Summary
在这里，我们提出了使用珠子支持的脂质双分子层逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及它们用于询问活化T细胞的突触输出。
Abstract
抗原呈递细胞（APC）向参与物理接触的T细胞提供三种激活信号：1）抗原，2）共刺激/共压，以及3）可溶性细胞因子。T细胞释放两种效应粒子响应于激活：跨突触囊泡（tSV）和超分子攻击粒子，它们分别转移细胞间信使和介导细胞毒性。这些实体被与T细胞进行物理接触的APC迅速内化，使其表征令人生畏。本文提出了制造和使用珠状支持脂质双分子层（BSLBs）作为抗原呈递细胞（APC）模拟物以捕获和分析这些反突触颗粒的方案。还描述了用于绝对测量细胞表面蛋白质密度的方案，具有这种生理水平的BSLBs的重建以及用于跟踪T细胞释放突触颗粒的流式细胞术程序。该协议可用于研究单个蛋白质，复杂配体混合物，病原体毒力决定因素和药物对T细胞效应输出的影响，包括辅助性T细胞，细胞毒性T淋巴细胞，调节性T细胞和嵌合抗原受体表达T细胞（CART）。
Introduction
免疫突触（IS）是在从事物理接触的细胞界面处形成的关键分子结构，其促进并列素信息的调节交换。文献中已经描述了不同的智能体，越来越多的证据表明这些分子集线器是蜂窝网络的保守特征。各种免疫细胞，包括B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，通过短寿命接触的组装来交换信息1。多组学研究正在推进对驱动致病性细胞网络并表达具有未知功能的表面蛋白的白细胞和基质细胞的新亚群的理解。作为合成的APC，BSLB允许直接研究单个蛋白质在T细胞整合激活信号（即抗原和共刺激/共压）中的功能作用，以及由此产生的效应颗粒的释放，称为信号四。
本文描述了在使用BSLB模拟模型APC的表面组成时要考虑的协议和关键技术要点。提出了用于定量测量APC上免疫受体和其他表面蛋白的方案以及用于重建含有这些测量量的合成APC的方案。然后，提出共培养T细胞和BSLB所需的步骤以及使用流式细胞术定量测量跨突触颗粒转移的方案。最值得注意的是，BSLB有助于研究称为突触外接体（SEs）的质膜衍生的tSV群体。T细胞抗原受体富集（TCR +）SEs响应于TCR触发2而脱落，并被BSLBs3有效捕获，代表了评估抗原和模拟膜组成的激动特性的出色读数。CD63 +外泌体和超分子攻击颗粒（SMAP）也被刺激的T细胞释放并被BSLBs捕获。它们可以用作激活的额外读数以及T细胞分泌的外细胞和裂解颗粒。外细胞囊泡向T细胞相互作用极的动员也有助于细胞因子的定向释放，例如IL-2，IFN-γ和IL-10响应于激活4，5，6，7，8。虽然T细胞释放的细胞因子也可以在BSLBs上检测到，但目前正在开发一项更专门的研究，以验证免疫突触中细胞因子释放的定量分析。
为了询问特定的膜组成如何影响T细胞的突触输出，需要定义靶膜组分的生理密度。基于流式细胞术的细胞表面蛋白定量是该方案中必不可少的步骤，需要：1）使用每个抗体具有已知荧光染料数（F / P）的抗体，以及2）基准微球，为从测量的平均荧光强度（MFI）插值荧光染料分子提供标准参考。
这些基准标准品由五个微球群体组成，每个微球群体包含越来越多的等效可溶性荧光染料（MESF），这些荧光素跨越任意荧光检测的动态范围。这些标准群体产生离散的荧光峰，有助于通过简单的线性回归将任意荧光单元转换为MESF。然后将得到的MESF与抗体F / P值一起使用，以计算每个细胞（或后续步骤中的BSLB）结合分子的平均数量。将估计的细胞表面积应用于检测到的分子的平均数量，然后能够将生理密度计算为分子/ μm2。该定量方案还可以适用于测量T细胞上的蛋白质密度和介导同型T细胞突触（即T-T突触9）形成的膜组合物的生化重建。如果需要，可以通过使用标记每个分子已知数量的荧光色素的重组靶标来进一步估计抗体结合的效价。然后，通过同时比较结合的荧光蛋白和定量抗体的数量（使用两种不同的定量荧光染料和MESF标准品），可以计算同一BSLB群体的抗体结合价。
APC膜的重构需要在硅微珠上组装支撑的脂质双分子层（SLB）1。可以利用含有不同磷脂物种的脂质体储液形成多功能脂质 - 双层基质，从而能够锚定具有不同结合化学性质的重组蛋白（脂质体的制备详见 10）。一旦定义了"细胞上"相关配体的生理密度（或密度），就可以使用相同的流式细胞术方案来估计涂覆具有目标生理密度的BSLBs所需的重组蛋白的浓度。两种不同的锚固系统可以组合使用，也可以单独使用。
首先，含有最终12.5摩尔%的含Ni2 +磷脂的SLB足以提供每平方微米约10，000个His标签结合位点10 ，并且能够很好地用大多数市售蛋白质装饰BSLB，其生理密度不超过此最大负载能力。第二种负载系统利用含生物素的磷脂（以摩尔为单位）通过链霉亲和素桥加载生物素化的抗CD3e Fab（或HLA / MHC单体）。这两种BSLB装饰方法的结合使得BSLB能够灵活地定制为合成APC。对于高度复杂的APC表面组合物，磷脂和蛋白质的摩尔%可以增加，以加载手头问题所需的尽可能多的蛋白质。一旦定义了蛋白质的工作浓度和生物素化磷脂的摩尔%，就可以组装BSLB以使用多参数流式细胞术询问T细胞的突触输出。
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Protocol
1. 使用定量流式细胞术测量细胞表面蛋白密度
- 通过将EDTA（至最终2mM浓度）和人AB血清（至最终10%）加入无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（见 表1），制备0.22μm过滤的人流式细胞术缓冲液（hFCB）。使用0.22μm孔过滤装置过滤溶液以除去血清杂质并储存在4°C。
- 回收细胞并通过在室温（RT）下以300× g 离心5分钟来沉淀它们。
- 用PBS洗涤细胞两次。在每个洗涤步骤中，将PBS中的细胞重悬到原始体积（离心前），并在室温下以300× g 旋转5分钟。
- 在血细胞计数器中计数台盼蓝染细胞悬浮液11。或者，使用电流排除对细胞进行计数。对于后者，请遵循 CASY-TT 制造商的说明（请参见 材料表）。
注意：CASY-TT细胞计数器可以测定活细胞百分比，细胞大小和细胞体积。 - 计算含有1：1，000稀释的可固定活性染料eFluor 780或类似物（见材料表）的PBS的体积，以将细胞重悬至107个细胞/ mL的染色浓度。
- 使用活性染料PBS溶液重悬细胞，并在冰上孵育30分钟。
- 通过加入一体积的冰冷hFCB去除活性染料。在4°C下以300× g 旋转5分钟。
注意：从现在开始，保持冷链不间断。 - 用含有1：50稀释的Fc受体阻断溶液的hFCB洗涤细胞（见 材料表）。将体积降至107 个细胞/ mL的最终浓度，并再孵育15分钟，以实现有效的FcgR阻断。
- 在U型底或V型底96 孔板的每孔中分配100μL细胞悬浮液（即106个细胞）。将细胞保持在冰上并避光（用铝箔盖住）。
- 通过定义每种荧光染料偶联抗体的最佳抗体浓度，最重要的是，用于确定表面蛋白密度的抗体，在hFCB中制备抗体预混液。例如，为了定量扁桃体细胞群上的ICAM-1表达，如图 1所示，制备含有1：200稀释的抗CD4，抗CD19和抗CXCR5以及抗ICAM-1抗体的饱和浓度的混合物，每个抗体具有已知的AF647荧光染料（即10μg/ mL，由独立的抗体滴定实验定义）。
- 作为额外的对照，准备含有相关 抗体同种型对照的抗体预混液（与与相同荧光染料偶联的对应物具有相同的有效浓度 进行背景减法），即使用10μg/ mL的相关AF647同种型对照。
注意：在上面的例子中，这种同种型对照用于从细胞上的真实ICAM-1信号中减去背景荧光。 - 当定量组织内以低频存在的细胞亚群上的蛋白质密度时，制备荧光减1（FMO）对照，其中包含除目标标记物之外的所有染色抗体（参见 12中的更多详细信息）。
- 在4°C下以300× g 离心含有细胞的96孔板5分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于50μL定量抗体预混液或同种型抗体预混液中。
- 使用平板振荡器在4°C和400rpm下孵育细胞至少30分钟。保护板材免受光线照射（用铝箔盖住）。
- 使用hFCB洗涤细胞三次，并在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 使用200μLPBS重悬细胞沉淀（即，终浓度为5×106 个细胞/ mL）。
- 对于收购：
- 如果使用标准BD FACS装载机，请将样品转移到5 mL聚苯乙烯圆底管中（见 材料表）。
- 如果使用高通量取样器（HTS，也称为读板器），请立即继续执行步骤 1.19。
- 在继续MESF标准品的数据采集之前，请检查定量通道的荧光强度线性度最大和最小限值。
- 在补偿之前，获取MESF标准的数据，确保最暗和最亮的人群都落在线性测量范围内。
- 获取补偿样本。保持定量通道的光电倍增管（PMT）电压值不变，以保持检测的动态范围。在计算补偿矩阵之前，对其他通道的PMT电压进行轻微调整。
- 计算并应用补偿。
- 为每个定量通道采集并保存至少 2 × 104 个 MESF 微珠。
- 根据单个单元的侧向和前向光散射区域（分别为SSC-A和FSC-A，如图 1A （i）所示）选择单个细胞的群体，然后选择时间连续体内的事件（图1A （ii））和FSC和SSC中飞行时间（W）的低与它们的高度相比（即， FSC-W/FSC-H，其次是SSC-W/SSC-H门控，分别如图 1A （iii）和（iv）所示）。定义一个最终的单事件门，其中包含具有比例FSC-A与FSC-H分布的事件（图1A （v））。
- 采集对照样品（同种型标记和FMO对照）。
- 采集样本并记录，直到采集至少10，000个靶细胞。
注意：平均分子密度的可靠测定需要跨独立实验分析多个供体。当分析在降低的频率中发现的细胞亚群或来自稀缺的生物材料（例如，来自人体组织活检）的细胞亚群时，这一点至关重要。 - 在关闭仪器之前，用FACS清洁溶液洗涤运行5分钟的细胞仪，然后用5分钟超纯水清洗。如果使用HTS，请按照 HTS和Clean Plate程序选项卡下的选项进行操作。
注：为减少样品间残留，请激活 坐式（采样器）冲洗 或 高通量采样器洗涤 选项，这些选项将自动洗涤试管或孔之间的细胞计数器。在开始采集之前，以高流速运行超纯水10分钟，以从细胞仪样品管路中除去任何未洗涤的生物污染物。 - 导出流式细胞术标准 （FCS） 文件。
2. MESF过度校正均值（或中位数）荧光强度（MFI）回归分析
- 打开流式细胞术分析软件并加载实验FCS文件。根据磁珠的侧面和前向光散射区域（SSC-A与FSC-A）选择磁珠群体，如图 1A （i）所示。
- 通过检查单个事件随时间推移的分布来控制数据质量，如步骤 1.24 所示。
注：气泡在事件随时间推移的分布中产生间隙;这通常出现在使用HTS进行采集的开始。避免在采集时间中选择侧翼间隙的事件，因为这些事件会因光学像差而增加测量误差。 - 专注于单个事件。
- 细胞
- 首先根据其SSC-A和FSC-A分布识别单个细胞（图1A （i）），然后是顺序门FSC-W / FSC-H（单线态-1， 图1A 面板（iii））和SSC-W / SSC-H（单线态-2）中W的低事件; 图1A 面板（iv））。通过选择具有比例 FSC-A 和 FSC-H 的事件来定义额外的单线栅极-3 门（图 1A，面板 （v））。最后，将活细胞鉴定为可固定活性染料的阴性细胞。
- 梅斯福珠
- 遵循与步骤2.3.1.1相同的单线态-1到单线态-3的判别（图1B，面板（i）至（v））。根据荧光强度水平识别每个MESF群体（空白，1，2，3和4）（见 图1B，图（vi））。
- 细胞
- 提取MESF级分的MFI空白和1至4。
- 通过从每个馏分中减去空白磁珠群的小额信贷机构，为MESF级分1至4生成校正的MFI（cMFI）值。
- 计算cMFI与供应商提供的MESF值之间关系的最佳拟合线（自变量，分数空白等于零）。
- 提取MESF在cMFI上的线性回归的斜率（在下面的等式中为b ）（图1B 面板（viii）显示了y = a + bx;a = 0的回归）。
- 从感兴趣的群体（图1A图（vii）中的TFH和B细胞）中提取中位数（对于双峰荧光分布）或平均值（对于正态或对数正态荧光分布）荧光强度。
- 与步骤2.5-2.7一样，从同种型标记的对照单元中提取MFI值。
- 如果同种型对照的F / P与定量抗体相同，则通过从同种型标记的细胞中减去MFI来校正染色细胞的MFI。
- 如果同种型的F / P与定量抗体的F / P不同，则通过除以步骤2.7中计算的斜率的同种型标记细胞的MFI来从同种型中提取MESF。在估计结合的定量抗体之前，从定量 MESF 中减去同种型 MESF。
- 将MESF除以定量抗体的F / P以估计每个细胞的结合分子数量（Molec.单元 如图 1C的流程图所示）。
- 将结合分子的数量与估计的细胞表面积（CSA（μm2））分开，以提取蛋白质的密度作为molec./μm2 （图1C）。有关更多详细信息，请参阅代表性结果部分。
3. 用于标定BSLBs蛋白质的功能性磷脂种类
- 使用0.4mM DOPC （1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）作为脂质基质的主要成分，形成负载的脂质双层。稀释该DOPC溶液中的所有其他脂质物种。
- 使用0.2至1摩尔%的0.4mM DOPE （1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）与染料偶联，包括ATTO 390，488或565（见 材料表），以产生具有固有荧光的BSLBs。
注意：BSLBs的固有荧光有助于在突触转移实验中鉴定单个BSLBs和单个细胞。 - 使用12.5摩尔%的0.4mM DGS-NTA（Ni） （1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基乙酸）琥珀酰]）来锚定His标记的蛋白质。保持DGS-NTA（Ni）的摩尔%恒定，并从100 nM开始对His标记的蛋白质进行2倍滴定， 作为最高浓度。留下一个没有蛋白质的条件作为绝对定量的阴性对照。
注意：辅助信号和粘附分子，如ICAM-1，设计有12-His标签，以增加蛋白质对DGS-NTA（Ni）的亲和力。 - 使用 生物素帽PE （1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（帽生物素））通过生物素链霉亲和素-生物素桥锚定生物素化蛋白。使用 5 倍连续滴定 0.4 mM 生物素盖 PE，覆盖 10 mol% 至 0 mol% 之间（作为阴性对照）。在校准实验和合成APC的重构中保持链霉亲和素和生物素化蛋白的浓度恒定（200 nM），以进行突触转移实验。
注意：对脂质基质中生物素化蛋白的最终摩尔%的生物素化蛋白（也含有DGS-NTA（Ni）以锚定His标记蛋白）的最终摩尔%的经验密度的回归分析将定义用于重建抗原靶密度的mol%。
4.含1%血清白蛋白的补充HEPES缓冲盐水的制备
注意：在BSLBs的洗涤和蛋白质加载步骤中，需要补充含有1%人血清白蛋白（HBS / HSA）或1%牛血清白蛋白（HBS / BSA）的HEPES缓冲盐水（表1）。准备10x HBS储备溶液和尽可能新鲜的工作缓冲液;冷藏保存，并在一个月内使用。虽然BSA是HSA的更便宜的替代品，但它可以有效地阻断Ni螯合脂质13 ，并推荐用于高通量实验。
- 准备一个10x补充的HBS储备缓冲溶液，含有200 mM HEPES，7 mM Na2HPO4，1400 mM NaCl，50 mM KCl，60 mM葡萄糖，10 mM CaCl2和20 mM MgCl2。
注意：溶解 MgCl2 具有高度放热和灼伤危险。缓慢地在大量溶剂上加入这种盐。避免制备这些盐的浓缩溶液（即1M），因为它们往往会随着时间的推移而沉淀，使它们难以精确地添加到工作缓冲液中。 - 使用0.22μm过滤装置过滤10x溶液，并将其保持在4°C下无菌。
- 对于 500 mL HBS/has，取 50 mL 补充的 10x HBS 溶液，如果需要，将 pH 值调节至 7.4，并用超纯水将体积补足至 483.4 mL。
- 将16.6 mL 30%HSA溶液加入483.4 mL HBS，pH 7.4。
- 对于500 mL HBS / BSA，将5g BSA溶解在HBS中，并在37°C下孵育30分钟。然后，通过定期倒置瓶子在室温下轻轻混合，直到没有可见的蛋白质晶体或团块。
- 使用0.22μm过滤装置（见 材料表）过滤步骤4.5中产生的溶液，并将其储存在4°C。
5. BSLB上的蛋白质密度校准
- 在取5.00±0.05μm直径的非功能化硅微珠之前，充分混合储备溶液并重悬沉在烧瓶底部的任何大团珠。
注意：硅微珠容易快速沉淀，这可能会导致计数错误。通过上下移液P1000微量移液器最大体积的一半来剧烈混合。 - 将1μL微球溶液稀释在1，000μLPBS中，使用血细胞计数器室计数珠子，并计算其每mL的浓度。
注意：台盼蓝染色不需要可视化硅珠。 - 计算滴定点 5 × 105 个最终 BSLB 所需的硅微珠体积。
- 将所需体积的硅微珠转移到无菌的1.5mL微量离心管中。
- 用1 mL无菌PBS洗涤硅微珠三次，在台式微量离心机上以室温（固定转速）离心微珠15秒。
注意：去除洗涤液时，避免干扰珠子颗粒。小的缓冲液柱不会影响组成脂质体预混液的脂质体的扩散，因为这些脂质体也在PBS中。 - 制备三体积的脂质体预混液以在洗涤的二氧化硅珠上组装BSLB（例如，如果二氧化硅微珠的初始总体积为20μL，则制备至少60μL的脂质体预混物）。
- 用于生物素帽 PE 摩尔% 滴定
- 准备含有5倍稀释的生物素帽PE的脂质预混液。
- 将0.4mM生物素帽PE摩尔%稀释在100%DOPC基质中。
- 将每个生物素帽PE摩尔%滴定点以1：1（体积：体积）的比例与0.4 mM 25%DGS-NTA（Ni）的溶液混合，使得所有滴定中都存在最终的12.5摩尔%的含Ni脂质。
注意：含Ni脂质的12.5摩尔%（vol：vol%）代表BSLBs的混合脂质组成，His标记的蛋白质也可以在平行校准中进行测试。例如，由于所有脂质体储备都是以相同的摩尔浓度制备的，因此要在200μL最终脂质体混合物中达到目标摩尔%混合物，只需将100μL25摩尔%含ニ的DGS-NTA与100μL100摩尔%DOPC混合即可。
- 将5×105 个洗涤的硅微粒转移到1.5mL微量离心管中，使得每个管组装一个生物素帽PE摩尔%滴定点。
- 将生物素帽PE摩尔%滴定预混液加入洗涤的硅微珠中，并通过上下移液总体积的一半来轻轻混合。避免形成气泡，过量会破坏脂质双层。
- 在含有正在形成的BSLBs的管子上加入氩气（或氮气）气体，以置换空气并保护脂质在混合过程中免受氧化。
- 在储存前将氩气添加到0.4mM脂质储备中，并使用无菌技术进行操作。
注：将一根小管连接到氩气/氮气瓶。在向管中加入气体之前，请调整气瓶调节器，使压力设置不高于2 psi。将无菌移液器吸头连接到出口管，将气流引导至脂质体储备内 5 秒，然后快速合上盖子。在脂质库存的情况下，在将其储存在4°C之前，用石蜡膜密封管的盖子。 - 将BSLB移至垂直可变角度实验室混合器（见 材料表），并使用10 rpm的轨道混合在室温下混合30分钟。
注意：此步骤将防止在形成支撑的脂质双层期间沉淀珠子。 - 通过在台式小型离心机上以室温离心15 s来旋转珠子，然后用1 mL HBS / HSA（BSA）洗涤三次以除去多余的脂质体。
- 通过加入1mL的5%酪蛋白或5%BSA（含100μMNiSO4）来饱和NTA位点和200 nM链霉亲和素以均匀地涂覆BSLBs上的所有生物素锚定位点，从而阻断形成的BSLBs。 通过上下移液总体积的一半来轻轻混合，并在垂直混合器中以 室温并10rpm孵育不超过20分钟 。
- 在台式小型离心机上通过室温离心15 s来旋转BSLBs，然后用1mL HBS / HSA（BSA）缓冲液洗涤三次。
注意：保持洗涤的珠子垂直放置，少量的洗涤缓冲液覆盖BSLBs。避免BSLBs脱水，因为空气会破坏脂质双层。
- 准备含有5倍稀释的生物素帽PE的脂质预混液。
- 用于在含DGS-（Ni）NTA的BSLB的12.5摩尔%上滴定His标记的蛋白质
- 制备三体积的脂质体预混液，其中含有最终12.5摩尔%的DGS-NTA（Ni）。
- 使用脂质体预混液重悬洗涤的硅微珠，并通过上下移液总体积的一半来轻轻混合。避免形成气泡，过度会损害脂质双层。
- 在含有正在形成的BSLBs的管子上加入氩气（或氮气）气体，以置换空气并保护脂质在混合过程中免受氧化。
- 在储存前将氩气添加到0.4mM脂质储备中，并使用无菌技术进行操作。
- 将BSLB移至垂直混合器，并在室温下以10 rpm的轨道混合混合30分钟。
- 通过在台式小型离心机上以室温离心15 s来旋转珠子，然后用1 mL HBS / HSA（BSA）洗涤三次以除去多余的脂质体。
- 通过加入1mL含有100μMNiSO4的5%酪蛋白（或5%BSA）来阻断形成的BSLBs，以使BSLBs上的NTA位点饱和。
- 使用HBS / HSA（BSA）洗涤三次以除去多余的封闭溶液。
- 在新的U型底96孔板中制备2倍连续稀释的蛋白质。
- 在总体积为200μL的HBS / HSA（BSA）缓冲液中为目标蛋白质准备100 nM的起始浓度，在第一列中分配100μL该溶液，剩余的100μL在包含100μLHBS / HSA（BSA）缓冲液的2号柱顶部。
- 继续将100 μL从2号色谱柱连续转移到3号柱，并根据需要重复以覆盖所有滴定点。将系列的最后一列保留为无蛋白质，因为这将用作定量的空白参考。
- 将制备的BSLBs重悬于体积中，使得5×105 BSLB包含在100μLHBS / HSA（BSA）缓冲液中。
- 将100μLBSLB悬浮液转移到第二个U-底部96孔板的孔中，使得每个孔接收5×105 个BSLBs。
- 在300× g 和RT下旋转含有BSLBs的第二块板2分钟，并弃去上清液。
- 将100 μL体积从蛋白质滴定板转移到含有沉淀BSLBs的板中。轻轻混合，避免移液时产生多余的气泡，并使用板振荡器在室温下和1，000 rpm下孵育30分钟。用铝箔避光。
- 使用300× g 的沉淀步骤用HBS / HSA（BSA）缓冲液洗涤板三次，在室温下洗涤2分钟。
- 如果校准中使用的重组蛋白直接与荧光染料偶联，并且具有已知的F / P值，请继续执行步骤5.8.20。
- 如果校准中使用的重组蛋白未标记或与荧光染料偶联，或者没有可用的MESF微球标准品，请使用具有已知F / P值的Alexa Fluor 488或647偶联抗体来染色蛋白质包被的BSLB。
- 用饱和浓度的定量抗体染色。
注意：根据目标表达水平，这些范围在5至10μg/mL之间。 - 使用平板振荡器在室温下和1，000 rpm下染色30分钟。使用铝箔保护光线。
- 用HBS / HSA（BSA）缓冲液洗涤两次，用PBS洗涤一次，使用300× g 的沉淀步骤在室温下洗涤2分钟。
注意：在采集前，使用PBS，pH 7.4重悬洗涤的BSLBs。不要使用含有蛋白质的缓冲液，因为这会导致在样品与高通量取样器自动混合过程中形成气泡。 - 获取MESF标准品，确保最亮的峰保持在定量检测器（通道）的线性检测范围内，如图 1B （vii）所示。
- 手动或使用 HTS 获取样品。如果使用后者，则将BSLBs重悬于100μLPBS中，并使用2.5至3.0μL / s之间的流速，100μL的混合体积（如果重悬体积较小，则为总体积的50%），150μL / s的混合速度和五种混合物获得80μL，以确保BSLB是单分散的。
- 导出 FCS 文件。
- 将重点放在分析的单个事件上（图2A），因为二元组或三元组将在测定中引入误差。使用协议步骤 1.2.3 中指示的单个事件的嵌套标识。
- 测量每个MESF组分（1-4）的MFI，并减去空白微球的MFI以提取校正的小额信贷组织（cMFI）。
- 执行线性回归分析，以提取 MESF 在为 MESF 标准计算的 cMFI 上的 MESF 斜率 （b），该斜率将在步骤 5.33 中使用。
- 提取每个滴定点的MFI，减去不含蛋白质的微球的MFI，得到cMFI。
- 将cMFI与步骤5.31中计算的斜率除以提取每个滴定点与BSLB结合的MESF。
- 将与BSLBs结合的MESF除以定量抗体的F / P值，以提取每个BSLB结合的平均分子数。
- 使用BSLBs的直径（5.00±0.05μm），提取磁珠表面积（SA = 4pr2）以计算每个滴定点（蛋白质浓度）的蛋白质（molec./μm2）的最终密度。
- 对蛋白质密度上的蛋白质浓度执行新的回归分析，以计算最佳拟合线的斜率（b）。
注：DGS-NTA（Ni）浓度为12.5mol%，最大锚定能力约为10，000 molec./μm210，而不会诱导T细胞的非特异性活化或影响SLB的横向迁移率。
6. 在T细胞和BSLBs之间进行突触转移实验
- 在运行突触转移实验之前
- 获取非荧光BSLB、具有荧光脂质的BSLB、未染色的细胞（或补偿珠;见 材料表）和单色染色细胞（或补偿珠），以鉴定仪器的荧光光谱相互作用。重点关注那些具有高溢出扩散的探测器，以重新设计多色面板，提高灵敏度，并减少关键探测器的测量误差（见 14）。
- 滴定检测抗体以找到最佳浓度，从而在不影响阴性检测的情况下检测阳性事件。
注意：每当抗体批次发生变化时，请重复此步骤，因为F / P值和亮度因批次而异。 - 可选：通过采集不同电压范围（即电压走动）的样品来优化PMT电压，以找到PMT，从而获得最佳的噪声信号（即，分离负极和正极，同时确保最亮群体的信号保持在线性范围内）。
- 测量 T 细胞输出传输到 BSLB
- 制备补充的RPMI 1640（本文为R10培养基），其中含有10%的热灭活胎儿牛血清（FBS），100μM非必需氨基酸，10mM HEPES，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100 U / ml青霉素和100μg/ mL链霉素。使用R10培养基培养和扩增T细胞。
- 第 1天，从外周血或白质还原系统（LRS）室中分离T细胞。使用免疫密度细胞分离和分离试剂盒（见 材料表）富集人CD4 + 和CD8 + T细胞。
- 使用6孔板，每孔总浓度不超过5 mL，以1.5至2.0×106 个细胞/mL的终浓度接种细胞。
- 使用1：1比例的人T细胞活化（抗CD3 / ANTI-CD28）磁珠激活T细胞（见 材料表），并添加100 IU的重组人IL-2以支持细胞增殖和存活。
- 在第 3天，使用磁柱去除激活的磁珠（见 材料表）。确保磁珠保持附着在管的侧面，然后再回收细胞以进行额外的洗涤步骤。
- 用5 mL新鲜R10培养基再次洗涤磁珠，混合均匀，然后放回磁铁中 。恢复此体积并与步骤6.2.5中恢复的细胞混合。
- 将细胞重悬至1.5-2×106 个细胞/mL，在含有100 U / mL IL-2的新鲜R10中。48小时后补充培养基，确保最后一次加入IL-2是在实验日前48小时（培养的第7至14天）。
- 在突触转移实验当天，通过用10%FBS，100μM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100 U / ml青霉素和100μg/ mL链霉素补充酚红RPMI 1640培养基来制备突触转移测定培养基（见表1）。不包括重组人IL-2。
- 使用台盼蓝染色或电流排除对细胞进行计数，并将其重悬至培养基中106 个细胞/mL的终浓度为2.5×。如果观察到过度的细胞死亡（>10%），使用多糖和二氮化钠的混合物去除死亡/垂死的细胞（见 材料表），如下所示：
- 在13 mL多糖 - 二氮化钠溶液之上进行15 mL细胞培养。
- 在室温下离心1，250× g20 分钟，加速度和减加速最小。收集培养基与多糖 - 二氨基苯甲酸钠溶液之间界面中的细胞层（云）。
- 用预热的突触转移测定培养基（在步骤6.2.7中制备）洗涤细胞至少两次。
- 使用突触转移测定培养基计数并重悬细胞至2.5×106 / mL的终浓度。用BSLBs共培养100μL该细胞悬浮液（参见步骤6.2.15）。
- 计算实验所需的BSLB数量;考虑所有不同的蛋白质预混液和待测试的抗原滴定（生物素化的HLA / MHC肽单体或单生物素化的抗CD3ε Fab）。
- 按照方案第5部分的相同步骤组装BSLB，但这次，结合重建复杂APC膜所需的所有蛋白质和脂质滴定（图3A）。保持相同的体积：初始硅微珠体积与校准期间使用的蛋白质混合物体积之间的体积，以及BSLBs负载中使用的时间和温度之间的体积关系。例如，如果使用0.5μL硅珠/孔和100μL/孔蛋白质混合物进行初始校准，则保持5：1，000 vol：vol比率以制备BSLBs与T细胞共同培养。
- 一旦BSLBs加载了感兴趣的蛋白质混合物，用HBS / HSA（BSA）洗涤BSLBs两次以除去多余的未结合蛋白质。在每个洗涤步骤中，使用300× g 的沉降速度在室温下沉降2分钟，并丢弃上清液。
- 将5×每孔105 个BSLB重悬于200μL中。
- 将每孔100μL转移到新的U型底96孔板中以复制，使得每孔BSLB的最终量为2.5×105。
- 将BSLBs以300× g 旋转2分钟，然后RT并丢弃上清液。
- 使用100μLT细胞悬浮液重悬BSLBs;轻轻混合以防止形成气泡。
- 将共培养物在37°C下孵育90分钟。
注意：或者，细胞和磁珠可以重悬于HBS / HSA（BSA）缓冲液中，而不是用于共培养的无酚红RPMI。在这种情况下，孵育必须在非CO2 培养箱中进行，因为这种气体将在没有碳酸氢盐的情况下迅速酸化缓冲液。 - 通过首先将细胞在室温下孵育至少15分钟来冷却BSLB-T细胞共培养物。保护它们免受光线照射。
- 将细胞在500× g 和室温下离心5分钟;丢弃上清液。
- 将细胞重悬于RT 2%BSA-PBS（不含Ca2 + 和Mg2 +）中以阻断。将细胞放在冰上45分钟。避光。
- 在孵育细胞时，使用PBS中冰冷的0.22μm过滤的2%BSA作为染色缓冲液制备抗体预混液，这将提供额外的阻断。
注意：一些与亮紫色染料偶联的抗体倾向于非特异性地与BSLB结合。用5%的BSA-PBS阻断有助于降低这种噪音。 从现在开始，确保保持冷链不间断。 - 在500× g 下旋转共培养物5分钟和4°C。 在丢弃上清液之前，通过使用背光检查96孔板的底部，简要确保沉淀存在。
- 使用多通道移液器，将细胞重悬于含有优化抗体浓度的染色预混液中。
注意：使用不带过滤器的移液器吸头，以防止产生气泡和染色量分布错误。 - 包括同种型标记的细胞和BSLBs，荧光和非荧光BSLBs，以及单独染色的细胞和BSLBs。尊重所有对照的每个孔的事件总数（即，仅包含5个×105 个BSLB/孔，并且仅包含5个×105 个细胞/孔的细胞对照，以避免每个染色事件的抗体相对增加）。
- 通过上下移液一半体积轻轻混合，并在冰上孵育30分钟。避光。
- 使用冰冷的2%BSA-PBS，pH 7.4和500× g 的沉降步骤在4°C下洗涤细胞和BSLBs两次。 将洗涤的共培养物重悬于100μLPBS中并立即获得。
- 如果需要固定，请在PBS中使用0.5%w / v PFA固定10分钟，洗涤一次，并保持在PBS中直到采集。避光。
- 在补偿之前，获取MESF标准，确保最暗和最亮的人群都落在线性测量范围内。
- 获取补偿样本，计算补偿，并将补偿矩阵（链接）应用于实验。
- 为每个定量通道采集并保存至少 2 × 104 个 MESF 标准品。
- 对于使用高通量采样器的采集，将仪器采集设置为标准，将样品采集设置为80μL（或总体积的80%），样品流速在2.0至3.0μL / s之间，样品混合体积为50μL（或总体积的50%，以避免在混合过程中形成气泡），样品混合为150μL / s，每孔混合3至5。
- 每个样品至少采集1×104 个单BSLB（参考门控策略，请参阅 图3B 面板（i）-（vi））。
- 在关闭仪器之前，将运行5分钟的清洁溶液洗涤细胞仪，然后洗涤5分钟的超纯水。如果使用 HTS，请按照选项卡 HTS 下的选项和"清除 "选项进行操作。
- 导出 FCS 文件。
7. 测量粒子向BSLB的突触转移
- 打开试验 FCS 文件。根据细胞和BSLB的侧面和前向光散射区域（SSC-A与FSC-A）选择细胞和BSLB群体， 如图3B （i）所示。
- 选择连续采集窗口中的事件（图3B （ii））。
- 专注于细胞和BSLB的单个事件;首先基于序列门FSC-W/FSC-H（单线态-1， 图3B 面板（iii））和SSC-W/SSC-H（单线态-2）中的低W识别单个细胞; 图3B 面板（iv））。通过选择具有比例 FSC-A 和 FSC-H 的事件来定义额外的单线栅极-3 门（图 3B，面板 （v））。
- 为每个实验样品提取MESF级分空白和1至4的MFI，并从单细胞和MESF中提取MFI。
- 通过从每个馏分中减去空白磁珠群的 MFI，为 MESF 馏分 1 至 4 生成校正的 MFI （cMFI） 值。
- 为单个BSLB和电池生成cMFI（参见 图3C 面板（i））。
- 使用来自用同种型对照抗体染色的BSLB的信号来校正用针对相关T细胞标志物的抗体染色的BSLB的MFI。使用cMFI通过使用 图3C 面板（ii）中所示的等式来计算归一化突触转移百分比（NST%）。
- 如果对响应于 TCR 触发而特异性传输的粒子感兴趣，请从激动性 BSLBs 的 MFI 中减去零 BSLB 的信号。使用此 cMFI 使用图 3C 面板 （ii） 中所示的等式计算 TCR 驱动的 NST%。
- 如果有兴趣确定作为颗粒货物通过T细胞-BSLB界面转移的分子总数，请使用与T细胞-BSLB共培养相同的仪器设置和采集会话来获取MESF基准磁珠。
- 分析MESF磁珠群体并提取其cMFI，如方案步骤5.8.15至5.8.17所示。计算最拟合线的斜率，以便对 cMFI 进行 MESF 回归分析。
- 使用计算的斜率提取沉积在BSLB上的MESF的数量。使用使用同种型对照或零BSLB作为空白计算的cMFI来提取专门转移到刺激BSLB的MESF的数量。
- 通过将计算出的（平均）每个BSLB的MESF除以定量抗体的F / P值来计算转移到BSLBs的标记物的分子数量。
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Representative Results
FCM用于细胞表面的绝对蛋白质定量
BSLB的重构呈现配体的生理密度需要估计建模细胞亚群上的总蛋白质密度。为了重建BSLBs，包括任何预计在目标信号传导轴中起作用的相关配体以及支持BSLB与细胞之间粘附和功能相互作用的蛋白质，例如ICAM-1和共刺激分子，例如CD40，CD58和B7受体（CD80和CD86）。根据手头的问题，可以添加其他蛋白质，包括COSL3，PD-L1和PD-L215等共刺激分子。对于任何其他分子，使用通过定量流式细胞术直接分析细胞来确定的分子密度重建BSLBs。对于直接偶联的抗体，BioLegend 为每个抗体批号提供 F/P 值。抗体也可以在内部标记，F / P比率通过分光光度法测定，当没有与所需荧光染料偶联的商业抗体时，提供一种替代方案。由于我们使用相同的抗体来校准细胞和BSLB表面重组蛋白的数量，因此无需校正抗体结合价，因为这保持不变。如果需要抗体结合价，则使用重组蛋白和具有已知F / P的抗体来修饰BSLB，并将负载重组蛋白的分子与饱和条件下染色后结合抗体的数量进行比较。
每个细胞的结合抗体分子可以使用专用的单色流式细胞仪测量或多色抗体组合来估计，这些抗体旨在估计目标组织内相对不常见的细胞子集（如腭扁桃体）上的绝对蛋白质密度。 图1 显示了CCXCR5 + B细胞和滤泡性T细胞（TFH）中ICAM-1密度的代表性测量。 图1A 所示的相同染色方案和流式细胞术分析原理可用于测量上皮细胞，基质细胞，单核细胞，单核细胞衍生树突状细胞（moDC）或其他人和小鼠组织中的B和T淋巴细胞上的蛋白质密度。对于与血液和扁桃体不同的组织，使用蛋白酶混合物分离细胞时必须谨慎，因为细胞长时间暴露于消化酶会降低细胞表面表达水平。
将采集和分析集中在连续采集窗口内的单个活细胞上（图1A ii），因为时间连续体之外的事件会异常地散射光，从而影响定量。为了提高测定的准确性，通过有效阻断FcγRs来减少APC的非特异性染色。hFCB中存在的人血清和EDTA能够有效地阻断FcγR，同时螯合游离Ca2 + 以减少细胞在操作和染色过程中的自发聚集（ 图1A （iii）和（iv）中的黑色箭头显示扁桃体细胞悬浮液中的剩余双偶组）。
通过使用设置和跟踪微珠和软件（或类似软件;参见 材料表）来跟踪仪器性能对于定量随时间推移的可重复性至关重要，特别是在后续步骤中，当仅使用MFI测量颗粒向BSLB的突触转移时（即，对于没有MESF标准的荧光染料）。同样，检查与MESF标准一起使用的定量检测器的任意荧光单元的线性范围（即 线性度最小值和线性度最大值），以便每个校准点保持荧光与荧光染料数量之间的线性关系。
制备用于荧光的"空白"样品，或提供背景染色噪声概念的样品，对于减去非特异性荧光信号至关重要。同种型对照和/或生物学上为零的样品（例如，敲除）对于校正细胞的背景信号和提取来自定量抗体的真实信号至关重要（图1A 面板（viii））。同样，标准MESF磁珠使用专用的空白胶团从每个真正正的珠子群中减去背景信号（图1B 面板（vii）和（viii））。一旦执行回归分析并提取定义MESF和校正小额信贷机构之间关系的斜率，则转换为绝对分子密度遵循简单的数学运算（图1C）。
为了估计图1C中的CSA，使用电流排除（CASY-TT）从数千个细胞中提取细胞体积和直径的测量值。从球体表面积计算（4pr2）中估计的结果CSA随细胞的活化状态而变化，观察到的值分别为170.37±未活化的B细胞为4.91μm2，±234.52和318±非活化和活化的T细胞分别为24.45μm2。这些 CSA 可与通过成像技术（如非活化淋巴细胞的三维折射率断层扫描）估计的 CSA 相媲美16。
一旦定义了生理密度的范围（例如，通过比较经历不同活化程序的细胞的表面密度），BSLB就可以用于模拟这些表面。NIH四聚体设施（或单生物素化抗CD3ε-Fab）提供的生物素化抗原HLA肽单体的滴定可以与ICAM-1 12-His一起使用，以重建规范的APC膜。标记有6，9，12和14 His的商业蛋白质可用于装饰BSLB的表面（参见 图2A ，了解ICAM-1 12-His的示例）。蛋白质滴定与定量FCM分析一起提供了一种强大的方法来重建生理APC表面并测试它们对不同T细胞亚群突触输出的影响。
为了研究T细胞突触的输出，使用1：1的BSLB与T细胞比例，以确保平均而言，一个细胞在研究期间将与一个BSLB相互作用。我们已经观察到材料转移与孵育时间成正比，为检测通过cell：BSLB界面以低量转移的分子提供了一个多功能平台。因此，适当的面板设计对于提高检测反突触材料的灵敏度和可靠性至关重要，因为在tSV的情况下，输出在25到36个囊泡/细胞/ 20 min2，3之间变化。首先测试每种荧光染料标记的抗体和脂质的光谱溢出。当观察到高溢出时，我们建议滴定染色抗体和组成BSLB的荧光脂质的百分比，以及PMT电压走位，以分别减少补偿样品的扩散误差并提高信噪比（请参阅12，14，17 专门介绍该主题）。
使用定量对照，包括空BSLBs（缺乏抗原或抗CD3 Fab）和敲除细胞或同种型标记样品18，对于准确测量效应tSV（如SEs）的转移以及突触间隙内释放的超分子攻击颗粒至关重要。使用高度丰富的细胞表面蛋白，如CD4，CD2或CD45以及合成荧光脂质（DOPE Atto偶联物）来鉴定基于冷基解离的偶联物的单细胞和BSLB群体。将分析重点放在单个BSLB和细胞中荧光强度的几何平均值或中位数上（CD4用于图3B）。SE是一种来自质膜（PM）的特殊类型的tSV，它们向BSLB的转移可以通过BSLB上标记信号的增益来证明，并且在相互作用的细胞表面上持续丢失信号（参见BSLBs上的TCR，如图2B所示，紫色箭头）。缺乏抗原或抗CD3的空BSLB是跟踪BSLB上TCR（和其他T细胞标志物）特异性获得的绝佳参考，这些TCR（和其他T细胞标志物）是由通过其TCR复合物刺激相互作用细胞引起的。
图1：APC表面蛋白质的绝对定量。 （A）扁桃体B细胞表面ICAM-1定量流式细胞术测量的例子（Foll.Bc）和辅助性T细胞（TFH）。（一-七）用于分析从人腭扁桃体中分离出的单个CXCR5 + Bc和TFH的门控策略。图中显示了用于识别连续采集窗口中包含的单个实时事件的顺序门控策略。（iii-iv） 黑色箭头表示双精度。（viii）叠加直方图显示ICAM-1（蓝绿色直方图）的细胞表面表达与FMO对照（灰色直方图）和用（vii）所示的群体的相关同种型（黑色直方图，与灰色直方图重叠）标记的FMO对照进行比较。箭头指示用于识别 CXCR5+ B 单元格 （Bc;CD19+） 和 TFH （CD4+）。（B）从MFI中提取扁桃体细胞表面的绝对分子需要使用与A所示细胞相同的仪器设置对MESF基准微球进行回归分析。（i-v）图中显示了用于识别连续采集窗口中包含的单个实时事件的顺序门控策略。（六） 对来自不同标准MESF群体的小额供资机构进行门控和测量。（vii）显示的是（vi）中确定的MESF人群的叠加直方图。右上角显示的值表示 5 个 MESF 群体（空白、1、2、3 和 4）中每个群体的小额信贷机构。（viii） （vii） 所示的MESF群体的MESF相对于cMFI的线性回归。图中所示为斜率 （b），用于从 A 中的数据中提取绑定到像元的 MESF。（C）在分子数的提取中，遵循简单的数学运算，首先应用（viii）中从测量的MESF cMFI（cMFIM）和参考MESF值（MESFR）计算的斜率。要提取与细胞结合的MESF（MESFcells），请将细胞（cMFIcells）的校正MFI除以计算的斜率。然后，计算与细胞结合的分子数量（Molec.细胞），将MESFcells除以检测（定量）抗体的F / P。最后，为了计算细胞表面的分子密度（Dcells），将Molec分开。细胞按估计的细胞表面积（CSAE）。缩写： X = 自变量;Y = 因变量（测量的荧光），cMFIM = 测量的校正 MFI;MESFR = 参考 MESF 值;MESFcells = 估计每个单元的MESF;cMFIcells = 校正的 MFI 单元;莫莱克。细胞 = 每个细胞的估计分子数。Dcells = 细胞上的估计密度;CSAE = 估计的细胞表面积。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：BSLB与重组ICAM-1的重建以及颗粒转移到BSLBs的测量（A，i-vi）随着重组单体ICAM-1 12-His（rICAM-1）密度的增加而重组的BSLBs的流式细胞术分析。（i-v）如图 1 所示，将门控策略集中在连续采集窗口内的单个 BSLB 上。注意紧挨着时间连续门之前的间隙，该间隙被排除在外以防止测量误差。 （vi）良好的蛋白质质量通常导致BSLB在高浓度下均匀的涂层，观察到狭窄的荧光分布（低变异系数，见vi中的直方图）。（B） ICAM-1参考浓度（CR）与测量密度（DM）的回归分析。使用斜率计算蛋白质（CT）的目标浓度，以获得图1中实验中测量的细胞（Dcells）的密度。缩写： 12-His = 12-组氨酸标签;DM = 测量的分子密度;CR = rICAM-1的参考浓度;CT = 目标浓度（待插值）;Dcells = 在细胞中测量的密度（另见图1C）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：转移到BSLBs的T细胞突触颗粒的测量。 （A; i-v）流程图显示了用BSLBs重构模型膜共培养T细胞的关键步骤，以及随后使用流式细胞术测量颗粒转移的关键步骤。（iv）蓝色和深黄色图显示了双参数流式细胞术图中细胞和BSLBs的相对分布和位置。（v） 荧光分布直方图，显示激动性BSLBs（深黄色）与空BSLBs（灰色）相比的荧光相对增益。（B）示例性突触转移实验。（i-vi）图中所示为在连续采集窗口内识别单个BSLB和单元的门控策略。紫色箭头表示分析的方向，这在C.（C）（i）中继续，将分析集中在单个细胞（蓝色）和单个BSLB（黄色）的MFI上。（ii）根据BSLB和细胞计算的cMFI计算归一化突触转移（NST%，顶部）和Tmax%（底部）的方程。（三至六）叠加直方图显示细胞（蓝色阴影）和BSLBs（黄色阴影）在不同密度的T细胞激活抗CD3ε-Fab上的荧光强度分布的变化，包括非激活（灰色）和激活250（软色值）或1，000（高颜色值）分子/μm2。不同颜色值的数字表示为以黄色显示的 BSLB 直方图测量的 NST%。叠加的直方图显示了不同标志物阳性的T细胞囊泡突触转移的总体层次结构。对于BSLBs的这种组成（ICAM-1的200钼/μm2和抗CD3ε-Fab的密度增加），tSV被转移到具有TCR + （iii）>CD81 + （iv）>CD4 + （v）>CD28 +（vi）的BSLB。如前几篇文章所示，TCR和CD81是SE的组分，并且以相对较高的效率转移到CD4，尽管后者在相对较高的表面水平上表达。SE脱落导致细胞表面CD81和TCR的损失以及BSLBs上这些信号的增益（黄色直方图中250 molec./μm2的开放紫色箭头和1，000 molec./μm2的闭合紫色箭头）。（D）偶联物的冷却不当导致细胞从硅微珠中撕裂SLB，如比较输入微珠（左双参数图）和从37°C快速冷却至4°C的偶联物（右双参数图） 可以看出。还可与图3B面板（vi）进行比较。缩写： PRF1 = 穿孔苷 1;NST% = 归一化突触转移;Tmax% = 最大观测到转移的百分比（在对照或参考条件下）;tSV：经突触囊泡;SEs：突触外胚体。请点击此处查看此图的放大版本。
表 1：此协议中使用的缓冲区。请点击此处下载此表格。
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Discussion
BSLB是用于研究用APC型膜刺激的T细胞的颗粒输出的多功能工具。该方法的灵活性允许重建复杂和还原剂膜组合物，以研究配体及其信号对tSV和超分子攻击颗粒及其组分的分泌的影响。我们已经在各种T细胞上测试了这项技术，包括预活化的TH，CTL，Tregs和CART15。该协议还适用于测量新鲜分离和静止的T细胞的突触颗粒释放。使用新鲜分离的T细胞的一个局限性是，这些静止的群体产生不同的反突触颗粒谱，这与其细胞表面组成相关（参见 15 了解更多详情）。
作为简单的流式细胞术面板，我们建议使用抗TCR克隆IP26，抗CD81克隆5A6，抗穿孔素（PRF1）克隆B-D48或抗CD40L克隆24-31，以及ATTO 390或ATTO 565含脂质（赋予BSLB固有的荧光）。为了帮助区分单个细胞与单个BSLBs和偶联物，我们建议使用抗CD4克隆OKT4和/或抗CD45克隆HI30，尽管它们在细胞表面以非常高的水平表达，但它们以有限的水平转移到BSLBs（参见 材料表 ，了解有关荧光染料和其他经过验证的抗体的更多详细信息）。可以设计具有较高荧光染料数量的面板，但需要系统地评估所分析的每种荧光染料的荧光光谱溢出。为了提高灵敏度，尝试对定量抗体进行不同的滴定，范围从0.5μg到20μg/mL最终，并在使用新的抗体储备时重复。为了确保颗粒转移的绝对和相对测量的可重复性，请滴定和计算每批新批生物素化和含Ni磷脂的结合能力，因为它们可能因批次而异。T细胞-BSLB偶联物的逐渐冷却对于提高低丰度颗粒检测的灵敏度至关重要。共培养的快速冷却导致BSLBs的破坏，脂质荧光的显着损失证明了这一点（图3D）。
根据手头的实验问题，可以使用不同的指标来测量T细胞免疫突触的颗粒输出。例如，当预计分类成萌芽的SE的表面蛋白的基线表达水平存在微小差异时，可以使用归一化突触转移（NST%）指标（图3C 面板（ii）顶部方程）。后者将BSLB上的MFI信号百分比量化为细胞和磁珠的总组合MFI的函数。这种方法的一个警告是分析未在PM上表达的转移标记，例如超分子攻击粒子的组分19。由于这些元素通过独立于PM转运的途径到达BSLBs，例如细胞内储存胞吐作用，因此不建议计算NST%，因为结果将被夸大，因为分子将被相对较小的分母（细胞表面表达水平）除以。相反，使用校正的小额信贷机构来比较空BSLBs和BSLBs之间穿孔素和颗粒酶的沉积，这些BSLBs的抗原或抗CD3 Fab密度增加。或者，要跟踪转移到BSLBs的细胞内元素，可以使用估计的绝对分子或信号相对于传输到BSLBs的最大信号的百分比（Tmax%）（图3C 面板（ii）底部方程） 进行比较。对于Tmax%，使用cMFI或在BSLB样品（或条件）上测量的具有最高抗原密度的分子作为参考Tmax。分析不同的供体时，使用供体特定的 Tmax 进行比较。当研究响应于TCR特异性触发而转移的材料时，MFI也可以校正到抗原阴性（空）BSLBs上观察到的背景转移水平。
估计转移到BSLBs的分子的绝对数量是一种更可靠的方法，因为这涉及MESF校准，以分子的测量为终点，并对独立实验进行更好的比较。Tmax%在独立实验中提供类似的归一化，当将多色FCM用于细胞内标志物（如穿孔素和颗粒酶）或对于没有MESF标准品的标记物时特别有用。Tmax%只是任何给定条件下信号对对照条件下具有最高转移条件的条件的百分比（例如，用于药物研究的载体/未处理对照，CRISPR / Cas9文库的对照指南RNA）。此外，Tmax%可用于cMFI和绝对数量的分子，并且对于并排比较基因缺失对T细胞突触输出的影响特别有用。当基因编辑导致独立供体和实验中免疫受体表达的动态范围具有高变异性时，后者是显而易见的，这可能会影响绝对和NST%的测量。
BSLB促进了不同T细胞类型的突触输出的捕获和表征，否则由于它们被APC快速内化而难以分离2。BSLBs的物理稳定性还为T细胞研究的BSLBs的荧光激活细胞分选提供了一个平台，从而能够通过质谱和核酸测序技术对高纯度颗粒制剂进行生化表征。后者有助于在广泛的实验条件下对T细胞排出的细胞间信使进行详细表征。可以解决不同的问题，包括这些颗粒信使如何在不同的T细胞类型和激活状态之间变化，规范和非规范抗原受体（即嵌合抗原受体），以及激动性和拮抗性膜信号如何影响颗粒组成。我们目前正在进一步开发这项技术，用于定量表征受刺激T细胞免疫突触分泌的细胞因子。后者需要仔细研究重组细胞因子受体和抗体的组合，从而有效捕获T细胞活化后沉积在BSLBs上的白细胞介素，干扰素和趋化因子。BSLBs可以适应模拟其他怀疑触发T细胞释放tSV的APC的表面组成，例如基质和先天免疫细胞。BSLB还可以用于筛选新的药理学化合物，以寻求外细胞和tSV分泌机制的正负调节，以治疗癌症和其他病症。最后，BSLB还可用于发现调节传染病中T细胞功能的毒力决定因素20。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
我们感谢我们的实验室成员和肯尼迪风湿病研究所社区的建设性科学讨论，特别是我们的流式细胞术设施经理Jonathan Webber。这项工作由惠康信托基金会首席研究奖学金100262Z / 12 / Z，ERC高级资助（SYNECT AdG 670930）和肯尼迪风湿病研究信托基金（KTRR）资助（三者都给MLD）。PFCD得到了EMBO长期奖学金（ALTF 1420-2015，与欧盟委员会（LTFCOFUND2013，GA-2013-609409）和Marie Sklodowska-Curie Actions）以及牛津 - 布里斯托尔迈尔斯施贵宝奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
References
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