्टवेयर के एल्गोरिथ्म के अनुसार न्यूनतम रन आकार की गणना करें। अधिकतम अनुमानी को परिभाषित करने के लिए सॉफ़्टवेयर से प्राप्त परिणाम में 1 जोड़ें।
      नोट: इन चरणों को निष्पादित करने पर विस्तृत निर्देशों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें। चार लिपिड कारकों, दो निरंतर और एक तीन-तरफा श्रेणीबद्ध प्रक्रिया चर के साथ एक नमूना मामला, 34 (सॉफ्टवेयर सिफारिश + 1 से 33) के अनुशंसित रन आकार की ओर जाता है। इससे परे किसी भी रन का उपयोग पुष्टि या अनुवर्ती अध्ययन के लिए बेहतर किया जाएगा।

चित्र 2: कारण और प्रभाव आरेख। आरेख एलएनपी फॉर्मूलेशन अनुकूलन समस्या में सामान्य कारकों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. एक अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइन के साथ डिजाइन तालिका का निर्माण

1. JMP खोलें और स्पेस फिलिंग डिज़ाइन के विशेष उद्देश्य > डीओई मेनू बार > नेविगेट करें।
2. अध्ययन प्रतिक्रियाएं दर्ज करें ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
3. वैकल्पिक: अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं के लिए स्तंभ जोड़ें, यह दर्शाता है कि क्या प्रतिक्रिया जोड़ें पर क्लिक करके प्रत्येक को अधिकतम, छोटा या लक्षित किया जाना है.
   नोट: ये सेटिंग्स बाद में संशोधित किया जा सकता है और डिजाइन को प्रभावित नहीं करता है। इसी तरह, डिज़ाइन तालिका बनाने के बाद अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं के लिए अतिरिक्त कॉलम जोड़े जा सकते हैं।
4. अध्ययन कारक ों और संबंधित श्रेणियों को दर्ज करें। मिश्रण कारक ों को जोड़ने के लिए मिश्रण बटन का उपयोग करें, निरंतर कारकों को जोड़ने के लिए निरंतर बटन, या श्रेणीबद्ध कारकों को जोड़ने के लिए श्रेणीबद्ध बटन का उपयोग करें।
   नोट: यह उदाहरण अध्ययन चित्रा 3 में चित्रित कारकों और श्रेणियों का उपयोग करता है, जिसमें आयनीय दाढ़ अनुपात (0.1 और 0.6 के बीच), हेल्पर मोलर अनुपात (0.1 और 0.6 के बीच भी), कोलेस्ट्रॉल मोलर अनुपात (0.1 और 0.6 के बीच), पीईजी मोलर अनुपात (0.01 से 0.05 तक), और आयनीय लिपिड प्रकार (जो एच 101 हो सकता है) शामिल हैं। H102, या H103)।
5. रन की संख्या फ़ील्ड में डिज़ाइन के लिए रनों की पूर्व निर्धारित संख्या इनपुट करें ।
6. वैकल्पिक: स्पेस फिलिंग डिज़ाइन हेडर के बगल में और उन्नत विकल्प सबमेनू में लाल त्रिकोण मेनू के माध्यम से औसत क्लस्टर आकार को 50 से 2000 के डिफ़ॉल्ट से बढ़ाएं।
   नोट: यह अंतरिक्ष भरने वाले एल्गोरिदम के लिए एक सेटिंग है जो अतिरिक्त कम्प्यूटेशनल समय की कीमत पर थोड़ा बेहतर डिजाइन निर्माण कर सकता है।
7. चुने हुए कारकों और रन आकार के लिए स्थान-भरने वाली डिज़ाइन तालिका उत्पन्न करें। तेजी से लचीला भरने पर क्लिक करें, फिर तालिका बनाएँ क्लिक करें.
   नोट: एक उदाहरण डिजाइन से पहले दो रन चित्रा 4 में दिखाए गए हैं।
8. मैन्युअल रूप से बनाए गए किसी भी रन को एनोटेट करने के लिए तालिका में नोट्स कॉलम जोड़ें। स्तंभ जोड़ने के लिए पहले रिक्त स्तंभ शीर्षलेख को डबल-क्लिक करें, और तब नाम संपादित करने के लिए नया स्तंभ शीर्षलेख डबल-क्लिक करें.
9. यदि लागू हो, तो मैन्युअल रूप से बेंचमार्क नियंत्रण को डिज़ाइन तालिका में शामिल करें। नियंत्रण बेंचमार्क में से एक के लिए एक प्रतिकृति शामिल करें। नोट्स कॉलम में बेंचमार्क नाम चिह्नित करें और आसान ग्राफ ़ पहचान के लिए बेंचमार्क प्रतिकृति पंक्तियों को रंग-कोड करें।
   1. पहली खाली पंक्ति हेडर को डबल-क्लिक करके एक नई पंक्ति जोड़ें और बेंचमार्क कारक सेटिंग्स इनपुट करें। बेंचमार्क की प्रतिकृति बनाने के लिए इस पंक्ति को डुप्लिकेट करें। दोनों पंक्तियों को हाइलाइट करें और ग्राफ़िंग उद्देश्यों के लिए रंग असाइन करने के लिए पंक्तियों > रंगों पर नेविगेट करें।
      नोट: प्रतिकृति प्रक्रिया और विश्लेषणात्मक विचरण का एक मॉडल-स्वतंत्र अनुमान प्रदान करती है और अतिरिक्त ग्राफिकल अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।
10. यदि कोई बेंचमार्क नियंत्रण अध्ययन कारकों की सीमा से अधिक चलता है, तो विश्लेषण से भविष्य के बहिष्करण के लिए "नोट्स" कॉलम में इसे निरूपित करें।
11. मिश्रण कारकों को उपयुक्त ग्रैन्यूलैरिटी में गोल करें। ऐसा करने के लिए,
    1. मिश्रण कारकों के लिए स्तंभ शीर्षलेख हाइलाइट करें, स्तंभ शीर्षलेखों में से किसी एक पर राइट-क्लिक करें, और नया सूत्र स्तंभ पर नेविगेट करें > > राउंड बदलें..., सही राउंडिंग अंतराल इनपुट करें, और ठीक क्लिक करें.
    2. पंक्ति और स्तंभ शीर्षलेख के चौराहे पर नीचे त्रिभुज पर क्लिक करके सुनिश्चित करें कि कोई पंक्ति चयनित नहीं है.
    3. नए बनाए गए गोल स्तंभों (Ctrl + C) से मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और मूल मिश्रण स्तंभों में चिपकाएँ (Ctrl + V)। अंत में, अस्थायी गोल मान स्तंभ हटाएँ.
12. लिपिड अनुपात को गोल करने के बाद, मिश्रण कारकों के लिए कॉलम हेडर का चयन करके, एक पर राइट-क्लिक करके और नए फॉर्मूला कॉलम > कंबाइन > योग पर जाकर सत्यापित करें कि उनका योग 100% के बराबर है। यदि किसी भी पंक्ति का योग 1 के बराबर नहीं है, तो मैन्युअल रूप से मिश्रण कारकों में से एक को समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कारक सेटिंग कारक सीमा के भीतर रहती है। समायोजन किए जाने के बाद योग स्तंभ हटाएँ.
13. प्रक्रिया कारकों को उनके संबंधित ग्रैन्यूलैरिटी में गोल करने के लिए मिश्रण कारकों को गोल करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही प्रक्रिया का पालन करें।
14. लिपिड स्तंभों को दशमलव की वांछित संख्या के साथ प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित करने के लिए स्वरूपित करें: स्तंभ शीर्षलेख का चयन करें, राइट-क्लिक करें, और मानकीकृत विशेषताएँ चुनें .... अगली विंडो में, प्रतिशत पर स्वरूप सेट करें और आवश्यकतानुसार दशमलव की संख्या समायोजित करें।
15. यदि बेंचमार्क जैसे मैन्युअल रन जोड़े जाते हैं, तो तालिका पंक्ति क्रम को फिर से यादृच्छिक करें: यादृच्छिक मानों के साथ एक नया स्तंभ जोड़ें (अंतिम स्तंभ शीर्षलेख पर राइट-क्लिक करें और रैंडम > रैंडम नॉर्मल > नया सूत्र स्तंभ चुनें). इस स्तंभ को इसके स्तंभ शीर्षलेख पर राइट-क्लिक करके आरोही क्रम में क्रमबद्ध करें, और तब स्तंभ हटाएँ.
16. वैकल्पिक: कोई रन ID स्तंभ जोड़ें. इसे तालिका से वर्तमान दिनांक, प्रयोग नाम और पंक्ति संख्या के साथ पॉप्युलेट करें।
    नोट: एक उदाहरण के लिए (चित्रा 5) देखें।
17. लिपिड कारकों पर डिजाइन बिंदुओं की कल्पना करने के लिए त्रिआधारी भूखंड उत्पन्न करें (चित्रा 6)। इसके अलावा, प्रक्रिया कारकों पर रन वितरण की जांच करें (चित्रा 7): ग्राफ > टर्नेरी प्लॉट का चयन करें। X, प्लॉटिंग के लिए केवल मिश्रण कारकों का चयन करें।
18. प्रक्रिया कारकों पर वितरण की जाँच करने के लिए, > वितरण का विश्लेषण करें का चयन करें और Y, स्तंभों के लिए प्रक्रिया कारक दर्ज करें.
    नोट: फॉर्मूलेशन वैज्ञानिक को सभी रन की व्यवहार्यता की पुष्टि करनी चाहिए। यदि अव्यवहार्य रन मौजूद हैं, तो नई खोजी गई बाधाओं को ध्यान में रखते हुए डिज़ाइन को पुनरारंभ करें।

चित्रा 3: अध्ययन कारक और सीमाएं। प्रयोगात्मक सॉफ्टवेयर के भीतर सेटिंग्स के स्क्रीनशॉट अध्ययन सेटअप को पुन: प्रस्तुत करने के लिए उपयोगी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4: एक अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइन के लिए प्रारंभिक आउटपुट। तालिका की पहली दो पंक्तियों को दिखाते हुए, सेटिंग्स को वांछित परिशुद्धता के लिए गोल करने की आवश्यकता होती है, जबकि यह भी सुनिश्चित करना होता है कि लिपिड मात्रा 1 तक हो। बेंचमार्क मैन्युअल रूप से तालिका में जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 5: प्रारूपित अध्ययन तालिका। कारक स्तरों को गोल और स्वरूपित किया गया है और एक रन आईडी कॉलम जोड़ा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 6: एक त्रिआधारी भूखंड पर डिजाइन बिंदु। 23 फॉर्मूलेशन को संबंधित आयनेबल, हेल्पर और "अन्य" (कोलेस्ट्रॉल + पीईजी) अनुपात के कार्य के रूप में दिखाया गया है। केंद्र में हरा बिंदु आयनेबल (एच 101): कोलेस्ट्रॉल: हेल्पर (डोप) :P ईजी के बेंचमार्क 33: 33: 33: 1 मोलर अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 7: प्रयोग में गैर-मिश्रण प्रक्रिया कारकों का वितरण। हिस्टोग्राम दिखाते हैं कि प्रयोगात्मक रन को आयनित लिपिड प्रकार, एन: पी अनुपात और प्रवाह दर में कैसे स्थान दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. प्रयोग चलाना

1. प्रयोग को डिज़ाइन तालिका द्वारा प्रदान किए गए क्रम में चलाएँ। प्रयोगात्मक तालिका में निर्मित स्तंभों में रीडआउट रिकॉर्ड करें।
2. यदि एक समान फॉर्मूलेशन बैच पर एक ही प्रतिक्रिया के लिए कई परीक्षण किए जाते हैं, तो प्रत्येक बैच के भीतर इन परिणामों के लिए औसत की गणना करें। तालिका में प्रत्येक परख माप के लिए एक कॉलम जोड़ें।
   1. औसत प्राप्त करने के लिए, सभी संबंधित स्तंभों का चयन करें, चयनित स्तंभ शीर्षलेखों में से किसी एक पर राइट-क्लिक करें, और नया सूत्र स्तंभ चुनें > औसत > संयोजित करें. भविष्य के प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए इस औसत स्तंभ का उपयोग करें।
      नोट: नुस्खा को नए सिरे से शुरू किए बिना, बार-बार परख माप केवल परख विचरण को पकड़ते हैं और स्वतंत्र प्रतिकृति का गठन नहीं करते हैं।
3. प्रत्येक प्रकार के मुद्दे के लिए एक नए कॉलम में बाइनरी (0/1) संकेतकों के साथ फॉर्मूलेशन वर्षा या विवो सहनशीलता के मुद्दों ( जैसे गंभीर शरीर के वजन में कमी या मृत्यु) की किसी भी घटना का दस्तावेजीकरण करें।

4. प्रयोगात्मक परिणामों का विश्लेषण

1. रीडिंग को प्लॉट करें और प्रतिक्रियाओं के वितरण की जांच करें: ग्राफ बिल्डर > खोलें और प्रत्येक प्रतिक्रिया को अलग-अलग भूखंडों के लिए वाई क्षेत्र में खींचें। सभी प्रतिक्रियाओं के लिए इसे दोहराएं।
2. रंग-कोडित प्रतिकृति रन के बीच सापेक्ष दूरी की जांच करें, यदि एक को शामिल किया गया था। यह पूरे कारक स्थान (चित्रा 8) में कारक सेटिंग्स में परिवर्तन के कारण परिवर्तनशीलता की तुलना में बेंचमार्क पर कुल (प्रक्रिया और विश्लेषणात्मक) भिन्नता की समझ के लिए अनुमति देता है।
3. निर्धारित करें कि क्या कच्ची प्रतिक्रिया मॉडलिंग की जानी चाहिए या यदि इसके बजाय एक परिवर्तन का उपयोग किया जाना चाहिए। उन प्रतिक्रियाओं के लिए जो सकारात्मक होने तक सीमित हैं, लेकिन ऊपर असहज हैं (जैसे, शक्ति), प्रयोगात्मक परिणामों के लिए एक सामान्य वितरण और एक सामान्य वितरण दोनों को फिट करें। यदि लॉगनॉर्मल वितरण कम एआईसीसी (सही अकाइके के सूचना मानदंड) के साथ बेहतर फिट बैठता है, तो उस प्रतिक्रिया का लॉग परिवर्तन लें।
   1. > वितरण का विश्लेषण करने के लिए नेविगेट करें और Y, स्तंभों के लिए प्रतिक्रिया का चयन करें। परिणामी वितरण रिपोर्ट में, प्रतिक्रिया नाम के बगल में स्थित लाल त्रिकोण पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से निरंतर फिट > फिट सामान्य और निरंतर फिट > फिट लॉगनॉर्मल चुनें। बाद की तुलना वितरण रिपोर्ट में, यह पता लगाने के लिए एआईसीसी मूल्यों की जांच करें कि कौन सा वितरण प्रतिक्रिया को बेहतर ढंग से फिट करता है।
   2. लॉग ट्रांसफ़ॉर्म निष्पादित करने के लिए, प्रतिसाद स्तंभ शीर्षलेख राइट-क्लिक करें और लॉग > लॉग > नया सूत्र स्तंभ चुनें. जब कोई मॉडल बनाया जाता है और लॉग स्केल पर एक पूर्वानुमान स्तंभ सहेजा जाता है, तो लॉग > एक्सप्रेस के > नया फॉर्मूला कॉलम चुनकर प्रतिक्रिया को मूल स्केल पर वापस बदलें।
   3. 0 और 1 के बीच बंधे अनुपात प्रतिक्रियाओं के लिए, एक सामान्य और बीटा वितरण के फिट की तुलना करें। यदि बीटा वितरण में कम एआईसीसी है, तो एक लॉगिन ट्रांसफॉर्म करें। प्रतिक्रिया के लिए वितरण रिपोर्ट में, निरंतर फिट > फिट सामान्य और निरंतर फिट > फिट बीटा चुनें।
      1. लॉगिन ट्रांसफ़ॉर्म के लिए, डेटा तालिका में प्रतिसाद स्तंभ शीर्षलेख राइट-क्लिक करें, और विशेषता > Logit > नया सूत्र स्तंभ चुनें. मॉडल-बिल्डिंग पोस्ट करें, पूर्वानुमान स्तंभ सहेजें. मूल पैमाने पर वापस जाने के लिए, नए सूत्र स्तंभ > विशेषता > लॉजिस्टिक का उपयोग करें।
         नोट: प्रतिगमन-आधारित एसवीईएम विश्लेषण प्रतिक्रिया वितरण में सामान्यता से प्रस्थान के लिए मजबूत है। हालांकि, इन परिवर्तनों से परिणामों की आसान व्याख्या हो सकती है और मॉडल ों का बेहतर फिट हो सकता है।
4. एक त्रिआधारी प्लॉट पर रन को ग्राफ़ करें। प्रतिक्रियाओं के अनुसार बिंदुओं को रंग दें (या परिवर्तन लागू होने पर रूपांतरित प्रतिक्रियाएं): टर्नेरी प्लॉट > खोलें। X, प्लॉटिंग के लिए केवल मिश्रण कारकों का चयन करें। परिणामी ग्राफ़ में से किसी पर राइट-क्लिक करें, पंक्ति लेजेंड का चयन करें और फिर (परिवर्तित) प्रतिक्रिया स्तंभ का चयन करें।
   नोट: प्रतिक्रियाओं के अनुसार बिंदुओं को रंगना मिश्रण कारकों के संबंध में व्यवहार का एक मॉडल-स्वतंत्र दृश्य परिप्रेक्ष्य देता है।
5. स्पेस-फिलिंग डिज़ाइन द्वारा जनरेट की गई मॉडल स्क्रिप्ट हटाएँ।
6. अध्ययन कारकों के एक समारोह के रूप में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए एक स्वतंत्र मॉडल बनाएं, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित चरणों को दोहराएं।
   नोट: द्वितीयक द्विआधारी प्रतिक्रिया (जैसे, सूत्रीकरण विफलता या माउस मृत्यु) के मामले में, इस प्रतिक्रिया को भी मॉडल करें। लक्ष्य वितरण सेटिंग को सामान्य से द्विपद में बदलें.
7. सभी उम्मीदवार प्रभावों से युक्त एक "पूर्ण" मॉडल का निर्माण करें। इस मॉडल में प्रत्येक कारक के मुख्य प्रभाव, दो- और तीन-तरफा इंटरैक्शन, प्रक्रिया कारकों में द्विघात और आंशिक घन शब्द और मिश्रण कारक^23,24 के लिए शेफे क्यूबिक शब्द शामिल होने चाहिए।
   नोट: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए उम्मीदवार प्रभाव के एक ही सेट का उपयोग करें। एसवीईएम मॉडल चयन तकनीक स्वतंत्र रूप से प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए मॉडल को परिष्कृत करेगी, जिसके परिणामस्वरूप संभावित रूप से प्रत्येक के लिए अद्वितीय कम मॉडल होंगे। चित्रा 9 इन उम्मीदवार प्रभावों में से कुछ को दर्शाता है। निम्नलिखित उप-चरण इस प्रक्रिया का विस्तार करते हैं।
   1. > फिट मॉडल का विश्लेषण करें का चयन करें।
   2. सुनिश्चित करें कि ब्लॉकिंग कारक (जैसे, दिन) को अन्य अध्ययन कारकों के साथ बातचीत करने की अनुमति नहीं है। किसी भी ब्लॉकिंग कारक का चयन करें और जोड़ें पर क्लिक करें. बाद के किसी भी उप-चरण में इन कारकों को शामिल न करें।
      नोट: मॉडल में ब्लॉकिंग कारकों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, लेकिन ब्लॉकिंग कारकों को अन्य अध्ययन कारकों के साथ बातचीत करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। कारकों को अवरुद्ध करने का मुख्य उद्देश्य प्रयोग की परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने और प्रयोग की संवेदनशीलता में सुधार करने में मदद करना है।
   3. सभी अध्ययन कारकों पर प्रकाश डालें। डिग्री फ़ील्ड मान को 3 पर संशोधित करें (यह डिफ़ॉल्ट रूप से 2 पर सेट है)। फैक्टोरियल टू डिग्री पर क्लिक करें।
      नोट: इस क्रिया में मुख्य प्रभाव के साथ-साथ मॉडल में दो और तीन-तरफा इंटरैक्शन शामिल हैं।
   4. चयन विंडो में केवल गैर-मिश्रण कारकों का चयन करें। मैक्रोज़ > आंशिक घन क्लिक करें.
      नोट: यह क्रिया निरंतर प्रक्रिया कारकों और मॉडल में अन्य गैर-मिश्रण कारकों के साथ उनकी बातचीत के लिए द्विघात प्रभाव का परिचय देती है।
   5. चयन सूची से केवल मिश्रण कारक चुनें। मैक्रोज़ > Scheffe Cubic क्लिक करें. डिफ़ॉल्ट नो इंटरसेप्ट विकल्प को निष्क्रिय करें ( चित्रा 9 देखें)।
      नोट: लासो विधियों का उपयोग करते समय मॉडल में एक इंटरसेप्ट शामिल करना एक आवश्यक कदम है और आगे चयन संदर्भ में भी सहायक है। पारंपरिक डिफ़ॉल्ट सेटिंग नो इंटरसेप्ट आमतौर पर जगह में होती है क्योंकि एसवीईएम दृष्टिकोण जैसे संशोधनों के बिना, सभी मिश्रण मुख्य प्रभावों के साथ एक इंटरसेप्ट को एक साथ फिट करना, नियमित रूप से कम से कम वर्ग प्रतिगमन प्रक्रिया¹² के साथ संभव नहीं है।
   6. प्रतिसाद स्तंभ निर्दिष्ट करें: प्रतिसाद स्तंभ हाइलाइट करें और Y क्लिक करें.
   7. व्यक्तित्व सेटिंग को सामान्यीकृत प्रतिगमन में बदलें. वितरण को सामान्य पर सेट रखें.
   8. मॉडल विनिर्देश के बगल में स्थित लाल त्रिकोण मेनू पर क्लिक करके और डेटा तालिका में सहेजें का चयन करके अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं के साथ उपयोग के लिए इस मॉडल सेटअप को डेटा तालिका में सहेजें.
8. मिश्रण कारक मुख्य प्रभावों के अनिवार्य समावेश के बिना, कम किए गए मॉडल को फिट करने के लिए एसवीईएम फॉरवर्ड चयन विधि लागू करें, और डेटा तालिका में पूर्वानुमान सूत्र कॉलम संग्रहीत करें।
   1. फ़िट मॉडल संवाद से, चलाएँ क्लिक करें.
   2. अनुमान विधि के लिए, SVEM अग्रेषित चयन का चयन करें।
   3. उन्नत नियंत्रण > बल शर्तें मेनू का विस्तार करें और मिश्रण के मुख्य प्रभावों से संबद्ध बक्सों का चयन न करें. केवल इंटरसेप्ट टर्म बॉक्स चेक रहना चाहिए। चित्रा 10 डिफ़ॉल्ट सेटअप प्रदर्शित करता है जहां मुख्य प्रभाव मजबूर होते हैं। इस चरण के लिए, इन बक्से को अनचेक करने की आवश्यकता है ताकि मॉडल को आगे की चयन प्रक्रिया के आधार पर इन प्रभावों को शामिल करने या बाहर करने की अनुमति मिल सके।
   4. SVEM अग्रेषित चयन प्रक्रिया को चलाने के लिए जाएँ क्लिक करें।
9. एक उचित पूर्वानुमान क्षमता को सत्यापित करने के लिए एसवीईएम मॉडल से अनुमानित प्रतिक्रियाओं द्वारा वास्तविक प्रतिक्रियाओं को प्लॉट करें। (चित्र 11)।  एसवीईएम फॉरवर्ड चयन के बगल में स्थित लाल त्रिकोण पर क्लिक करें और पूर्वानुमानित द्वारा वास्तविक प्लॉट > नैदानिक प्लॉट का चयन करें।
10. SVEM अग्रेषित चयन के बगल में स्थित लाल त्रिभुज क्लिक करें और डेटा तालिका में पूर्वानुमान सूत्र वाला एक नया स्तंभ बनाने के लिए स्तंभ सहेजें > पूर्वानुमान सूत्र सहेजें का चयन करें.
11. वैकल्पिक: एसवीईएम लासो का उपयोग करके अनुमान विधि के रूप में उपरोक्त चरणों को दोहराएं ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि बाद के चरणों को करने के बाद एक अलग इष्टतम नुस्खा सुझाया गया है या नहीं। यदि हां, तो दोनों व्यंजनों को पुष्टिकरण रन (अनुभाग 5 में चर्चा की गई) के रूप में चलाएं, यह देखने के लिए कि अभ्यास¹² में कौन सा सबसे अच्छा प्रदर्शन करता है।
12. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए मॉडल-निर्माण चरणों को दोहराएं।
13. एक बार सभी प्रतिक्रियाओं के लिए पूर्वानुमान स्तंभ डेटा तालिका में सहेजे जाने के बाद, प्रोफाइलर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके सभी अनुमानित प्रतिक्रिया स्तंभों के लिए प्रतिक्रिया निशान ग्राफ़ करें: ग्राफ़ > प्रोफाइलर का चयन करें, और Y, पूर्वानुमान सूत्र के लिए पिछले चरण में बनाए गए सभी पूर्वानुमान स्तंभों का चयन करें , और ठीक (चित्रा 12) पर क्लिक करें।
14. उम्मीदवार इष्टतम सूत्रीकरण की पहचान करें।
    1. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए "वांछनीयता फ़ंक्शन" को परिभाषित करें, यह निर्दिष्ट करते हुए कि क्या प्रतिक्रिया को अधिकतम, कम या लक्ष्य से मिलान किया जाना चाहिए। 1.0 के महत्व वजन का उपयोग करने के लिए किसी भी प्राथमिक प्रतिक्रिया ओं को सेट करें और 0.2 के महत्व वजन का उपयोग करने के लिए किसी भी माध्यमिक प्रतिक्रिया को सेट करें। पूर्वानुमान प्रोफाइलर लाल त्रिकोण मेनू से, अनुकूलन और वांछनीयता > वांछनीयता फ़ंक्शन का चयन करें, फिर अनुकूलन और वांछनीयता > वांछनीयता सेट करें। बाद की विंडो में सेटिंग्स दर्ज करें।
       नोट: महत्वपूर्ण भार सापेक्ष और व्यक्तिपरक हैं, इसलिए यह एक उचित सीमा के भीतर इन भारों में परिवर्तन के लिए संयुक्त इष्टतम की संवेदनशीलता की जांच करने के लायक है (उदाहरण के लिए, समान भार से 1: 5 भार तक)।
    2. वांछनीयता फ़ंक्शन को अधिकतम करने वाली इष्टतम कारक सेटिंग्स खोजने के लिए प्रोफाइलर को कमांड करें (चित्रा 12): प्रोफाइलर से, अनुकूलन और वांछनीयता का चयन करें > वांछनीयता को अधिकतम करें।
       नोट: इष्टतम उम्मीदवारों पर प्रतिक्रियाओं के अनुमानित मूल्य शक्ति जैसे सही-विषम प्रतिक्रियाओं के मूल्य को अधिक महत्व दे सकते हैं; हालांकि, पुष्टिकरण रन इन उम्मीदवार योगों के अधिक सटीक अवलोकन प्रदान करेगा। मुख्य उद्देश्य इष्टतम सूत्रीकरण (इष्टतम नुस्खा की सेटिंग्स) का पता लगाना है।
    3. इष्टतम कारक सेटिंग्स रिकॉर्ड करें और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले महत्वपूर्ण भार को नोट करें: पूर्वानुमान प्रोफाइलर मेनू से, कारक सेटिंग्स > याद रखें सेटिंग्स का चयन करें।
15. वैकल्पिक: आयनीय लिपिड प्रकार जैसे श्रेणीबद्ध कारकों के लिए, प्रत्येक कारक स्तर के लिए सशर्त रूप से इष्टतम योगों का पता लगाएं।
    1. सबसे पहले प्रोफाइलर में कारक का वांछित स्तर सेट करें, फिर Ctrl कुंजी रखें और उस कारक के ग्राफ के अंदर बाएं-क्लिक करें और लॉक फैक्टर सेटिंग का चयन करें। अनुकूलन और वांछनीयता का चयन करें > अपनी वर्तमान सेटिंग पर लॉक किए गए इस कारक के साथ सशर्त इष्टतम खोजने के लिए वांछनीयता को अधिकतम करें।
    2. आगे बढ़ने से पहले कारक सेटिंग्स को अनलॉक करें, कारक सेटिंग्स को लॉक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी मेनू का उपयोग करें।
16. प्रतिक्रियाओं के महत्व भार को समायोजित करने के बाद अनुकूलन प्रक्रिया को दोहराएं ( अनुकूलन और वांछनीयता > निर्धारित वांछनीयता का उपयोग करके), शायद केवल प्राथमिक प्रतिक्रिया (ओं) को अनुकूलित करना या कुछ माध्यमिक प्रतिक्रियाओं को अधिक या कम महत्व वजन के लिए सेट करना, या माध्यमिक प्रतिक्रियाओं का लक्ष्य निर्धारित करना (चित्रा 13)।
17. नए इष्टतम उम्मीदवार को रिकॉर्ड करें ( पूर्वानुमान प्रोफाइलर मेनू से, कारक सेटिंग्स > याद रखें सेटिंग्स का चयन करें.)
18. कारक स्थान के इष्टतम क्षेत्रों के ग्राफिकल सारांश तैयार करें: अनुमत कारक स्थान के भीतर यादृच्छिक रूप से उत्पन्न कारक सेटिंग्स के साथ आबादी वाली 50,000 पंक्तियों के साथ एक डेटा तालिका उत्पन्न करें, साथ ही प्रत्येक प्रतिक्रिया और संयुक्त वांछनीयता फ़ंक्शन के लिए कम मॉडल से संबंधित अनुमानित मानों के साथ।
    1. प्रोफाइलर में, आउटपुट रैंडम तालिका का चयन करें। अनुकरण करने के लिए कितने रन सेट करें? 50,000 तक और ठीक पर क्लिक करें।
       नोट: यह 50,000 योगों में से प्रत्येक पर प्रतिक्रियाओं के अनुमानित मूल्यों के साथ एक नई तालिका उत्पन्न करता है। वांछनीयता स्तंभ आउटपुट रैंडम टेबल विकल्प का चयन करते समय होने वाली प्रतिक्रियाओं के लिए महत्व भार पर निर्भर करता है।
    2. नई बनाई गई तालिका में, एक नया कॉलम जोड़ें जो वांछनीयता कॉलम के प्रतिशत की गणना करता है। कच्चे वांछनीयता कॉलम के बजाय टर्नेरी प्लॉट में इस प्रतिशत कॉलम का उपयोग करें। वांछनीयता स्तंभ शीर्षलेख राइट-क्लिक करें और एक नया संचयी प्रायिकता [वांछनीयता] स्तंभ बनाने के लिए वितरण> संचयी संभाव्यता > नया सूत्र स्तंभ चुनें.
    3. निम्न चरणों में वर्णित ग्राफ़िक्स जनरेट करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए और संचयी संभाव्यता [वांछनीयता] कॉलम के लिए भविष्यवाणियों को प्रदर्शित करने के लिए ग्राफिक्स की रंग योजना को बार-बार बदलें।
    4. चार लिपिड कारकों के लिए त्रिआधारी भूखंडों का निर्माण करें। तालिका में, ग्राफ़ > टर्नेरी प्लॉट पर नेविगेट करें, एक्स, प्लॉटिंग के लिए मिश्रण कारकों का चयन करें और ओके पर क्लिक करें। परिणामी ग्राफ़ में से किसी एक में राइट-क्लिक करें, पंक्ति लेजेंड का चयन करें, और तब अनुमानित प्रतिक्रिया स्तंभ का चयन करें। रंग ड्रॉपडाउन को जेट में बदलें।
       नोट: यह लिपिड कारकों के संबंध में सबसे अच्छा और सबसे खराब प्रदर्शन करने वाले क्षेत्रों को प्रदर्शित करता है। चित्र 14 संयुक्त वांछनीयता के प्रतिशत को दर्शाता है जब शक्ति (महत्व = 1) को अधिकतम करने और आकार (महत्व = 0.2) को कम करने पर विचार किया जाता है, जबकि किसी भी कारक पर औसत होता है जो त्रिगुट भूखंड अक्षों पर नहीं दिखाया जाता है। चित्र 15 कच्चे अनुमानित आकार को दर्शाता है। इन ग्राफ़ को अन्य कारकों पर सशर्त रूप से तोड़ना भी उचित है, जैसे कि स्थानीय डेटा फ़िल्टर के साथ प्रत्येक आयनीय लिपिड प्रकार के लिए टर्नेरी प्लॉट का एक अलग सेट बनाना ( टर्नेरी प्लॉट के बगल में लाल त्रिकोण मेनू से उपलब्ध)।
    5. इसी तरह, ग्राफ > ग्राफ बिल्डर का उपयोग गैर-मिश्रण प्रक्रिया कारकों के खिलाफ 50,000 रंग-कोडित बिंदुओं (अद्वितीय योगों का प्रतिनिधित्व करने वाले) को प्लॉट करने के लिए करें, या तो व्यक्तिगत रूप से या संयुक्त रूप से, और प्रतिक्रिया (ओं) और कारक (ओं) के बीच संबंधों की खोज करें। उन कारक सेटिंग्स की तलाश करें जो उच्चतम वांछनीयता उत्पन्न करती हैं। ग्राफिक्स में कारकों के विभिन्न संयोजनों का अन्वेषण करें।
       नोट: ग्राफ़ को रंगते समय, संचयी संभाव्यता [वांछनीयता] का उपयोग करें, लेकिन प्रक्रिया कारकों के खिलाफ ऊर्ध्वाधर अक्ष पर वांछनीयता को प्लॉट करते समय कच्चे वांछनीयता कॉलम का उपयोग करें। वांछनीयता कॉलम को मल्टीवेरिएट अन्वेषण के लिए दो अन्य प्रक्रिया कारकों के साथ ग्राफ > स्कैटरप्लॉट 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन की धुरी पर भी रखा जा सकता है। चित्र 16 उन सभी योगों की संयुक्त वांछनीयता को दर्शाता है जो तीन आयनीय लिपिड प्रकारों में से प्रत्येक के साथ बन सकते हैं। सबसे वांछनीय फॉर्मूलेशन एच 102 का उपयोग करते हैं, जिसमें एच 101 कुछ संभावित प्रतिस्पर्धी विकल्प प्रदान करता है।
    6. प्रोफाइलर और उसकी याद की गई सेटिंग्स को वापस डेटा तालिका में सहेजें। प्रोफाइलर के बगल में स्थित लाल त्रिकोण पर क्लिक करें और स्क्रिप्ट > डेटा तालिका में सहेजें का चयन करें ...।

चित्रा 8: प्रयोग से शक्ति रीडिंग का अवलोकन किया। अंक 23 रनों से देखे गए शक्ति मूल्यों को दर्शाते हैं; दोहराए गए बेंचमार्क रन हरे रंग में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 9: विश्लेषण शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर संवाद। उम्मीदवार प्रभाव ों को लक्ष्य शक्ति प्रतिक्रिया के साथ दर्ज किया गया है, और नो इंटरसेप्ट विकल्प को अनियंत्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 10. SVEM विकल्प निर्दिष्ट करने के लिए अतिरिक्त संवाद. डिफ़ॉल्ट रूप से, लिपिड मुख्य प्रभाव मॉडल में मजबूर होते हैं। चूंकि एक इंटरसेप्ट शामिल है, इसलिए हम प्रभावों को मजबूर न करने के लिए इन बक्से को अनचेक करने की सलाह देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 11: अनुमानित साजिश द्वारा वास्तविक। यह आंकड़ा एसवीईएम मॉडल द्वारा प्रत्येक फॉर्मूलेशन के लिए अनुमानित मूल्य के खिलाफ देखी गई शक्ति को दर्शाता है। सहसंबंध को उतना मजबूत नहीं होना चाहिए जितना कि इस उदाहरण में है, लेकिन उम्मीद कम से कम एक मध्यम सहसंबंध देखने और आउटलायर्स की जांच करने की है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 12: पूर्वानुमान प्रोफाइलर। ग्राफ़ की शीर्ष दो पंक्तियाँ इष्टतम सूत्रीकरण पर अनुमानित प्रतिक्रिया फ़ंक्शन के स्लाइस दिखाती हैं (जैसा कि एसवीईएम दृष्टिकोण द्वारा पहचाना गया है)। ग्राफ़ की निचली पंक्ति सूत्रीकरण की भारित "वांछनीयता" को दर्शाती है, जो ग्राफ़ के अंतिम कॉलम का एक कार्य है जो दर्शाता है कि शक्ति को अधिकतम किया जाना चाहिए, और आकार को कम किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 13: एसवीईएम-फॉरवर्ड चयन से तीन इष्टतम फॉर्मूलेशन उम्मीदवार। प्रतिक्रियाओं के सापेक्ष महत्व भार को बदलने से विभिन्न इष्टतम फॉर्मूलेशन हो सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 14: वांछनीयता के प्रतिशत के लिए टर्नेरी प्लॉट। प्लॉट वांछनीयता के प्रतिशत द्वारा कोडित 50,000 फॉर्मूलेशन रंग दिखाता है, जहां वांछनीयता को अधिकतम करने के लिए 1.0 और आकार को कम करने के लिए 0.2 के महत्व वजन के साथ निर्धारित किया जाता है, इन भूखंडों से पता चलता है कि फॉर्मूलेशन के इष्टतम क्षेत्र में आयनयोग्य लिपिड के कम प्रतिशत और पीईजी के उच्च प्रतिशत शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 15: अनुमानित आकार के लिए त्रिआधारी प्लॉट। कथानक 50,000 योगों में से प्रत्येक के लिए एसवीईएम मॉडल से आकार की भविष्यवाणियों को दर्शाता है। सहायक लिपिड के उच्च प्रतिशत के साथ आकार को कम किया जाता है और सहायक के कम प्रतिशत के साथ अधिकतम किया जाता है। चूंकि अन्य कारक 50,000 प्लॉट किए गए फॉर्मूलेशन में स्वतंत्र रूप से भिन्न होते हैं, इसका अर्थ है कि यह संबंध अन्य कारकों (पीईजी, प्रवाह दर, आदि) की सीमाओं में रहता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 16: तीन अलग-अलग आयनीय लिपिड प्रकारों से जुड़े योगों की वांछनीयता के लिए वायलिन प्लॉट। 50,000 बिंदुओं में से प्रत्येक अनुमत कारक स्थान से एक अद्वितीय सूत्रीकरण का प्रतिनिधित्व करता है। इन वितरणों की चोटियां वांछनीयता के अधिकतम मूल्य हैं जिनकी गणना भविष्यवाणी प्रोफाइलर के साथ विश्लेषणात्मक रूप से की जाती है। H102 में सबसे बड़ा शिखर है और इस प्रकार इष्टतम सूत्रीकरण का उत्पादन करता है। इस आउटपुट को उत्पन्न करने वाले मॉडल के निर्माण के लिए एसवीईएम दृष्टिकोण स्वचालित रूप से सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन कारकों को फ़िल्टर करता है: इस ग्राफ का उद्देश्य कारक स्तरों में व्यावहारिक महत्व पर विचार करना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. पुष्टिकरण चलता है

1. पहले पहचाने गए इष्टतम उम्मीदवारों को सूचीबद्ध करने वाली एक तालिका तैयार करें (चित्रा 17)।
   नोट: चित्रा 17 में वास्तविक शक्ति और सच्चे आकार के मान सिम्युलेटेड जनरेटिंग फ़ंक्शंस का उपयोग करके भरे जाते हैं: व्यवहार में, इन्हें इन व्यंजनों के प्रदर्शन को तैयार करके और फिर मापकर प्राप्त किया जाएगा।
   1. उम्मीदवार रन के सेट के साथ बेंचमार्क नियंत्रण शामिल करें जिसे तैयार और मापा जाएगा।
   2. यदि प्रयोग के किसी भी फॉर्मूलेशन को वांछनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए पाया गया, तो शायद बेंचमार्क से बेहतर प्रदर्शन करके, उम्मीदवार तालिका में जोड़ने और नए फॉर्मूलेशन के साथ पुन: परीक्षण करने के लिए सर्वश्रेष्ठ का चयन करें।
      नोट: या तो मैन्युअल रूप से उम्मीदवार तालिका में वांछित रन जोड़ें या प्रोफाइलर विंडो की याद रखी गई सेटिंग्स का उपयोग करें यदि ये रन पिछले प्रयोग से हैं। रन की पंक्ति संख्या की पहचान करें, पूर्वानुमान प्रोफाइलर > फैक्टर सेटिंग्स पर नेविगेट करें > पंक्ति में डेटा सेट करें, और पंक्ति संख्या इनपुट करें। फिर, पूर्वानुमान प्रोफाइलर > फैक्टर सेटिंग्स चुनें > सेटिंग्स याद रखें और उचित रूप से लेबल करें (उदाहरण के लिए, "बेंचमार्क" या "पिछले प्रयोग से सबसे अच्छा रन")।
   3. प्रोफाइलर में याद की गई सेटिंग्स तालिका पर राइट-क्लिक करें और डेटा तालिका में मेक करें का चयन करें।
      नोट: अध्ययन की प्राथमिकता और बजट के आधार पर, प्रत्येक पुष्टिकरण रन के लिए प्रतिकृति चलाने पर विचार करें, खासकर यदि बेंचमार्क को प्रतिस्थापित किया जाए। रैंकिंग के लिए औसत परिणाम का उपयोग करके, प्रत्येक फॉर्मूलेशन को दो बार बनाएं और विश्लेषण करें। दो प्रतिकृतियों में एक विस्तृत प्रतिक्रिया सीमा वाले किसी भी उम्मीदवार पर ध्यान दें क्योंकि यह उच्च प्रक्रिया विचरण का संकेत दे सकता है।
   4. यदि बजट की कमी के कारण आवश्यक हो, तो प्रयोगात्मक बजट से मेल खाने या अनावश्यक उम्मीदवारों को खत्म करने के लिए पहचाने गए उम्मीदवारों में से डाउनसेलेक्ट करें।
2. पुष्टिकरण रन निष्पादित करें. फॉर्मूलेशन का निर्माण करें और रीडआउट इकट्ठा करें।
3. बेंचमार्क या अन्य दोहराए गए व्यंजनों के लिए मूल प्रयोग के परिणामों और पुष्टिकरण बैच के परिणामों के बीच स्थिरता की जांच करें। यदि कोई बड़ा और अप्रत्याशित बदलाव होता है, तो विचार करें कि शिफ्ट में क्या योगदान हो सकता है और यदि यह संभव है कि पुष्टिकरण बैच के सभी रन प्रभावित हुए थे।
4. उम्मीदवार के इष्टतम योगों के प्रदर्शन की तुलना करें। अन्वेषण करें कि क्या किसी नए उम्मीदवारों ने बेंचमार्क से बेहतर प्रदर्शन किया है।
5. वैकल्पिक: प्रयोगात्मक तालिका में पुष्टिकरण रन के परिणाम जोड़ें और अनुभाग 4 में विश्लेषण को फिर से चलाएं।
   नोट: वर्कफ़्लो का अगला चरण वांछित होने पर इन रनों के साथ अनुवर्ती अध्ययन बनाने के लिए निर्देश प्रदान करता है।

चित्रा 17: दस इष्टतम उम्मीदवारों की तालिका को पुष्टि करण के रूप में चलाया जाना है। ट्रू पोटेंसी और ट्रू साइज सिमुलेशन जेनरेटिंग फ़ंक्शंस (बिना किसी अतिरिक्त प्रक्रिया या विश्लेषणात्मक भिन्नता के) से भरे गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. वैकल्पिक: पुष्टि करण के साथ समवर्ती रूप से चलाए जाने वाले अनुवर्ती अध्ययन को डिजाइन करना।

1. निम्नलिखित मानदंडों पर विचार करते हुए अनुवर्ती अध्ययन की आवश्यकता का आकलन करें:
   1. निर्धारित करें कि क्या इष्टतम सूत्रीकरण कारक सीमाओं में से एक के साथ निहित है और यदि कारक श्रेणियों में से कम से कम एक का विस्तार करने के लिए दूसरा प्रयोग वांछित है।
   2. मूल्यांकन करें कि क्या प्रारंभिक प्रयोग ने अपेक्षाकृत छोटे रन आकार या अपेक्षाकृत बड़े कारक श्रेणियों का उपयोग किया है और यदि अतिरिक्त रन और अद्यतन विश्लेषण के साथ पहचाने गए इष्टतम क्षेत्र पर "ज़ूम इन" करने की आवश्यकता है।
   3. जांचें कि क्या कोई अतिरिक्त कारक पेश किया जा रहा है। यह एक श्रेणीबद्ध कारक का स्तर हो सकता है जैसे कि एक अतिरिक्त आयनीय लिपिड या एक कारक जो प्रारंभिक अध्ययन में स्थिर रहा, उदाहरण के लिए, बफर एकाग्रता।
   4. यदि उपरोक्त शर्तों में से कोई भी पूरा नहीं होता है, तो चरण 7 पर आगे बढ़ें।
2. पुष्टिकरण रन के साथ-साथ किए जाने वाले अतिरिक्त प्रयोगात्मक रन के लिए तैयार रहें।
   1. प्रारंभिक अध्ययन से क्षेत्र के साथ आंशिक ओवरलैप सुनिश्चित करने वाली कारक सीमाओं को परिभाषित करें। यदि कोई ओवरलैप मौजूद नहीं है, तो एक नया अध्ययन तैयार किया जाना चाहिए।
   2. एक अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइन के साथ नए प्रयोगात्मक रन विकसित करें। अंतरिक्ष भरने के डिजाइन > डीओई > विशेष उद्देश्य का चयन करें।
      नोट: उन्नत उपयोगकर्ताओं के लिए, डीओई > कस्टम डिज़ाइन के माध्यम से डी-इष्टतम डिज़ाइन पर विचार करें।
   3. स्पेस-फिलिंग रन उत्पन्न होने के बाद, मैन्युअल रूप से मूल प्रयोग से दो या तीन रन शामिल करें जो नए कारक स्थान के भीतर स्थित हैं। पंक्तियों को जोड़ने के लिए अनुभाग 2 में वर्णित चरणों का उपयोग करके प्रयोगात्मक तालिका के भीतर यादृच्छिक रूप से इन रन वितरित करें और फिर पंक्ति क्रम को यादृच्छिक करें।
      नोट: इनका उपयोग ब्लॉकों के बीच प्रतिक्रिया साधनों में किसी भी बदलाव का अनुमान लगाने के लिए किया जाएगा।
   4. कन्सेटेशन रन करता है और नया स्पेस-फिलिंग एक ही टेबल में चलता है और रन ऑर्डर को यादृच्छिक करता है। तालिकाओं > कॉन्केटेनेट का उपयोग करें और फिर रन ऑर्डर को यादृच्छिक बनाने के लिए एक नया यादृच्छिक कॉलम बनाएं और सॉर्ट करें, जैसा कि अनुभाग 2 में वर्णित है।
3. नए व्यंजनों को तैयार करें और परिणाम एकत्र करें।
4. प्रत्येक परिणाम के स्रोत को इंगित करने के लिए एक प्रयोग-आईडी कॉलम पेश करते हुए, मूल प्रयोग डेटा तालिका में नए प्रयोगात्मक रन और परिणामों को शामिल करें। तालिकाओं > Concateate का उपयोग करें और स्रोत स्तंभ बनाने के लिए विकल्प का चयन करें।
5. सत्यापित करें कि प्रत्येक कारक के लिए स्तंभ गुण दोनों अध्ययनों पर संयुक्त श्रेणी प्रदर्शित करते हैं: प्रत्येक कारक के लिए कॉलम हेडर पर राइट क्लिक करें और यदि मौजूद हो तो कोडिंग और मिश्रण गुण श्रेणियों की जांच करें।
6. नए प्रयोग के परिणामों का विश्लेषण शुरू करें।
   1. ब्लॉकिंग कारक के रूप में सेवा करने के लिए मॉडल में एक शब्द के रूप में प्रयोग-आईडी कॉलम शामिल करें। सुनिश्चित करें कि यह शब्द अध्ययन कारकों के साथ बातचीत नहीं करता है। अनुभाग 4 में तालिका में सहेजी गई फ़िट मॉडल संवाद स्क्रिप्ट चलाएँ, प्रयोग-ID स्तंभ का चयन करें और इसे उम्मीदवार प्रभावों की सूची में शामिल करने के लिए जोड़ें क्लिक करें.
   2. नए प्रयोग और प्रारंभिक अध्ययन के परिणामों का संयुक्त रूप से विश्लेषण करने के लिए कॉन्केटेनेटेड डेटा तालिका पर इस फिट मॉडल संवाद को चलाएं। अद्यतन इष्टतम सूत्रीकरण उम्मीदवारों और ग्राफिकल सारांश उत्पन्न करने के लिए पिछले निर्देशों का पालन करें।
   3. सत्यापन के लिए, स्वतंत्र रूप से नए प्रयोग के परिणामों का विश्लेषण करें, प्रारंभिक प्रयोग के परिणामों को छोड़कर। यही है, नई प्रयोगात्मक तालिका पर अनुभाग 4 में वर्णित चरणों का पालन करें।
   4. सुनिश्चित करें कि इन मॉडलों द्वारा पहचाने गए इष्टतम फॉर्मूलेशन संयुक्त विश्लेषण द्वारा मान्यता प्राप्त लोगों के साथ निकटता से संरेखित हैं।
   5. यह पुष्टि करने के लिए ग्राफिकल सारांश ों की समीक्षा करें कि नए प्रयोगात्मक परिणामों के संयुक्त और व्यक्तिगत विश्लेषण दोनों समान प्रतिक्रिया सतह व्यवहार प्रदर्शित करते हैं (जिसका अर्थ है कि प्रतिक्रिया (ओं) और कारकों के बीच एक समान संबंध है)।
   6. स्थिरता के लिए प्रारंभिक प्रयोग के साथ नए परिणामों के संयुक्त और व्यक्तिगत विश्लेषण की तुलना करें। तुलना के लिए समान ग्राफ संरचनाओं का उपयोग करें और मतभेदों के लिए पहचाने गए इष्टतम व्यंजनों की जांच करें।

7. अध्ययन के अंतिम वैज्ञानिक निष्कर्षों का दस्तावेजीकरण

1. क्या अध्ययन के कारण बेंचमार्क नियंत्रण एक नए पहचाने गए नुस्खा में बदल जाता है, नई सेटिंग लॉग करें और डिजाइन और विश्लेषण फ़ाइलों को निर्दिष्ट करें जो इसकी उत्पत्ति को रिकॉर्ड करते हैं।
2. भविष्य के संदर्भ के लिए सभी प्रयोगात्मक तालिकाओं और विश्लेषण सारांशों को बनाए रखें, अधिमानतः तिथि-मुद्रित फ़ाइल नामों के साथ।

इस दृष्टिकोण को मोटे तौर पर वर्गीकृत लिपिड प्रकारों में मान्य किया गया है: एमसी 3 जैसे शास्त्रीय लिपिड और लिपिडोइड (जैसे, सी 12-200), आमतौर पर मिश्रित रसायन विज्ञान से प्राप्त। वन फैक्टर एट ए टाइम (ओएफएटी) विधि का उपयोग करके विकसित बेंचमार्क एलएनपी फॉर्मूलेशन की तुलना में, हमारे वर्कफ़्लो के माध्यम से उत्पन्न उम्मीदवार फॉर्मूलेशन अक्सर लघुगणकीय पैमाने पर 4- से 5-गुना की शक्ति सुधार प्रदर्शित करते हैं, जैसा कि चित्र 18 में माउस लिवर ल्यूसिफेरस रीडिंग में दिखाया गया है। तालिका 1 दो अनुकूलन चरणों (एक प्रारंभिक अध्ययन और बाद में अनुवर्ती अध्ययन) में बेंचमार्क नियंत्रण प्रदर्शन पर देखे गए माउस लिवर ल्यूसिफेरस अभिव्यक्ति में संबंधित वृद्धि को दर्शाती है। पहले चरण में, अन्य कारकों को स्थिर रखते हुए लिपिड अनुपात को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित किया गया था। अनुवर्ती अध्ययन में, एक अतिरिक्त सहायक लिपिड प्रकार पेश किया गया था और लिपिड अनुपात संरचना और सहायक लिपिड प्रकार दोनों पर विचार करते हुए अनुकूलन किया गया था। नतीजतन, नए पेश किए गए हेल्पर लिपिड प्रकार को संबंधित अनुकूलित लिपिड संरचना के साथ उपयोग करने के लिए चुना गया था। शक्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है कि ये अनुकूलित रचनाएं बेहतर एंडोसोमल एस्केप^{क्षमताओं का} प्रदर्शन कर सकती हैं।

सिमुलेशन का उपयोग इस प्रक्रिया द्वारा उत्पादित इष्टतम उम्मीदवार की अपेक्षित गुणवत्ता दिखाने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उदाहरण प्रयोग के ढांचे के भीतर, हम विभिन्न रन आकारों के लिए सिमुलेशन को कई बार दोहरा सकते हैं और सिम्युलेटेड प्रक्रिया-जनरेटिंग फ़ंक्शन के अनुसार परिणामों का मूल्यांकन कर सकते हैं। इस उद्देश्य के लिए एक जेएमपी स्क्रिप्ट पूरक फ़ाइल 4 में प्रदान की गई है। विशेष रूप से, एक अंतरिक्ष भरने वाला डिज़ाइन उत्पन्न किया गया था और प्रतिक्रिया कॉलम हमारे जनरेटर कार्यों के मूल्यों के साथ आबाद थे, साथ ही विश्लेषणात्मक और प्रक्रिया भिन्नता का प्रतिनिधित्व करने वाला शोर। हम इन सिम्युलेटेड प्रतिक्रियाओं को विभिन्न विश्लेषण तकनीकों (एसवीईएम फॉरवर्ड चयन सहित) के साथ फिट करते हैं ताकि संबंधित उम्मीदवार इष्टतम नुस्खा तैयार किया जा सके। प्रत्येक विश्लेषण विधि के उम्मीदवारों की तुलना तब उत्पन्न करने वाले कार्यों से सही इष्टतम के मूल्य से की जाती है। चित्रा 19 क्षैतिज अक्ष पर दिए गए आकार के अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइनों का उपयोग करके तीन विश्लेषण विधियों में से प्रत्येक द्वारा प्राप्त अधिकतम सैद्धांतिक प्रतिक्रिया के औसत प्रतिशत को दर्शाता है। पूर्ण मॉडल, जिसमें सभी उम्मीदवार प्रभाव शामिल हैं और उन प्रभावों के सांख्यिकीय महत्व के आधार पर मॉडल को कम नहीं करता है, सबसे खराब प्रदर्शन करता है। मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों के लिए पारंपरिक रूप से प्रतिगमन मॉडल को फिट करने में जाने वाले अधिकांश अतिरिक्त काम में संशोधन शामिल हैं (इंटरसेप्ट को हटाना, मिश्रण के मुख्य प्रभावों को मजबूर करना, शुद्ध द्विघात मिश्रण प्रभाव ों के उपयोग को रोकना, आदि) जो इस पूर्ण मॉडल⁹ को फिट करने के लिए आवश्यक हैं, और इस परिप्रेक्ष्य से, वे^{प्रक्रियाएं अनावश्यक हैं}।. इसके अलावा, यह मॉडल तब तक फिट नहीं हो सकता जब तक कि डिजाइन का आकार मॉडल में प्रभावों की संख्या तक नहीं पहुंच जाता। छोटे प्रयोगात्मक आकारों में, हम पारंपरिक फॉरवर्ड चयन विधि को फिट कर सकते हैं, जो प्रत्येक निश्चित प्रयोगात्मक आकार के लिए इष्टतम उम्मीदवार सूत्रीकरण के औसत प्रदर्शन के संबंध में पूर्ण मॉडल से बेहतर प्रदर्शन करता है। इसी तरह, इस फॉरवर्ड चयन दृष्टिकोण में एसवीईएम संशोधन इष्टतम उम्मीदवारों के प्रदर्शन में और सुधार करता है। इस कथानक से पता चलता है कि 24-रन स्पेस-फिलिंग प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए एसवीईएम-फॉरवर्ड चयन^12,13 का उपयोग करने से एक ही औसत गुणवत्ता प्राप्त होती है, जिसे आमतौर पर पारंपरिक फॉरवर्ड चयन (न्यूनतम एआईसीसी को लक्षित करते हुए) मॉडल के साथ विश्लेषण करने पर 50 रन की आवश्यकता होती है। यद्यपि वास्तविक प्रदर्शन प्रक्रिया से प्रक्रिया में भिन्न होगा, यह सिमुलेशन - एसवीईएम 12,13,16,17,26 पर प्रकाशित परिणामों के साथ- सूत्रीकरण अनुकूलन के लिए इस मॉडलिंग प्रक्रिया की क्षमता को दर्शाता है।

चित्रा 18: प्रयोग के दो दौर के बाद यकृत लूसिफेरस अभिव्यक्ति में सुधार। राउंड 0 बेंचमार्क फॉर्मूलेशन के लिए लिवर ल्यूसिफेरस रीडिंग दिखाता है; राउंड 1 पहले प्रयोग के बाद यकृत ल्यूसिफेरस रीडिंग को दर्शाता है जो एलएनपी घटक लिपिड मोलर अनुपात को अनुकूलित करता है; राउंड 2 दूसरे प्रयोग के बाद यकृत ल्यूसिफेरस रीडिंग को दर्शाता है जो एक अतिरिक्त सहायक लिपिड प्रकार पर विचार करते हुए घटक दाढ़ अनुपात को और अनुकूलित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 19: प्रयोगात्मक आकार और सांख्यिकीय मॉडल के कार्य के रूप में इष्टतम सूत्रीकरण की गुणवत्ता। ऊर्ध्वाधर अक्ष सैद्धांतिक अधिकतम वांछनीयता के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, और क्षैतिज अक्ष अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइन के आकार का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक बिंदु 150 से अधिक सिमुलेशन दिखाता है। ब्लू लाइन (त्रिकोण) पूर्ण मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है (सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन प्रभावों के किसी भी उन्मूलन के बिना), एम्बर (सर्कल) लाइन पारंपरिक एआईसीसी-आधारित फॉरवर्ड चयन मॉडल (एक इंटरसेप्ट के साथ और मिश्रण के मुख्य प्रभावों को मजबूर किए बिना) का प्रतिनिधित्व करती है, और हरी रेखा (उल्टा त्रिकोण) एसवीईएम-आधारित फॉरवर्ड चयन मॉडल (एक इंटरसेप्ट के साथ और मिश्रण के मुख्य प्रभावों को मजबूर किए बिना) का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: प्रयोग के डिजाइन (डीओई) अनुकूलन के माध्यम से ल्यूसिफेरस अभिव्यक्ति में व्यवस्थित सुधार। यह तालिका प्रारंभिक बेंचमार्क से अंतिम "इष्टतम उम्मीदवार" तक, फोटॉन / सेकंड स्केल पर 10,000 गुना सुधार के साथ ल्यूसिफेरस की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि को दर्शाती है।

पूरक फ़ाइल 1: 04APR2023 सारांश.docx - यह दस्तावेज़ अध्ययन का एक रिकॉर्ड प्रदान करता है जिसमें इसका उद्देश्य, मूल्यांकन की गई प्रतिक्रियाएं, विचार किए गए कारक और निष्पादित रनों की कुल संख्या शामिल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - सिम्युलेटेड प्रयोग और इसके परिणामों के साथ एक JMP फ़ाइल। इस फ़ाइल में JMP 17 Pro के साथ संगत अनुलग्न विश्लेषण स्क्रिप्ट भी शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - एक एक्सेल फ़ाइल जिसमें सिम्युलेटेड प्रयोग और इसके परिणाम शामिल हैं, उन पाठकों के लिए उपयुक्त हैं जिनके पास जेएमपी तक पहुंच नहीं हो सकती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: मिश्रण सिमुलेशन 20DEC22.jsl - यह एक JMP 17 प्रो स्क्रिप्ट है जिसका उपयोग LNP सूत्रीकरण प्रयोगों को अनुकरण करने और विभिन्न विश्लेषण विधियों के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। स्क्रिप्ट SVEM-फॉरवर्ड चयन (कोई इंटरसेप्ट नहीं) दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जो इस वर्कफ़्लो में उपयोग की जाने वाली प्रमुख विश्लेषण विधि है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मिश्रण-प्रक्रिया प्रयोगों के डिजाइन और विश्लेषण के लिए आधुनिक सॉफ्टवेयर वैज्ञानिकों के लिए एक संरचित वर्कफ़्लो में अपने लिपिड नैनोपार्टिकल योगों में सुधार करना संभव बनाता है जो अक्षम ओएफएटी प्रयोग से बचता है। हाल ही में विकसित एसवीईएम मॉडलिंग दृष्टिकोण कई आर्केन प्रतिगमन संशोधनों और मॉडल कमी रणनीतियों को समाप्त करता है जो पहले वैज्ञानिकों को बाहरी सांख्यिकीय विचारों से विचलित कर सकते थे। एक बार परिणाम एकत्र होने के बाद, एसवीईएम विश्लेषण ढांचा एक दृष्टिकोण प्रदान करता है जो लागू करना आसान है और पारंपरिक मॉडलिंग दृष्टिकोण¹³ की तुलना में बेहतर मॉडल का उत्पादन करता है। इसके अलावा, ग्राफिकल विश्लेषण जो प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पूर्वानुमान सूत्रों पर आधारित होते हैं, वैज्ञानिकों द्वारा आसानी से व्याख्या योग्य होते हैं, जो प्रतिगमन मॉडल से अत्यधिक सहसंबद्ध पैरामीटर अनुमानों की व्याख्या की आवश्यकता के बिना व्यक्तिगत कारकों के साथ-साथ कारकों के छोटे समूहों पर प्रतिक्रिया के सीमांत व्यवहार का स्पष्ट सारांश देते हैं। यह वैज्ञानिकों को अध्ययन कारकों में व्यावहारिक महत्व का आकलन करने पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है क्योंकि एसवीईएम ने स्वचालित रूप से सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन प्रभावों को हटा दिया है।

वर्कफ़्लो का उपयोग व्यवहार में लिपिड संरचना और फॉर्मूलेशन मापदंडों जैसे एन / पी अनुपात, प्रवाह दर और अनुकूलन के लिए मिश्रण अनुपात को व्यवस्थित रूप से भिन्न करने और सर्वोत्तम सहायक लिपिड प्रकार, आयनीय लिपिड प्रकार और बफर प्रकार का चयन करने के लिए किया गया है। इन उदाहरणों के लक्ष्यों में आमतौर पर विवो या इन विट्रो क्षमता को अधिकतम करना और यकृत कोशिकाओं जैसे विवो लक्ष्यों में प्रासंगिक एमआरएनए या डीएनए जैसे अलग-अलग पेलोड को शामिल करना शामिल है, या कभी-कभी इन विट्रो अनुप्रयोगों के मामले में कई सेल-प्रकारों में। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए, हमें विवो शक्ति में जांच करते समय आकार, पीडीआई, जेटा क्षमता और प्रतिशत एनकैप्सुलेशन जैसे बायोफिज़िकल गुणों को संतुलित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, लक्ष्य एक शक्तिशाली, अभी तक अच्छी तरह से सहन किए जाने वाले फॉर्मूलेशन को ढूंढना है और इसलिए हम विश्लेषण में शरीर के वजन में परिवर्तन, साइटोकिन प्रतिक्रिया, या एएसटी / एएलटी जैसे यकृत एंजाइमों के उपयोग जैसी प्रतिक्रियाओं को शामिल कर सकते हैं। पैटर्न कई एलएनपी प्रयोगों से उभरे हैं। विशेष रूप से, आयनीय लिपिड और एन / पी अनुपात के दाढ़ अनुपात में परिवर्तन आरएनए एनकैप्सुलेशन को काफी प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, पीईजी दाढ़ अनुपात में परिवर्तन कण स्थिरता को प्रभावित करते हैं, जैसा कि आकार और पीडीआई पर प्रभाव से संकेत मिलता है। सामान्य तौर पर, एलएनपी कोर में पीईजी की अधिकता चूहों में शक्ति पर हानिकारक प्रभाव डालती है।

प्रदर्शन में सुधार विशेष रूप से ध्यान देने योग्य होते हैं जब एक से अधिक प्रतिक्रिया लक्षित होती है: भले ही बेंचमार्क पहले से ही प्राथमिक प्रतिक्रिया (जैसे, शक्ति) के संबंध में अच्छा प्रदर्शन करता है, संयुक्त अनुकूलन आमतौर पर प्राथमिक प्रतिक्रिया के संबंध में व्यवहार को बनाए रखता है या सुधारता है, साथ ही साथ अन्य प्रतिक्रियाओं (पीडीआई, आकार या बॉडीवेट लॉस को कम करना) के संबंध में व्यवहार में सुधार करता है। हम पुष्टि करण रन के साथ इन सुधारों की प्रामाणिकता को मान्य करते हैं, जिसमें हम बेंचमार्क फॉर्मूलेशन (संभवतः प्रतिकृति के साथ) और नए उम्मीदवार फॉर्मूलेशन तैयार करते हैं और सीधे तुलना करते हैं।

इस वर्कफ़्लो के डिज़ाइन चरण में कई महत्वपूर्ण चरण हैं. सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि कारक ों और उनकी श्रेणियों को स्पेस-फिलिंग डिज़ाइन प्लेटफ़ॉर्म में सही ढंग से दर्ज किया गया है। दूसरा, प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक परिणामी सूत्रीकरण की व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए ग्राफिक्स और विषय वस्तु ज्ञान का उपयोग करें। अंत में, डिजाइन तालिका द्वारा निर्दिष्ट यादृच्छिक क्रम का पालन करते हुए प्रयोग निष्पादित करें। इस अनुक्रम का पालन करने से अमापा कॉवरिएट्स को रोकने में मदद मिलती है - जैसे कि फॉर्मूलेशन उत्पादन का क्रम या परिवेश का तापमान - अध्ययन के तहत कारकों को भ्रमित करने से। स्पेस-फिलिंग डिज़ाइन का निर्माण करना आसान है - इष्टतम मिश्रण-प्रक्रिया डिज़ाइनों की तुलना में उपयोगकर्ता त्रुटि की कम संभावना के साथ, जिन्हें सेटअप के दौरान अतिरिक्त निर्णयों की आवश्यकता होती है जो अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं को निराश कर सकते हैं और उन्हें डिज़ाइन किए गए प्रयोगों का उपयोग करने से हतोत्साहित कर सकते हैं। फिर भी, इस प्रोटोकॉल के माध्यम से काम करने के बाद, वैज्ञानिकों को अतिरिक्त पढ़ने से लाभ हो सकता है कि इष्टतम डिजाइन प्रोटोकॉल में अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइनों को संभावित रूप से कैसे बदल सकते हैं, जैसे कि गूस और जोन्स (2011)²⁷ के अध्याय 6 में वर्णित है। विशेष रूप से अनुवर्ती अध्ययनों के लिए जो एक इष्टतम क्षेत्र पर "ज़ूम इन" करते हैं - जहां मिश्रण सीमाओं के साथ विफलताओं के बारे में कम चिंता है - डी-इष्टतम डिजाइन अंतरिक्ष भरने वाले डिजाइनों की तुलना में अधिक कुशल हो सकते हैं।

इसी तरह, इस वर्कफ़्लो के विश्लेषण चरण में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि मॉडल कारकों के केवल मुख्य (प्रथम-क्रम) प्रभावों के बजाय इंटरैक्शन सहित उम्मीदवार प्रभावों का एक उपयुक्त सेट निर्दिष्ट करता है। दूसरा, मॉडलिंग ढांचे के रूप में एसवीईएम फॉरवर्ड चयन को नियोजित करें। तीसरा, डिफ़ॉल्ट नो इंटरसेप्ट विकल्प को अक्षम करें और मिश्रण के मुख्य प्रभावों को मजबूर करने से बचें। अंत में, अनुकूलन शुरू करने से पहले प्रतिक्रियाओं के लिए वांछनीयता कार्यों को सही ढंग से सेट करें। एसवीईएम तक पहुंच के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए, प्रतिगमन समस्या¹² के लिए पारंपरिक फॉरवर्ड चयन (न्यूनतम एआईसीसी को लक्षित करना) का उपयोग करना सबसे अच्छा तरीका है। प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है कि एसवीईएम लासो का उपयोग करना भी संभव है: औसतन, यह दृष्टिकोण एसवीईएम फॉरवर्ड चयन के समान परिणाम देता है, हालांकि विशेष डेटासेट के लिए दो दृष्टिकोण थोड़ा अलग इष्टतम फॉर्मूलेशन का उत्पादन कर सकते हैं जिनकी तुलना पुष्टिकरण रन¹² के साथ की जा सकती है। हालांकि, एसवीईएम लासो हीन मॉडलिंग परिणाम देगा यदि उपयोगकर्ता डिफ़ॉल्ट नो इंटरसेप्ट विकल्प¹² को अक्षम करना भूल ने की आसान गलती करता है: इस कारण से, हमने एसवीईएम फॉरवर्ड चयन को डिफ़ॉल्ट विधि के रूप में उपयोग किया है, क्योंकि यह इस विकल्प के लिए अधिक मजबूत है।

इस पद्धति की प्राथमिक सीमा यह है कि अधिक जटिलता के साथ कभी-कभी अध्ययन होंगे जो डिजाइन और विश्लेषण के लिए सांख्यिकीविद की मदद से लाभान्वित होंगे। ऐसी स्थितियां जहां रन बजट सामान्य से अधिक सीमित है (न्यूनतम हेरिस्टिक से नीचे), प्रतिक्रियाएं द्विआधारी हैं, बड़ी संख्या में श्रेणीबद्ध कारक या एकल श्रेणीबद्ध कारक के स्तर हैं, जहां एक शोध लक्ष्य नुस्खा से एक या अधिक मिश्रण कारकों को समाप्त करने पर विचार करना है, या जहां कारक स्थान पर अतिरिक्त बाधाएं हैं, सांख्यिकीविद् द्वारा अलग-अलग संपर्क किया जा सकता है, जैसे कि इष्टतम या हाइब्रिड^12,28 डिजाइनों का उपयोग करके या डिजाइन में अतिरिक्त संरचना जोड़कर। विशेष रूप से, एक हाइब्रिड डिज़ाइन का गठन अधिकांश बजट रन के साथ स्पेस-फिलिंग डिज़ाइन बनाकर और फिर डी-इष्टतम मानदंड का उपयोग करके शेष रन (आमतौर पर 2-4) के साथ डिज़ाइन को "बढ़ाना" किया जा सकता है। एक अन्य हाइब्रिड दृष्टिकोण मिश्रण (लिपिड) और निरंतर (प्रक्रिया) कारकों पर एक अंतरिक्ष भरने वाला डिज़ाइन उत्पन्न करना है, और फिर बाद में कारक स्तरों के "इष्टतम" आवंटन का उपयोग करके किसी भी श्रेणीबद्ध कारकों को जोड़ना है। फिर भी, प्रोटोकॉल में लिया गया सरलीकृत अंतरिक्ष-भरने वाला डिजाइन दृष्टिकोण पिछले कुछ वर्षों में दर्जनों एलएनपी फॉर्मूलेशन अनुकूलन प्रयोगों को चलाने की प्रक्रिया में विकसित किया गया है, और हमारा मानना है कि यह एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है जो ज्यादातर मामलों में सफलतापूर्वक काम करेगा जबकि वैज्ञानिकों को डिजाइन किए गए प्रयोगों का उपयोग करने की उनकी क्षमता में विश्वास भी देगा।