Fremstilling af perleunderstøttede lipiddobbeltlag til undersøgelse af partikelproduktionen af T-celleimmunsynapser

Den immunologiske synapse (IS) er en afgørende molekylær struktur dannet ved grænsefladen mellem celler, der er involveret i fysisk kontakt, hvilket letter den regulerede udveksling af juxtrarininformation. Forskellige IS'er er blevet beskrevet i litteraturen, og en voksende mængde beviser tyder på, at disse molekylære hubs er et bevaret træk ved mobilnetværk. Forskellige immunceller, herunder B-celler, naturlige dræberceller, dendritiske celler, makrofager og T-celler, udveksler information via samling af kortvarige ^kontakter1. Multiomiske undersøgelser fremmer forståelsen af nye undergrupper af leukocytter og stromalceller, der driver patogene cellulære netværk og udtrykker overfladeproteiner med ukendte funktioner. Som syntetiske APC'er tillader BSLB'er direkte undersøgelse af individuelle proteiners funktionelle rolle i integrationen af aktiverende signaler, nemlig antigener og costimulation/corepression, af T-celler og den deraf følgende frigivelse af effektorpartikler kaldet signal fire.

Dette papir beskriver de protokoller og kritiske tekniske punkter, der skal overvejes, når du bruger BSLB'er til at efterligne overfladesammensætningen af model APC'er. Protokollerne til kvantitativ måling af immunreceptorer og andre overfladeproteiner på APC'er præsenteres sammen med protokollen for rekonstitution af syntetiske APC'er, der indeholder disse målte mængder. Derefter præsenteres de trin, der kræves til kogulturering af T-celler og BSLB, sammen med protokollen til kvantitativ måling af transsynaptisk partikeloverførsel ved anvendelse af flowcytometri. Mest bemærkelsesværdigt letter BSLB'er at studere en plasmamembranafledt population af TSV'er betegnet synaptiske ektosomer (SE'er). T-celleantigenreceptorberigede (TCR⁺) SE'er kastes som reaktion på TCR-udløsning2 og fanges effektivt af BSLB'er3, hvilket repræsenterer en fremragende aflæsning for at vurdere antigenernes agonistiske egenskaber og den modellerede membransammensætning. CD63⁺ exosomer og supramolekylære angrebspartikler (SMAP'er) frigives også af stimulerede T-celler og fanges af BSLB'er. De kan bruges som yderligere udlæsninger af aktivering og den resulterende eksocytiske og lytiske granulatsekretion af T-celler. Mobiliseringen af exocytiske vesikler til T-cellens interagerende pol letter også retningsfrigivelsen af cytokiner, såsom IL-2, IFN-γ og IL-10 som reaktion på aktivering4,5,6,7,8. Selvom T-cellefrigivne cytokiner også kan påvises på BSLB'er, er en mere dedikeret undersøgelse i øjeblikket under udvikling for at validere den kvantitative analyse af cytokinfrigivelse ved den immunologiske synaps.

At undersøge, hvordan specifikke membransammensætninger påvirker T-cellernes synaptiske output, kræver det, at man definerer den fysiologiske tæthed af målmembrankomponenten. Flowcytometribaserede kvantificeringer af celleoverfladeproteiner er et vigtigt skridt i denne protokol og kræver: 1) anvendelse af antistoffer med kendte antal fluorokromer pr. antistof (F/P) og 2) benchmarkperler, der giver en standardreference for interpolering af fluorokrommolekyler fra målte gennemsnitlige fluorescensintensiteter (MFI'er).

Disse benchmarkstandarder består af fem perlepopulationer, der hver indeholder et stigende antal ækvivalente opløselige fluorokromer (MESF'er), som spænder over det dynamiske område for vilkårlig fluorescensdetektion. Disse standardpopulationer giver diskrete fluorescenstoppe, hvilket letter omdannelsen af vilkårlige fluorescensenheder til MESF'er ved simpel lineær regression. De resulterende MESF'er anvendes derefter sammen med antistof F / P-værdier til at beregne det gennemsnitlige antal bundne molekyler pr. Celle (eller BSLB i senere trin). Anvendelsen af estimerede celleoverfladearealer på det gennemsnitlige antal detekterede molekyler muliggør derefter beregning af fysiologiske densiteter som molekyler /^μm2. Denne kvantificeringsprotokol kan også tilpasses måling af proteintætheder på T-celler og biokemisk rekonstitution af membransammensætninger, der formidler dannelsen af homotypiske T-cellesynapser (dvs. T-T-synapser9). Om nødvendigt kan valensen af antistofbinding estimeres yderligere ved anvendelse af rekombinante mål mærket med kendte antal fluorokromer pr. Molekyle. Derefter kan den antistofbindende valens beregnes for den samme BSLB-population ved samtidig at sammenligne antallet af bundne fluorescerende proteiner og kvantificeringsantistoffer (ved hjælp af to forskellige kvantificeringsfluorokromer og MESF-standarder).

Rekonstitutionen af APC-membraner kræver samling af understøttede lipiddobbeltlag (SLP'er) på ^{silicaperler1}. Liposombestande, der indeholder forskellige fosfolipidarter, kan udnyttes til at danne en alsidig lipid-dobbeltlagsmatrix, der muliggør forankring af rekombinante proteiner med forskellig bindende kemi (fremstillingen af liposomer er beskrevet i ¹⁰). Når den fysiologiske tæthed (eller densiteter) af den relevante ligand "på celler" er defineret, tilpasses den samme flowcytometriprotokol til at estimere koncentrationen af rekombinant protein, der er nødvendigt for at belægge BSLB'er med den målfysiologiske densitet. To forskellige forankringssystemer kan bruges enten i kombination eller separat.

For det første er SLB, der indeholder en endelig 12,5 mol% af ^Ni2+-holdige phospholipider, tilstrækkelig til at tilvejebringe ca. 10.000 His-tag-bindingssteder pr. ^{Kvadratmikron10} og fungerer godt til at dekorere BSLB'er med de fleste kommercielt tilgængelige proteiner, hvis fysiologiske tætheder ikke overstiger denne maksimale belastningskapacitet. Det andet belastningssystem udnytter biotinholdige phospholipider (som mol%) til at indlæse biotinylerede anti-CD3e Fab (eller HLA / MHC monomerer) via streptavidinbroer. Kombinationen af disse to BSLB-dekorationsmetoder muliggør derefter fleksibel skræddersyning af BSLB'er som syntetiske APC'er. For meget komplekse APC-overfladesammensætninger kan mol% af phospholipider og proteiner øges for at indlæse så mange proteiner, som det aktuelle spørgsmål kræver. Når arbejdskoncentrationerne af proteiner og mol% af biotinylerede phospholipider er defineret, kan BSLB'er samles for at forhøre den synaptiske udgang af T-celler med multiparametrisk flowcytometri.

1. Måling af celleoverfladeproteintætheder med kvantitativ flowcytometri

1. 0,22 μm-filtreret human flowcytometribuffer (hFCB) forberedes ved at tilsætte EDTA (til en endelig koncentration på 2 mM) og humant AB-serum (til en endelig 10 %) til sterilt phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4 (se tabel 1). Opløsningen filtreres ved hjælp af en porefilterenhed på 0,22 μm for at fjerne urenheder i serum og opbevares ved 4 °C.
2. Genvind cellerne og sedimenter dem ved centrifugering ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
3. Vask cellerne to gange med PBS. I hvert vasketrin skal cellerne i PBS suspenderes til det oprindelige volumen (før centrifugering) og drejes ned ved 300 × g i 5 minutter ved RT.
4. Tæl trypan blåfarvede cellesuspensioner i et hæmocytometer11. Alternativt kan du tælle celler ved hjælp af udelukkelse af elektrisk strøm. For sidstnævnte skal du følge CASY-TT-producentens anvisninger (se materialetabellen).
   BEMÆRK: CASY-TT-celletælleren tillader bestemmelse af procent levedygtige celler, cellestørrelse og cellevolumen.
5. Beregn volumenet af PBS indeholdende 1:1.000 fortynding af Fixable Viability Dye eFluor 780 eller lignende (se tabellen over materialer), der kræves for at resuspendere cellerne til en farvningskoncentration på 107 celler/ml.
6. Resuspend cellerne ved hjælp af levedygtighedsfarvestof-PBS-opløsningen og inkuber på is i 30 minutter.
7. Fjern levedygtighedsfarvestoffet ved at tilsætte et volumen iskold hFCB. Spin ned ved 300 × g i 5 minutter ved 4 ° C.
   BEMÆRK: Fra nu af skal du holde kølekæden ubrudt.
8. Cellerne vaskes med hFCB indeholdende 1:50 fortynding af Fc-receptorblokerende opløsning (se materialetabellen). Bring volumenet til en endelig koncentration på ¹⁰⁷ celler/ml, og inkuber i yderligere 15 minutter for at opnå effektiv FcgR-blokering.
9. Fordel 100 μL af cellesuspensionen (dvs. ¹⁰⁶ celler) pr. Brønd af en U-bund eller V-bund 96-brøndplade. Hold cellerne på is og beskyttet mod lys (dæk med aluminiumsfolie).
10. Forbered en antistofmasterblanding i hFCB ved at definere de optimale antistofkoncentrationer for hvert fluorokromkonjugeret antistof og vigtigst af alt for de antistoffer, der anvendes til at bestemme overfladeproteintætheder. Til kvantificering af ICAM-1-ekspression på tonsillarcellepopulationer, som vist i figur 1, skal der f.eks. fremstilles en blanding indeholdende 1:200 fortyndinger af anti-CD4, anti-CD19 og anti-CXCR5 sammen med mættende koncentrationer af et anti-ICAM-1-antistof med kendte AF647-fluorokromer pr. antistof (dvs. 10 μg/ml, som blev defineret ved uafhængige antistoftitreringsforsøg).
11. Som yderligere kontroller skal der udarbejdes en antistofmasterblanding indeholdende de relevante antistofisotypekontroller (i samme effektive koncentrationer som deres modparter konjugeret med de samme fluorokromer til baggrundssubtraktion ), dvs. anvende 10 μg/ml af en relevant AF647-isotypekontrol.
    BEMÆRK: I eksemplet ovenfor bruges en sådan isotypekontrol til at trække baggrundsfluorescens fra det sande ICAM-1-signal på celler.
12. Ved kvantificering af proteintætheder på celleundergrupper, der er til stede ved lave frekvenser i væv, skal der udarbejdes fluorescens minus en (FMO) kontrol, der indeholder alle farvningsantistoffer undtagen de markører, der er af interesse (se yderligere detaljer i ¹²).
13. Spin ned den 96-brønds plade, der indeholder cellerne ved 300 × g i 5 minutter ved 4 ° C, kassér supernatanten, og resuspend cellerne i 50 μL af enten kvantificeringsantistofmasterblandingen eller isotypeantistofmasterblandingen.
14. Inkuber cellerne i mindst 30 minutter ved 4 °C og 400 o/min ved hjælp af en pladeryster. Beskyt pladerne mod lys (dæksel med aluminiumsfolie).
15. Cellerne vaskes tre gange med hFCB og centrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
16. Resuspend cellepillen ved hjælp af 200 μL PBS (dvs. til en endelig koncentration på 5 × ¹⁰⁶ celler / ml).
17. Til erhvervelse:
    1. Hvis du bruger en standard BD FACS-læsser, skal du overføre prøverne til 5 ml polystyren rør med rund bund (se materialetabellen).
    2. Hvis du bruger Samplere med høj kapacitet (HTS, også kaldet pladelæsere), skal du straks fortsætte til trin 1.19.
18. Før du fortsætter med dataindsamlingen for MESF-standarderne, skal du kontrollere maksimums- og minimumsgrænserne for fluorescensintensitetslinearitet for kvantificeringskanalerne.
19. Før kompensation skal du indhente data til MESF-standarderne, hvilket sikrer, at både de svageste og lyseste populationer falder i det lineære måleområde.
20. Erhverv kompensationsprøverne. Hold PMT-spændingsværdierne (photomultiplikatorrør) for kvantificeringskanalerne uændrede for at bevare det dynamiske detektionsområde. Udfør små justeringer i PMT-spændingen i andre kanaler, før du beregner kompensationsmatrixerne.
21. Beregn og anvend kompensation.
22. Anskaf og spar mindst 2 × ¹⁰⁴ MESF-perler i alt for hver af kvantificeringskanalerne.
23. Vælg populationen af enkeltceller baseret på deres side- og fremadrettede lysspredningsområder (henholdsvis SSC-A og FSC-A, som vist i figur 1A (i)), efterfulgt af udvælgelsen af begivenheder inden for tidskontinuummet (figur 1A (ii)) og lav for flyvetid (W) i både FSC og SSC sammenlignet med deres højder (dvs. FSC-W/FSC-H efterfulgt af SSC-W/SSC-H-gating som vist i henholdsvis figur 1A (iii) og (iv). Definer en endelig enkelthændelsesport, der indeholder hændelser med proportional FSC-A versus FSC-H-fordeling (figur 1A (v)).
24. Hent kontrolprøver (Isotype-mærkede og FMO-kontroller).
25. Anskaf prøver og optag, indtil mindst 10.000 målceller er erhvervet.
    BEMÆRK: Den robuste bestemmelse af gennemsnitlige molekylære densiteter kræver analyse af flere donorer på tværs af uafhængige eksperimenter. Dette er afgørende, når man analyserer enten celleundergrupper, der findes i reducerede frekvenser eller stammer fra knappe biologiske materialer (f.eks. Fra humane vævsbiopsier).
26. Vask cytometeret, der kører i 5 minutter, med en FACS-rengøringsopløsning efterfulgt af 5 minutter ultrarent vand, inden instrumentet lukkes ned. Hvis du bruger HTS, skal du følge indstillingerne under fanen HTS og Clean Plate-programmet.
    BEMÆRK: For at reducere overførsel fra prøve til prøve skal du aktivere sit (sampler) flush eller high-throughput sampler vaskemuligheder , som automatisk vasker cytometeret mellem rør eller brønde. Før du starter erhvervelsen, skal du køre ultrarent vand i 10 minutter ved en høj strømningshastighed for at fjerne uvaskede biologiske forurenende stoffer fra cytometerprøvelinjen.
27. Eksportér FCS-filerne (Flow Cytometry Standard).

2. MESF-overkorrigerede regressionsanalyser af gennemsnitlig (eller median) fluorescensintensitet (MFI)

1. Åbn flowcytometrianalysesoftwaren, og indlæs eksperimentets FCS-filer. Vælg bestanden af perler baseret på deres side- og fremadrettede lysspredningsområder (SSC-A versus FSC-A), som vist i figur 1A (i).
2. Kontroller datakvaliteten ved at kontrollere fordelingen af enkelthændelser over tid som angivet i trin 1.24.
   BEMÆRK: Bobler skaber huller i fordelingen af begivenheder over tid; dette vises typisk i begyndelsen af erhvervelsen ved hjælp af HTS. Undgå at vælge hændelser, der flankerer huller i anskaffelsestiden, da disse tilføjer målefejl på grund af optiske aberrationer.
3. Fokuser på de enkelte begivenheder.
   1. Celler
      1. Identificere enkeltceller først baseret på deres SSC-A- og FSC-A-fordeling (figur 1A (i)), efterfulgt af hændelser lavt for W i de sekventielle porte FSC-W/FSC-H (singlets-1, figur 1A-panel (iii)) og SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figur 1A-panelet (iv)). Definer en ekstra singlets-3-port ved at vælge hændelser med proportional FSC-A og FSC-H (figur 1A, panel (v)). Endelig skal du identificere levende celler som de negative for det fikserbare levedygtighedsfarvestof.
   2. MESF perler
      1. Følg den samme singlets-1 til singlets-3 diskrimination som i trin 2.3.1.1 (figur 1B, paneler (i) til (v)). Identificer hver af MESF-populationerne (blank, 1, 2, 3 og 4) baseret på deres fluorescensintensitetsniveauer (se figur 1B, panel (vi)).
4. MFI'en for MESF-fraktioner ud med blank og 1 til 4 ud.
5. Generer korrigerede MFI-værdier (cMFI) for MESF-fraktioner 1 til 4 ved at trække MFI'erne for den tomme perlepopulation fra hver brøkdel.
6. Beregn den linje, der passer bedst til forholdet mellem cMFI'er og MESF-værdierne leveret af leverandøren (uafhængig variabel, der er brøkdel tom lig med nul).
7. Uddrag hældningen (b i ligningen nedenfor) af den lineære regression af MESF over cMFI (figur 1B panel (viii) viser en regression, hvor y = a + bx; med a = 0).
8. Uddrag medianen (for bimodale fluorescensfordelinger) eller gennemsnitlige (for normale eller log-normale fluorescensfordelinger) fluorescensintensiteter fra de populationer, der er af interesse (TFH- og B-celler i figur 1A-panelet (vii)).
9. Som i trin 2.5-2.7 skal MFI-værdierne ekstraheres fra isotypemærkede kontrolceller.
10. Hvis F/P for isotypekontroller er de samme som kvantificeringsantistofferne, skal du korrigere MFI'erne for farvede celler ved at trække MFI'erne fra isotypemærkede celler.
11. Hvis isotypernes F/P adskiller sig fra kvantificeringsantistoffernes, ekstraheres MESF fra isotyperne ved at dividere MFI'erne for isotypemærkede celler med hældningen beregnet i trin 2.7. Træk isotype MESF fra kvantificering MESF, før du estimerer bundne kvantificeringsantistoffer.
12. Del MESF med F/P af kvantificeringsantistofferne for at estimere antallet af bundne molekyler pr. celle (Molek. _celle som vist i flowdiagrammet i figur 1C).
13. Del antallet af bundne molekyler med det estimerede celleoverfladeareal (CSA (^μm2)) for at ekstrahere densiteten af proteiner som mol./^μm2 (figur 1C). Se afsnittet med repræsentative resultater for at få flere oplysninger.

3. Funktionelle phospholipidarter til brug ved kalibrering af proteiner, der belægger BSLB'er

1. Brug 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) som hovedkomponent i lipidmatrixen, der danner det understøttede lipiddobbeltlag. Fortynd alle andre lipidarter i denne DOPC-opløsning.
2. Brug mellem 0,2 og 1 mol% af 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin) konjugeret til farvestoffer, herunder ATTO 390, 488 eller 565 (se materialetabellen), til at generere BSLB'er med iboende fluorescens.
   BEMÆRK: BSLB'ernes iboende fluorescens letter identifikationen af enkelte BSLB'er og enkeltceller i synaptiske overførselsforsøg.
3. Brug 12,5 mol% af 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodieddikesyre) succinyl]) til at forankre His-taggede proteiner. Hold mol% af DGS-NTA (Ni) konstant og udfør 2 gange titreringer af his-mærkede proteiner startende med 100 nM som den højeste koncentration. Efterlad en tilstand uden protein som en negativ kontrol for absolutte kvantificeringer.
   BEMÆRK: Tilbehørssignaler og vedhæftningsmolekyler, såsom ICAM-1, er designet med et 12-Hans tag for at øge proteinets affinitet for DGS-NTA (Ni).
4. Brug Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl)) til at forankre biotinylerede proteiner via biotin-streptavidin-biotinbroer. Brug en 5 gange seriel titrering på 0,4 mM Biotinyl Cap PE, der dækker mellem 10 mol% og 0 mol% (som negativ kontrol). Hold koncentrationen af streptavidin og biotinylerede proteiner konstant (200 nM) i både kalibreringsforsøg og rekonstitution af syntetiske APC'er til synaptiske overførselsforsøg.
   BEMÆRK: Regressionsanalyserne af empiriske tætheder af biotinylerede proteiner over den endelige mol% af Biotinyl Cap PE i lipidmatrixen (også indeholdende DGS-NTA (Ni) for at forankre His-taggede proteiner) vil definere mol%, der skal bruges til at rekonstituere måltætheder af antigen.

4. Fremstilling af suppleret HEPES-bufret saltvand indeholdende 1% serumalbumin

BEMÆRK: Suppleret HEPES-bufferet saltvand indeholdende 1% humant serumalbumin (HBS/HSA) eller 1% bovin serumalbumin (HBS/BSA) er påkrævet i vaske- og proteinbelastningstrinnene for BSLB'er (tabel 1). Forbered en 10x HBS-stamopløsning og arbejdsbufferen så frisk som muligt; opbevares i køleskab og bruges inden for en måned. Mens BSA er et billigere alternativ til HSA, giver det effektiv blokering af Ni-chelaterende ^lipider13 og anbefales til eksperimenter med høj gennemstrømning.

1. Der fremstilles en 10x lagerbufferopløsning af suppleret HBS indeholdende 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glucose, 10 mM _CaCl2 og 20 mM _MgCl2.
   BEMÆRK: Opløsning af _MgCl2 er meget eksoterm og en forbrændingsfare. Tilsæt dette salt langsomt og på et stort volumen opløsningsmiddel. Undgå at forberede koncentrerede opløsninger (dvs. 1 M) af disse salte, da de har tendens til at udfælde over tid, hvilket gør deres præcise tilsætning til arbejdsbufferen vanskelig.
2. Filtrer 10x opløsningen ved hjælp af en 0,22 μm filterenhed, og hold den steril ved 4 °C.
3. For 500 ml HBS / har skal du tage 50 ml af den supplerede 10x HBS-opløsning, justere pH til 7,4, hvis det er nødvendigt, og udgøre volumenet til 483,4 ml med ultrarent vand.
4. Tilsæt 16,6 ml 30% HSA-opløsning til 483,4 ml HBS, pH 7,4.
5. For 500 ml HBS/BSA opløses 5 g BSA i HBS og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Bland derefter forsigtigt ved RT ved at vende flasken med jævne mellemrum, indtil der ikke er synlige proteinkrystaller eller klumper.
6. Den resulterende opløsning filtreres fra trin 4.5 ved hjælp af en filterenhed på 0,22 μm (se materialetabellen), og den opbevares ved 4 °C.

5. Kalibreringer af proteindensitet på BSLB'er

1. Før du tager de ikke-funktionaliserede silicaperler med en diameter på 5,00 ±0,05 μm, blandes stamopløsningen godt og suspenderes igen eventuelle store klumper perler, der er sedimenteret på bunden af kolberne.
   BEMÆRK: Silicaperler har tendens til at sedimentere hurtigt, hvilket kan føre til tællefejl. Bland kraftigt ved at pipettere op og ned halvdelen af det maksimale volumen af en P1000 mikropipette.
2. Fortynd 1 μL perleopløsning i 1.000 μL PBS, tæl perlerne ved hjælp af et hæmocytometerkammer, og beregn deres koncentration pr. ml.
   BEMÆRK: Trypan blå farvning er ikke nødvendig for at visualisere silicaperler.
3. Beregn det volumen silicaperler, der er nødvendige for 5 × ¹⁰⁵ endelige BSLB'er pr. Titreringspunkt.
4. Overfør det krævede volumen silicaperler til et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
5. Vask silicaperlerne tre gange med 1 ml steril PBS, centrifuger perlerne i 15 s på en bænkmikrocentrifuge ved RT (ved fast omdr./min.).
   BEMÆRK: Når du fjerner vaskeopløsningen, skal du undgå at forstyrre perlepillen. En lille buffersøjle vil ikke påvirke spredningen af liposomerne, der udgør liposommasterblandingen, da disse også er i PBS.
6. Forbered tre volumener af liposommasterblandingen for at samle BSLB på de vaskede silicaperler (f.eks. Hvis det oprindelige samlede volumen silicaperler er 20 μL, skal du forberede mindst 60 μL af liposommasterblandingen).
7. Til Biotinyl Cap PE mol% titreringer
   1. Forbered lipidmasterblandingerne indeholdende 5 gange fortyndinger af Biotinyl Cap PE.
      1. Fortynd 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% i en 100% DOPC matrix.
      2. Bland hvert Biotinyl Cap PE mol% titreringspunkt i forholdet 1:1 (vol:vol) med en opløsning på 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni), således at en endelig 12,5 mol% Ni-holdige lipider er til stede i alle titreringer.
         BEMÆRK: De 12,5 mol% (vol:vol%) af Ni-holdige lipider repræsenterer den blandede lipidsammensætning af BSLB'er, hvorpå His-mærkede proteiner også kan testes i parallelle kalibreringer. For eksempel, da alle liposombestande fremstilles i samme molære koncentration, skal du blot blande 100 μL 25 mol% Ni-holdige DGS-NTA med 100 μL 100 mol% Ni-holdige DGS-NTA med 100 μL 100 mol% DOPC for at nå målmol% blandingen i 200 μL af 25 mol%.
   2. Overfør 5 × ¹⁰⁵ vaskede silicaperler til 1,5 ml mikrocentrifugerør, således at et Biotinyl Cap PE mol% titreringspunkt samles pr. Rør.
   3. Tilsæt Biotinyl Cap PE mol% titreringsmasterblandingerne til de vaskede silicaperler og bland forsigtigt ved at pipettere op og ned halvdelen af det samlede volumen. Undgå at danne bobler, som i overskud ødelægger lipiddobbeltlaget.
   4. Tilsæt Argon (eller nitrogen) gas på røret, der indeholder de nu dannende BSLB'er for at fortrænge luft og beskytte lipiderne mod oxidation under blanding.
   5. Tilsæt Argon til 0,4 mM lipidlagre før opbevaring og manipuler ved hjælp af en steril teknik.
      BEMÆRK: Tilslut en lille slange til Argon/Nitrogen-gasflasken. Før du tilføjer gas til rørene, skal du justere gasflaskeregulatoren, så trykket ikke indstilles højere end 2 psi. Tilslut en steril pipettespids til udløbsslangen for at lede gasstrømmen inde i liposomstammen i 5 s og luk hurtigt låget. I tilfælde af lipidlagre forsegles rørets låg med paraffinfilm, inden det opbevares ved 4 °C.
   6. Flyt BSLB'erne til en lodret laboratorieblander med variabel vinkel (se materialetabellen) og bland i 30 minutter ved RT ved hjælp af en orbitalblanding på 10 o / min.
      BEMÆRK: Dette trin forhindrer sedimentering af perler under dannelsen af det understøttede lipiddobbeltlag.
   7. Spin perlerne ned ved centrifugering i 15 s ved RT på en bænk minicentrifuge, og vask derefter tre gange med 1 ml HBS / HSA (BSA) for at fjerne overskydende liposomer.
   8. Bloker de dannede BSLB'er ved at tilsætte 1 ml 5% kasein eller 5% BSA indeholdende 100 μM _NiSO4 for at mætte NTA-steder og 200 nM streptavidin for at belægge alle biotinforankringssteder på BSLB'erne ensartet. Bland forsigtigt ved at pipere op og ned halvdelen af det samlede volumen og inkuber i den lodrette mixer i højst 20 minutter ved RT og 10 o / min.
   9. Spin BSLB'erne ned ved centrifugering i 15 s ved RT på en stationær minicentrifuge, og vask derefter tre gange med 1 ml HBS / HSA (BSA) buffer.
      BEMÆRK: Opbevar vaskede perler lodret med et lille volumen vaskebuffer, der dækker BSLB'erne. Undgå dehydrering af BSLB'erne, da luft vil ødelægge lipiddobbeltlaget.
8. Til titrering af His-mærkede proteiner på 12,5 mol% af DGS-(Ni) NTA-holdige BSLB'er
   1. Forbered tre volumener liposom master mix indeholdende en endelig 12,5 mol% af DGS-NTA (Ni).
   2. Brug liposommasterblandingen til at gensuspendere de vaskede silicaperler og bland forsigtigt ved at pipettere op og ned halvdelen af det samlede volumen. Undgå at danne bobler, som i overskud beskadiger lipiddobbeltlaget.
   3. Tilsæt Argon (eller nitrogen) gas på røret, der indeholder de nu dannende BSLB'er for at fortrænge luft og beskytte lipiderne mod oxidation under blanding.
   4. Tilsæt Argon til 0,4 mM lipidlagre før opbevaring og manipuler ved hjælp af en steril teknik.
   5. Flyt BSLB'erne til den lodrette mixer, og bland i 30 minutter ved RT ved hjælp af orbitalblanding ved 10 o / min.
   6. Spin perlerne ned ved centrifugering i 15 s ved RT på en bænk minicentrifuge, og vask derefter tre gange med 1 ml HBS / HSA (BSA) for at fjerne overskydende liposomer.
   7. Bloker de dannede BSLB'er ved at tilsætte 1 ml 5% kasein (eller 5% BSA) indeholdende 100 μM _NiSO4 for at mætte NTA-steder på BSLB'erne. Bland forsigtigt og inkuber i den lodrette mixer i højst 20 minutter ved RT og 10 o / min.
   8. Vask tre gange med HBS/HSA (BSA) for at fjerne den overskydende blokeringsopløsning.
   9. I en ny U-bund 96-brønds plade forberede 2 gange serielle fortyndinger af proteinerne.
      1. Der forberedes en startkoncentration på 100 nM for proteinet af interesse i et samlet volumen på 200 μL HBS/HSA-buffer (BSA), fordeles 100 μL af denne opløsning i den første kolonne og de resterende 100 μL oven på kolonne #2 indeholdende 100 μL HBS/HSA-buffer (BSA).
      2. Fortsæt ved serielt at overføre 100 μL fra kolonne #2 til kolonne #3 og gentag efter behov for at dække alle titreringspunkter. Efterlad den sidste kolonne i serien uden protein, da denne vil blive brugt som den tomme reference til kvantificering.
   10. De forberedte BSLB'er suspenderes i et volumen, således at 5 × ¹⁰⁵ BSLB er indeholdt i 100 μL HBS/HSA-buffer (BSA).
   11. Overfør 100 μL af BSLB-suspensionen til brønde i en anden U-bund 96-brøndplade, således at hver brønd modtager 5 × ¹⁰⁵ BSLB'er.
   12. Drej den anden plade, der indeholder BSLB'er, ned i 2 minutter ved 300 × g og RT, og kassér supernatanten.
   13. Overfør de 100 μL volumener fra proteintitreringspladen til pladen, der indeholder de sedimenterede BSLB'er. Bland forsigtigt, undgå overskydende boblegenerering under pipettering, og inkuber i 30 minutter ved RT og 1.000 o / min ved hjælp af en pladeryster. Beskyt mod lys med aluminiumsfolie.
   14. Pladen vaskes tre gange med HBS/HSA-buffer (BSA) ved hjælp af sedimenteringstrin på 300 × g i 2 minutter ved RT.
   15. Hvis det rekombinante protein, der anvendes i kalibreringen, er direkte konjugeret til fluorokromer og har kendte F/P-værdier, fortsættes trin 5.8.20.
   16. Hvis det rekombinante protein, der anvendes i kalibreringen, er umærket eller konjugeret til fluorokromer, eller der ikke findes nogen MESF-perlestandard, skal du bruge Alexa Fluor 488 eller 647-konjugerede antistoffer med kendte F / P-værdier til at plette den proteinbelagte BSLB.
   17. Plet med mættende koncentrationer af kvantificeringsantistoffer.
       BEMÆRK: Afhængigt af måludtryksniveauet ligger disse mellem 5 og 10 μg/ml.
   18. Plet i 30 minutter ved RT og 1.000 o / min ved hjælp af en pladeryster. Beskyt mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
   19. Vask to gange med HBS/HSA (BSA) buffer og en gang med PBS ved hjælp af sedimenteringstrin på 300 × g i 2 minutter ved RT.
       BEMÆRK: Brug PBS, pH 7,4 til at suspendere de vaskede BSLB'er igen inden erhvervelse. Brug ikke buffere, der indeholder protein, da dette fører til dannelse af bobler under automatisk blanding af prøver med prøver med høj gennemstrømningsprøveudtagere.
   20. Erhverv MESF-standarderne, og sørg for, at de lyseste toppe forbliver i det lineære detektionsområde for kvantificeringsdetektoren (kanalen), som vist i figur 1B (vii).
   21. Anskaf prøverne manuelt eller ved hjælp af HTS. Ved anvendelse af sidstnævnte skal BSLB'er resuspenderes i 100 μL PBS og opnås 80 μL ved hjælp af en strømningshastighed mellem 2,5 og 3,0 μL/s, et blandingsvolumen på 100 μL (eller 50 % af det samlede volumen, hvis resuspensionsvolumenet er mindre), en blandingshastighed på 150 μL/s og fem blandinger for at sikre, at BSLB'er er monodispergede.
   22. Eksporter FCS-filerne.
   23. Fokuser på enkelte hændelser i analyserne (figur 2A), da doublets eller triplets vil medføre fejl i bestemmelsen. Brug indlejret identifikation af enkelthændelser som angivet i protokoltrin 1.2.3.
   24. MFI'en for hver MESF-fraktion (1-4) måles, og MFI'en for blankperler trækkes fra for at udtrække korrigerede MFI'er (cMFI).
   25. Udfør en lineær regressionsanalyse for at udtrække MESF's hældning (b) over cMFI beregnet for MESF-standarder, som vil blive brugt i trin 5.33.
   26. MFI'en for hvert titreringspunkt ekstraheres, og MFI'en for perler uden protein trækkes fra for at opnå cMFI'er.
   27. Del cMFI'erne med hældningen beregnet i trin 5.31 for at udtrække MESF bundet til BSLB'er for hvert titreringspunkt.
   28. Opdel MESF bundet til BSLB'er med F/P-værdien af kvantificeringsantistoffet for at ekstrahere det gennemsnitlige antal molekyler bundet pr. BSLB.
   29. Ved hjælp af BSLB'ernes diameter (5,00 ± 0,05 μm) ekstraheres perlens overfladeareal (SA = ^4pr2) for at beregne de endelige densiteter af protein (mol./^μm2) pr. titreringspunkt (proteinkoncentration).
   30. Udfør en ny regressionsanalyse af proteinkoncentrationen over proteintætheden for at beregne hældningen (b) af den linje, der passer bedst.
       BEMÆRK: Koncentrationen på 12,5 mol% af DGS-NTA(Ni) giver en maksimal forankringskapacitet på ca. 10.000 mol./^μm210 uden at inducere den uspecifikke aktivering af T-celler eller påvirke SLP'ernes laterale mobilitet.

6. Udførelse af synaptiske overførselseksperimenter mellem T-celler og BSLB'er

1. Før du kører det synaptiske overførselseksperiment
   1. Erhverv ikke-fluorescerende BSLB'er, BSLB'er med fluorescerende lipider, ufarvede celler (eller kompensationsperler; se materialetabellen) og enkeltfarvede farvede celler (eller kompensationsperler) for at identificere instrumentets fluorescensspektruminteraktioner. Fokuser på de detektorer med høj afsmitningsspredning for at redesigne det polykromatiske panel, øge følsomheden og reducere målefejlen på kritiske detektorer (se ¹⁴).
   2. Titrer detektionsantistofferne for at finde den optimale koncentration, hvilket muliggør påvisning af positive hændelser uden at gå på kompromis med påvisningen af negativer.
      BEMÆRK: Gentag dette trin, når der ændres et antistofparti, da F / P-værdierne og lysstyrken varierer fra batch til batch.
   3. Valgfrit: Optimer PMT-spændingerne ved at erhverve prøven ved forskellige spændingsområder (dvs. en spændingsvandring) for at finde PMT'erne, der fører til optimalt signal over støj (dvs. adskillelse af negativer og positive, samtidig med at signalet fra den lyseste befolkning forbliver i det lineære område).
2. Måling af T-celleudgangsoverførsel til BSLB'er
   1. Suppleret RPMI 1640 (heri R10-medium) til fremstilling indeholdende 10 % varmeinaktiveret føtalt kvægserum (FBS), 100 μM ikke-essentielle aminosyrer, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Brug R10-medium til at dyrke og udvide T-celler.
   2. På dag 1 isoleres T-celler fra perifert blod eller leukoreduktionssystem (LRS) kamre. Brug immundensitetscelleisolerings- og separationssæt (se materialetabellen) til berigelse af humane CD4⁺ og CD8⁺ T-celler.
   3. Frø cellerne i en endelig koncentration på mellem 1,5 og 2,0 × ¹⁰⁶ celler / ml ved hjælp af 6-brøndsplader med højst 5 ml i alt pr. Brønd.
   4. Aktivér T-celler ved hjælp af et 1:1-forhold mellem humane T-celleaktiveringsperler (anti-CD3/anti-CD28) (se materialetabellen), og tilsæt 100 IE rekombinant human IL-2 for at understøtte celleproliferation og overlevelse.
   5. På dag 3 skal du fjerne de aktiverende magnetiske perler ved hjælp af magnetiske søjler (se materialetabellen). Sørg for, at magnetiske perler forbliver fastgjort til siderne af røret, før du genopretter cellerne til yderligere vasketrin.
   6. Vask de magnetiske perler igen med 5 ml frisk R10 medium, bland godt og læg dem tilbage i magneten . Gendan dette volumen og bland med cellerne, der er genvundet i trin 6.2.5.
   7. Resuspend cellerne til 1,5-2 × ¹⁰⁶ celler/ml i frisk R10 indeholdende 100 U/ml IL-2. Genopfyld medium efter 48 timer, og sørg for, at den sidste tilsætning af IL-2 er 48 timer før forsøgsdagen (dag 7 til 14 i kulturen).
   8. På dagen for det synaptiske overførselseksperiment forberedes det synaptiske overførselsanalysemedium (se tabel 1) ved at supplere Phenol Rødfri RPMI 1640-medium med 10% FBS, 100 μM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Medtag ikke rekombinant human IL-2.
   9. Tæl celler ved hjælp af enten trypanblå farvning eller elektrisk strømudelukkelse, og resuspend dem til en endelig koncentration på 2,5 × ¹⁰⁶ celler / ml i medium. Hvis der observeres overdreven celledød (>10 %), fjernes døde/døende celler ved hjælp af en blanding af polysaccharid og natriumdiatrizoat (se materialetabellen) som følger:
      1. Lag 15 ml cellekultur oven på 13 ml af polysaccharid-natriumdiatrizoatopløsningen.
      2. Centrifuge i 1.250 × g i 20 minutter ved RT med minimal acceleration og deacceleration. Saml cellelaget (skyen) i grænsefladen mellem mediet og polysaccharid-natriumdiatrizoatopløsningen.
      3. Cellerne vaskes mindst to gange med et forvarmet synaptisk overførselsanalysemedium (fremstillet i trin 6.2.7).
      4. Tæl og resuspend cellerne til en endelig koncentration på 2,5 × ¹⁰⁶ / ml ved hjælp af Synaptic Transfer Assay medium. Kokultur 100 μL af denne cellesuspension med BSLB'er (se trin 6.2.15).
   10. Beregn antallet af BSLB'er, der er nødvendige for eksperimentet; overveje alle de forskellige proteinmasterblandinger og antigentittreringer, der skal testes (enten biotinylerede HLA/MHC-peptidmonomerer eller monobiotinylerede anti-CD3ε Fab).
   11. Saml BSLB'erne ved at følge de samme trin fra protokolafsnit 5, men denne gang kombineres alle titreringer af proteiner og lipider, der kræves for at rekonstituere en kompleks APC-membran (figur 3A). Hold den samme vol: vol relationer mellem det oprindelige silicaperlevolumen og volumenet af proteinblanding, der anvendes under kalibreringer, samt tider og temperaturer, der anvendes til indlæsning af BSLB'er. For eksempel, hvis 0,5 μL silicaperler / brønd og 100 μL / brønd proteinblanding blev brugt til den indledende kalibrering, skal du opretholde 5: 1.000 vol: vol-forhold for at forberede BSLB'erne, der skal dyrkes sammen med T-celler.
   12. Når BSLB'er er blevet fyldt med proteinblandingen af interesse, skal BSLB'erne vaskes to gange med HBS / HSA (BSA) for at fjerne overskydende ubundne proteiner. Brug sedimentationshastigheder på 300 × g i 2 minutter ved RT i hvert vasketrin og kassér supernatanterne.
   13. Resuspend de 5 × ¹⁰⁵ BSLB'er pr. Brønd i 200 μL.
   14. Overfør 100 μL pr. brønd til en ny U-bundplade med 96 brønde for at lave en duplikat, således at den endelige mængde BSLB pr. Brønd er 2,5 × ¹⁰⁵.
   15. Spin ned BSLB'erne ved 300 × g i 2 minutter og RT og kassér supernatanten.
   16. Resuspend BSLB'erne ved hjælp af 100 μL T-cellesuspension; bland forsigtigt for at forhindre dannelse af bobler.
   17. Inkubere kokulturerne i 90 minutter ved 37 °C.
       BEMÆRK: Alternativt kan celler og perler resuspenderes i HBS / HSA (BSA) buffer i stedet for Phenol-Red fri RPMI til kokulturen. I dette tilfælde skal inkubationen udføres i en ikke-CO2-inkubator, da denne gas hurtigt vil forsure bufferen i fravær af bicarbonat.
   18. Køl BSLB-T-cellekokulturerne ned ved først at inkubere cellerne ved RT i mindst 15 minutter. Beskyt dem mod lys.
   19. Centrifugere cellerne i 5 minutter ved 500 × g og RT; kassér supernatanten.
   20. Resuspend cellerne i RT 2% BSA-PBS (^Ca2+ og ^Mg2+-fri) til blokering. Læg cellerne på is i 45 min. Beskyt mod lys.
   21. Mens du inkuberer cellerne, skal du forberede antistofmasterblandingen ved hjælp af iskold 0,22 μm filtreret 2% BSA i PBS som en farvningsbuffer, hvilket vil give ekstra blokering.
       BEMÆRK: Nogle partier af antistoffer konjugeret til strålende violette farvestoffer har tendens til at binde sig til BSLB'er uspecifikt. Blokering med 5% BSA-PBS hjælper med at reducere denne støj. Fra nu af skal du sørge for at holde kølekæden ubrudt.
   22. Spin ned kokulturerne ved 500 × g i 5 minutter og 4 ° C. Før du kasserer supernatanterne, skal du kort sørge for, at pillen er til stede ved at inspicere bunden af pladen med 96 brønde ved hjælp af baggrundsbelysning.
   23. Ved hjælp af en flerkanalspipette skal cellerne i farvningsmasterblandingen indeholdende optimerede antistofkoncentrationer.
       BEMÆRK: Brug pipettespidser uden filter for at forhindre generering af bobler og fejl i fordelingen af farvningsvolumener.
   24. Inkluder isotypemærkede celler og BSLB'er, fluorescerende og ikke-fluorescerende BSLB'er og celler og BSLB'er farvet alene. Respekter det samlede antal hændelser pr. brønd for alle kontroller (dvs. kun BSLB'er, der indeholder 5 × ¹⁰⁵ BSLB / brønd, og kun cellekontroller, der indeholder 5 × ¹⁰⁵ celler / brønd for at undgå en relativ stigning i antistoffer pr. Farvet hændelse).
   25. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned halvdelen af volumenet og inkuber i 30 minutter på is. Beskyt mod lys.
   26. Vask cellerne og BSLB'erne to gange ved hjælp af iskold 2% BSA-PBS, pH 7,4 og sedimentationstrin på 500 × g i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspend de vaskede kokulturer i 100 μL PBS og erhverve straks.
   27. Hvis fiksering er nødvendig, skal du rette ved hjælp af 0,5% w/v PFA i PBS i 10 min, vaske en gang og opbevare PBS indtil erhvervelse. Beskyt mod lys.
   28. Før kompensation skal du erhverve MESF-standarder, hvilket sikrer, at både de svageste og lyseste populationer falder i det lineære måleområde.
   29. Hent kompensationsprøver, beregn kompensation, og anvend kompensationsmatrixen (link) på eksperimentet.
   30. Anskaf og spar mindst 2 × ¹⁰⁴ samlede MESF-standarder for hver af kvantificeringskanalerne.
   31. Ved erhvervelse ved hjælp af samplere med høj gennemstrømning indstilles instrumentanskaffelsen til standard, indstilles prøveanskaffelsen til 80 μL (eller 80 % af det samlede volumen), prøvestrømningshastighed mellem 2,0 og 3,0 μL/s, prøveblandingsvolumen på 50 μL (eller 50 % af det samlede volumen for at undgå bobledannelse under blanding), prøveblanding på 150 μL/s og blanding pr. brønd mellem 3 og 5.
   32. Der opnås mindst 1 × ¹⁰⁴ enkelte BSLB'er pr. prøve (se figur 3B-panelerne (i)-(vi) for referencegating-strategien).
   33. Vask cytometeret, der kører i 5 minutter, en rengøringsopløsning efterfulgt af 5 minutter ultrarent vand, inden instrumentet lukkes ned. Hvis du bruger HTS, skal du følge indstillingerne under fanen HTS og indstillingen Rens .
   34. Eksporter FCS-filer.

7. Måling af den synaptiske overførsel af partikler til BSLB

1. Åbn eksperimentet FCS-filer. Vælg populationen af celler og BSLB'er baseret på deres side- og fremadrettede lysspredningsområder (SSC-A versus FSC-A), som vist i figur 3B (i).
2. Vælg hændelserne i vinduet for kontinuerlig anskaffelse (figur 3B (ii)).
3. Fokus på de enkelte begivenheder i både celler og BSLB; identificere enkeltceller først baseret på lavt W i de sekventielle porte FSC-W/FSC-H (singlets-1, figur 3B-panel (iii)) og SSC-W/SSC-H (singlets-2 Figur 3B-panel (iv)). Definer en ekstra singlets-3-port ved at vælge hændelser med proportional FSC-A og FSC-H (figur 3B, panel (v)).
4. MFI'en for MESF-fraktioner blank og 1 til 4 og fra enkeltceller og MESF for hver forsøgsprøve ekstraheres.
5. Generer korrigerede MFI-værdier (cMFI) for MESF-fraktioner 1 til 4 ved at trække MFI'en for blankperlepopulationen fra hver brøkdel.
6. Generer cMFI'er for enkelte BSLB'er og celler (se figur 3C-panelet (i)).
7. Brug signalet fra BSLB farvet med isotypekontrolantistoffer til at korrigere MFI af BSLB farvet med antistoffer mod de relevante T-cellemarkører. Brug cMFI til at beregne den normaliserede synaptiske overførselsprocent (NST%) ved hjælp af ligningen vist i figur 3C-panelet (ii).
8. Hvis du i stedet er interesseret i de partikler, der specifikt overføres som reaktion på TCR-udløsning, skal du trække signalet fra null BSLB'er fra MFI'en for agonistiske BSLB'er. Brug denne cMFI til at beregne den TCR-drevne NST% ved hjælp af ligningen vist i figur 3C-panelet (ii).
9. Hvis du er interesseret i at bestemme det samlede antal molekyler, der overføres som partikellast på tværs af T-celle-BSLB-grænsefladen, skal du erhverve MESF-benchmarkperler ved hjælp af de samme instrumentindstillinger og anskaffelsessession for T-celle-BSLB-kokulturer.
10. Analyser MESF-perlepopulationer og ekstraher deres cMFI'er som angivet i protokoltrin 5.8.15 til 5.8.17. Beregn hældningen af den linje, der passer bedst til regressionsanalysen af MESF over cMFI.
11. Brug den beregnede hældning til at udtrække antallet af MESF deponeret på BSLB'er. Brug cMFI'er beregnet ved hjælp af enten isotypekontroller eller null BSLB som emner for at udtrække antallet af MESF, der overføres specifikt til stimulerende BSLB'er.
12. Beregn antallet af molekyler af markører, der overføres til BSLB'er, ved at dividere de beregnede (gennemsnitlige) MESF'er pr. BSLB med F/P-værdien af kvantificeringsantistoffet.

FCM til absolut proteinkvantificering på celleoverfladen
Rekonstitutionen af BSLB'er, der præsenterer fysiologiske tætheder af ligander, kræver estimering af samlede proteintætheder på den modellerede celledelmængde. For at rekonstituere BSLB'er skal du inkludere enhver relevant ligand, der forventes at spille en rolle i signalaksen af interesse sammen med proteiner, der understøtter vedhæftningen og den funktionelle interaktion mellem BSLB og celler, såsom ICAM-1 og costimulatoriske molekyler, f.eks. CD40-, CD58- og B7-receptorer (CD80 og CD86). Yderligere proteiner kan tilsættes afhængigt af det aktuelle spørgsmål, herunder costimulatoriske molekyler som ICOSL3, PD-L1 og PD-L215. For andre molekyler rekonstitueres BSLB'er ved anvendelse af molekylære densiteter bestemt ved direkte analyse af celler med kvantitativ flowcytometri. For direkte konjugerede antistoffer giver BioLegend F / P-værdier for hvert antistofpartinummer. Antistoffer kan også mærkes internt, og F / P-forholdet bestemmes af spektrofotometri, hvilket giver et alternativ, når der ikke er nogen kommercielle antistoffer konjugeret til den ønskede fluorokrom. Da vi bruger de samme antistoffer til at kalibrere antallet af rekombinante proteiner på overfladen af celler og BSLB'er, er der ikke behov for at korrigere den antistofbindende valens, da denne forbliver konstant. Hvis den antistofbindende valens er påkrævet, skal du anvende både rekombinante proteiner og antistoffer med kendt F/P til at dekorere BSLB'er og sammenligne molekyler af belastede rekombinante proteiner med antallet af bundne antistoffer efter farvning under mættende betingelser.

De bundne antistofmolekyler pr. celle kan estimeres ved hjælp af en dedikeret monokromatisk flowcytometrisk måling eller et polykromatisk panel af antistoffer beregnet til at estimere absolutte proteintætheder på en relativt sjælden delmængde af celler i et væv af interesse, såsom palatinmandler. Figur 1 viser repræsentative målinger af tætheder af ICAM-1 i CXCR5+ B-celler og follikulære T-celler (TFH) som et eksempel. De samme farvningsprotokol- og flowcytometrianalyseprincipper vist i figur 1A kan anvendes til at måle proteintætheder på epitelceller, stromalceller, monocytter, monocytafledte dendritiske celler (moDC'er) eller på B- og T-lymfocytter i andre humane og musevæv. For væv, der er forskelligt fra blod og mandler, skal man være forsigtig, når man isolerer celler ved hjælp af proteasecocktails, da den langvarige eksponering af celler for fordøjende enzymer reducerer celleoverfladeekspressionsniveauerne.

Fokuser erhvervelsen og analyserne på enkelte, levende celler inden for det kontinuerlige anskaffelsesvindue (figur 1A ii), da begivenheder uden for tidskontinuummet aberrant spreder lys og kompromitterer kvantificeringen. For at øge nøjagtigheden af determinationer skal du reducere den uspecifikke farvning af APC'er ved effektiv blokering af FcγR'er. Det humane serum og EDTA, der er til stede i hFCB, muliggør effektiv FcγR-blokering, mens den chelaterer fri ^Ca2+ for at reducere den spontane aggregering af celler under deres manipulation og farvning (sorte pile i figur 1A (iii) og (iv) viser resterende dubleter i suspensioner af tonsillarceller).

At holde styr på instrumentets ydeevne ved hjælp af opsætnings- og sporingsperlerne og softwaren (eller lignende; se materialetabellen) er afgørende for reproducerbarheden af kvantificeringer over tid, især i senere trin, når den synaptiske overførsel af partikler til BSLB måles ved hjælp af kun MFI'er (dvs. for fluorokromer, for hvilke der ikke er nogen MESF-standarder). På samme måde kontrolleres det lineære interval (dvs. linearitetsminimum og linearitetsmaksimum) for vilkårlige fluorescensenheder for den kvantificeringsdetektor, der skal anvendes sammen med MESF-standarderne, således at hvert kalibreringspunkt bevarer det lineære forhold mellem fluorescens og antallet af fluorokromer.

Fremstillingen af prøver "blanke" til fluorescens eller prøver, der giver en idé om baggrundsfarvningsstøj, er afgørende for at trække det uspecifikke fluorescerende signal. Isotypekontroller og/eller biologisk nullprøver (f.eks. knockouts) er afgørende for at korrigere for cellernes baggrundssignal og udtrække det sande signal afledt af kvantificeringsantistofferne (figur 1A-panelet (viii)). Tilsvarende bruger standard MESF-perler en dedikeret blank population til at trække baggrundssignalet fra hver virkelig positiv perlepopulation (figur 1B-paneler (vii) og (viii)). Når regressionsanalyserne er udført, og hældningen, der definerer forholdet mellem MESF og korrigerede MFI'er, er ekstraheret, følger konverteringen til absolutte molekylære densiteter enkle matematiske operationer (figur 1C).

For at estimere CSA i figur 1C blev udelukkelse af elektrisk strøm (CASY-TT) brugt til at udtrække målinger af cellevolumen og diameter fra tusinder af celler. Den resulterende CSA estimeret fra beregningen af overfladeareal for kugler (^4pr2) varierer med cellernes aktiveringstilstand med observerede værdier på 170,37 ± 4,91 ^μm2 for ikke-aktiverede B-celler og 234,52 ± henholdsvis 1,53 ^μm2 og 318 ± 24,45 ^μm2 for ikke-aktiverede og aktiverede T-celler. Disse CSA'er er sammenlignelige med dem, der estimeres ved hjælp af billeddannelsesteknikker såsom tredimensionel brydningsindekstomografi af ikke-aktiverede lymfocytter16.

Når rækkevidden af fysiologiske tætheder er defineret (f.eks. ved at sammenligne overfladetætheder på celler, der gennemgår forskellige aktiveringsprogrammer), kan BSLB'er bruges til at modellere disse overflader. En titrering af biotinylerede antigene HLA-peptidmonomerer tilvejebragt af NIH-tetrameranlægget (eller monobiotinyleret monomert anti-CD3ε-Fab) kan anvendes sammen med ICAM-1 12-His til at rekonstituere en kanonisk APC-membran. Kommercielle proteiner mærket med 6, 9, 12 og 14 His kan bruges til at dekorere overfladen af BSLB (se figur 2A for eksempler med ICAM-1 12-His). Proteintitrering sammen med kvantitative FCM-analyser giver en robust metode til at rekonstruere fysiologiske APC-overflader og teste deres virkning på det synaptiske output fra forskellige T-celleundergrupper.

For at studere output af T-cellesynapser skal du bruge et 1: 1 BSLB-til-T-celleforhold for at sikre, at en celle i gennemsnit vil interagere med en BSLB i løbet af den undersøgte periode. Vi har observeret, at materialeoverførslen er proportional med inkubationstiden, hvilket giver en alsidig platform til påvisning af molekyler, der overføres i lave mængder på tværs af cell:BSLB-grænsefladen. En hensigtsmæssig panelkonstruktion er således afgørende for at øge følsomheden og pålideligheden af detektionen af transsynaptisk materiale, da outputtet i tilfælde af tSV'er varierer mellem 25 og 36 vesikler/celle/20 ^min2,3. Test først spektralafsmitning af hvert fluorokrommærket antistof og lipid. Når der observeres høj spillover, anbefaler vi titrering af farvningsantistoffer og procentdelen af fluorescerende lipider, der udgør BSLB, samt PMT-spændingsvandringer for at reducere spredningsfejlen på kompenserede prøver og forbedre signalet over støjforholdet henholdsvis (se henholdsvis ^12,14,17 for en dedikeret introduktion til emnet).

Anvendelsen af kvantificeringskontroller, herunder null BSLB'er (mangler antigen eller anti-CD3 Fab) og enten knockout-celler eller isotypemærkede ^prøver18, er afgørende for nøjagtigt at måle overførslen af effektor tSV, såsom SE'er, samt supramolekylære angrebspartikler frigivet inden for den synaptiske kløft. Brug meget rigelige celleoverfladeproteiner såsom CD4, CD2 eller CD45 sammen med syntetiske fluorescerende lipider (DOPE Atto-konjugater) til at identificere populationen af enkeltceller og BSLB ved koldbaseret dissociation af konjugater. Fokuser analyserne på det geometriske gennemsnit eller medianen af fluorescensintensiteter i enkelte BSLB og celler (CD4 anvendes i figur 3B). SE'er er en specialiseret type tSV afledt af plasmamembranen (PM), og deres overførsel til BSLB fremgår af forstærkningen af markørsignal på BSLB'er med det konsekvente tab af signal på overfladen af de interagerende celler (se TCR på BSLB'er som vist i figur 2B, violette pile). Null BSLB'er, der mangler enten antigen eller anti-CD3, er en glimrende reference til at holde styr på den specifikke gevinst af TCR (og andre T-cellemarkører) på BSLB som følge af stimulering af interagerende celler via deres TCR-kompleks.

Figur 1: Absolut kvantificering af proteiner på overfladen af APC'er. (A) Eksempel på kvantitative flowcytometrimålinger af ICAM-1 på overfladen af tonsillar B-celler (Foll. Bc) og hjælper T-celler (TFH). (i-vii) Gating strategi til analyse af enkelt CXCR5⁺ Bc og TFH isoleret fra humane palatinmandler. Vist er den sekventielle gating-strategi til identifikation af enkelte, livebegivenheder indeholdt i det kontinuerlige opkøbsvindue. (iii-iv) sorte pile angiver dubleter. viii) overlejrede histogrammer, der viser celleoverfladeekspressionen af ICAM-1 (blågrønne histogrammer) sammenlignet med FMO-kontroller (grå histogrammer) og FMO-kontroller mærket med relevante isotyper (sorte histogrammer, som overlapper med de grå histogrammer) af de populationer, der er vist i (vii). Pile angiver retningen for den indlejrede gating-strategi, der bruges til at identificere CXCR5^{+ B-celler} (Bc; CD19⁺) og TFH (CD4⁺). B) Ekstraktion af absolutte molekyler på overfladen af tonsillarceller fra MFI kræver regressionsanalyser af MESF-benchmarkperler erhvervet ved hjælp af samme instrumentindstilling som cellerne vist i A. (i-v) Vist er den sekventielle gating-strategi til identifikation af enkelte, livebegivenheder indeholdt i det kontinuerlige opkøbsvindue. vi) Gating og måling af MFI'er fra forskellige MESF-standardpopulationer. vii) de viste er overlejrede histogrammer for de MESF-populationer, der er identificeret i nr. vi). De værdier, der vises øverst til højre, repræsenterer MFI'erne for hver af de 5 MESF-populationer (tom, 1, 2, 3 og 4). viii) Lineær regression af MESF over cMFI for MESF-populationerne vist i (vii). Vist er hældningen (b) for udtrækning af MESF bundet til celler fra data i A. (C) Ved ekstraktionen af antallet af molekyler skal du følge simple matematiske operationer, der starter med anvendelsen af hældningen beregnet i (viii) fra målte MESF cMFI (cMFIM) og reference MESF-værdier (MESFR). For at udtrække MESF bundet til celler (_{MESFcells) divideres} den korrigerede MFI af celler (cMFIcells) med den beregnede hældning. Derefter for at beregne antallet af molekyler bundet til celler (Molec. _celler), opdele _MESFcells med F/P af detektionsantistoffet (kvantificering). Endelig, for at beregne molekylær densitet på overfladen af celler (_{Dcells), divider} Molec. _celler efter det estimerede celleoverfladeareal (CSAE). Forkortelser: X = uafhængig variabel; Y = afhængig variabel (målt fluorescens), _cMFIM = målt korrigeret MFI; _MESFR = reference MESF-værdier; _MESFcells = estimeret MESF pr. celle; _cMFIcells = korrigerede MFI-celler; Molek. _celler = estimerede molekyler pr. celle. _Dcells = estimeret densitet på celler; _CSAE = estimeret celleoverfladeareal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Rekonstitution af BSLB med rekombinant ICAM-1 og måling af partikeloverførsel til BSLB'er. (A, i-vi) Flowcytometrianalyse af BSLB'er rekonstitueret med øgede tætheder af rekombinant monomer ICAM-1 12-His (rICAM-1). (i-v) Som i figur 1 skal du fokusere gating-strategien på enkelte BSLB'er inden for det kontinuerlige opkøbsvindue. Bemærk afstanden umiddelbart før tidskontinuumporten, som blev udelukket for at forhindre målefejl. (vi) God proteinkvalitet resulterer ofte i homogen belægning af BSLB ved høje koncentrationer med observation af smalle fluorescensfordelinger (lav variationskoefficient, se histogrammer in vi). B) Regressionsanalyser af ICAM-1-referencekoncentration (_CR) over målt densitet (_DM). Brug hældningen til at beregne målkoncentrationer af protein (_CT) for at opnå tætheden af celler (_Dcells) målt i forsøgene i figur 1. Forkortelser: 12-His = 12-histidiner tag; _DM = målte molekylære densiteter; _CR = referencekoncentrationer af rICAM-1 _CT = målkoncentration (interpoleres) _Dcells = densiteter målt i celler (se også fig. 1C). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Måling af T-cellesynaptiske partikler overført til BSLB'er. (A; i-v) Flowdiagram, der viser de kritiske trin for samdyrkning af T-celler med BSLB'er, der rekonstituerer modelmembraner og den efterfølgende måling af partikeloverførsel med flowcytometri. iv) Blå og mørkegule diagrammer viser den relative fordeling og placering af celler og BSLB'er i biparametriske flowcytometridiagrammer. v) Fluorescensfordelingshistogrammer, der viser den relative forstærkning af fluorescens af agonistiske BSLB'er (mørkegule) sammenlignet med null BSLB'er (grå). (B) Eksemplarisk synaptisk overførselseksperiment. (i-vi) Vist er gating-strategien til at identificere enkelte BSLB'er og celler inden for det kontinuerlige erhvervelsesvindue. Violette pile angiver analyseretningen, som fortsætter i C. (C) (i) Fokuser analyserne på MFI'en for enkeltceller (blå) og enkelte BSLB'er (gul). (ii) Ligninger til beregning af den normaliserede synaptiske overførsel (NST%, top) og _Tmax% (nederst) fra cMFI beregnet for BSLB og celler. (iii-vi) Overlejrede histogrammer, der viser ændringen af fluorescensintensitetsfordelinger for celler (blå nuancer) og BSLB'er (gule nuancer) på tværs af forskellige tætheder af T-cellen, der aktiverer anti-CD3ε-Fab, herunder ikke-aktiverende (grå) og aktivering med enten 250 (blød farveværdi) eller 1.000 (høj farveværdi) molek./^μm2. Tal i forskellige farveværdier repræsenterer NST% målt for BSLB-histogrammerne vist med gult. De overlejrede histogrammer viser det overordnede hierarki i den synaptiske overførsel af T-celleberikler, der er positive for forskellige markører. Til denne sammensætning af BSLB'er (200 mol./^μm2 ICAM-1 og stigende tætheder af anti-CD3ε-Fab) overføres tSV'er til BSLB med TCR⁺(iii) > CD81⁺(iv) > CD4⁺(v) > CD28⁺(vi). Som det fremgår af tidligere artikler, er TCR og CD81 komponenter i SE'er og overføres med forholdsvis højere effektivitet til CD4, på trods af at sidstnævnte udtrykkes på forholdsvis højere overfladeniveauer. SE-afgivelse resulterer i tab af celleoverflade CD81 og TCR og forstærkning af disse signaler på BSLB'er (åbne lilla pile til 250 mol./^μm2 og lukkede lilla pile til 1.000 mol./^μm2 i gule histogrammer). (D) Forkert nedkøling af konjugater fører til, at celler flår SLB'en af silicaperler, som det ses ved sammenligning af indgangsperler (venstre biparametriske plot) og konjugater, der udsættes for hurtig afkøling ned til 4 °C fra 37 °C (højre biparametriske plot). Sammenlign også med figur 3B-panelet (vi). Forkortelser: PRF1 = perforin 1; NST% = normaliseret synaptisk overførsel; _Tmax% = procent af maksimal observeret overførsel (i kontrol- eller referencetilstand); tSV'er: transsynaptiske vesikler; SE'er: synaptiske ektosomer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Buffere, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

BSLB'er er alsidige værktøjer til at studere partikeludgangen fra T-celler stimuleret med model APC-membraner. Metodens fleksibilitet gør det muligt at rekonstituere komplekse og reduktionistiske membransammensætninger for at studere virkningerne af ligander og deres signaler på udskillelsen af TSV'er og supramolekylære angrebspartikler og deres komponenter. Vi har testet denne teknologi på forskellige T-celler, herunder foraktiveret TH, CTL, Tregs og ^CART15. Denne protokol fungerer også til måling af synaptisk partikelfrigivelse af friskisolerede og stillestående T-celler. En begrænsning ved at anvende nyligt isolerede T-celler er, at disse hvilende populationer producerer en anden profil af transsynaptiske partikler, som korrelerer med deres celleoverfladesammensætning (se ¹⁵ for flere detaljer).

Som et simpelt flowcytometripanel anbefaler vi brugen af anti-TCR-klon IP26, anti-CD81-klon 5A6, anti-perforin (PRF1) klon B-D48 eller anti-CD40L-klon 24-31 og ATTO 390 eller ATTO 565-holdige lipider (for at give BSLB'er en iboende fluorescens). For at hjælpe med at skelne enkeltceller fra enkelte BSLB'er og konjugater anbefaler vi brugen af anti-CD4-klon OKT4 og/eller anti-CD45-klon HI30, som overføres til BSLB'er på begrænsede niveauer på trods af at de udtrykkes på meget høje niveauer på celleoverfladen (se materialetabel for yderligere detaljer om fluorokromer og andre validerede antistoffer). Paneler med et højere antal fluorokromer kan designes, men kræver en systematisk evaluering af fluorescensspektrets afsmitning af hver fluorokrom, der analyseres. For at øge følsomheden skal du prøve forskellige titreringer af kvantificeringsantistoffer, der spænder fra 0,5 μg til 20 μg / ml endelig, og gentag, når der anvendes nye lagre af antistoffer. For at sikre reproducerbarheden af de absolutte og relative målinger af partikeloverførsel titreres og beregnes bindingskapaciteten for hvert nyt parti biotinylerede og niholdige fosfolipider, da de kan variere betydeligt fra parti til parti. Den gradvise afkøling af T-celle-BSLB-konjugater er afgørende for at øge følsomheden ved påvisning af partikler med lav overflod. Den hurtige afkøling af kokulturer fører til ødelæggelse af BSLB'er, som det fremgår af det betydelige tab af lipidfluorescens (figur 3D).

Forskellige målinger kan bruges til at måle partikelproduktionen af T-celleimmunsynapser afhængigt af det aktuelle eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, når der forventes mindre forskelle i baseline-ekspressionsniveauerne af overfladeproteiner sorteret i spirende SE'er, kan der anvendes en normaliseret synaptisk overførsel (NST%) metrisk (figur 3C panel (ii) topligning). Sidstnævnte kvantificerer procent MFI-signalet på BSLB'er som en funktion af den samlede, kombinerede MFI af celler og perler. En advarsel fra denne tilgang er analysen af overførte markører, der ikke udtrykkes på PM, såsom komponenter i supramolekylære ^{angrebspartikler19}. Da disse elementer når BSLB'er ved veje, der er uafhængige af PM-transit, såsom intracellulær butiksekocytose, anbefales det ikke at beregne NST%, da resultatet vil blive oppustet, fordi tælleren vil blive divideret med en forholdsvis lille nævner (celleoverfladeekspressionsniveau). Brug i stedet korrigerede MFI'er til at sammenligne aflejringen af perforin og granzymer mellem null BSLB'er og BSLB'er, der præsenterer stigende tætheder af antigen eller anti-CD3 Fab. Alternativt, for at spore intracellulære elementer, der overføres til BSLB'er, skal du bruge til sammenligning enten de estimerede absolutte molekyler, der overføres, eller procentdelen af signalet med hensyn til det maksimale signal, der overføres til BSLB'er (_Tmax%) (figur 3C-panel (ii) bundligning). For _Tmax% skal du bruge enten cMFI eller molekyler målt på BSLB-prøven (eller tilstanden), der præsenterer den højeste antigendensitet som reference _Tmax. Når du analyserer forskellige donorer, skal du bruge donorspecifik _Tmax til sammenligninger. Når man studerer det materiale, der overføres som reaktion på den specifikke udløsning af TCR, kan MFI'er også korrigeres til niveauet for baggrundsoverførsel observeret på antigennegative (null) BSLB'er.

Estimering af det absolutte antal molekyler, der overføres til BSLB'er, er en mere robust metode, da dette indebærer MESF-kalibrering med måling af molekyler som endepunkt og en bedre sammenligning af uafhængige eksperimenter. _Tmax% tilbyder en lignende normalisering på tværs af uafhængige eksperimenter og er især nyttig, når der anvendes polykromatisk FCM til intracellulære markører, såsom perforin og granzymer, eller til markører, for hvilke der ikke findes nogen MESF-standard. _Tmax% er simpelthen den procentdel af signalet i en given tilstand til tilstanden med den højeste overførsel i kontroltilstanden (f.eks. Køretøj / ubehandlede kontroller til lægemiddelundersøgelser, kontrolvejledning RNA'er til CRISPR / Cas9-biblioteker). Endvidere kan _Tmax% anvendes til både cMFI'er og et absolut antal molekyler og har været særlig nyttig til side-om-side sammenligninger af virkningerne af gendelesationer på T-cellers synaptiske output. Sidstnævnte er tydeligt, når genredigering fører til høj variabilitet i det dynamiske område af immunreceptorekspression blandt uafhængige donorer og eksperimenter, hvilket kan påvirke absolutte og NST% målinger.

BSLB'er har lettet indfangningen og karakteriseringen af det synaptiske output fra forskellige T-celletyper, som ellers er vanskelige at isolere på grund af deres hurtige internalisering af APC'er2. Den fysiske stabilitet af BSLB'er giver også en platform for fluorescensaktiveret cellesortering af BSLB'er, der er blevet undersøgt af T-celler, hvilket muliggør biokemisk karakterisering af meget rene partikelpræparater ved massespektrometri og nukleinsyresekventeringsteknologier. Sidstnævnte letter den detaljerede karakterisering af intercellulære budbringere, der kastes af T-celler under en bred vifte af eksperimentelle forhold. Forskellige spørgsmål kan behandles, herunder hvordan disse partikelbudbringere ændrer sig mellem forskellige T-celletyper og aktiveringstilstande, hvordan kanoniske og ikke-kanoniske antigenreceptorer (dvs. kimære antigenreceptorer), og hvordan agonistiske og antagonistiske membransignaler påvirker partikelsammensætningen. Vi udvikler i øjeblikket denne teknologi yderligere til kvantitativ karakterisering af cytokiner udskilt ved immunsynapsen af stimulerede T-celler. Sidstnævnte kræver omhyggelig undersøgelse af kombinationer af rekombinante cytokinreceptorer og antistoffer, hvilket giver effektiv indfangning af interleukiner, interferoner og kemokiner deponeret på BSLB'er efter T-celleaktivering. BSLB'er kan tilpasses til at modellere overfladesammensætningen af andre APC'er, der mistænkes for at udløse tSV-frigivelse af T-celler, såsom stromale og medfødte immunceller. BSLB'er kan også tilpasses til at screene nye farmakologiske forbindelser, der søger positiv og negativ modulering af det eksocytiske og tSV-sekretionsmaskineri til behandling af kræft og andre patologier. Endelig kan BSLB'er også bruges til at opdage virulensdeterminanter, der modulerer T-cellefunktionen i ^{infektionssygdomme20}.