Creazione di un modello di pancreatite acuta grave del topo mediante iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliopancreatico

La pancreatite acuta (AP) è un'infiammazione acuta del pancreas caratterizzata da ostruzione del dotto pancreatico principale con successiva distensione duttale e autodigestione del pancreas da parte dei suoi enzimi anormalmente attivati. Le sue manifestazioni cliniche includono infiammazione locale o sistemica, dolore addominale e aumento dell'amilasi ^sierica1,2. Secondo la classificazione di ^gravità3, l'AP può presentarsi in forme lievi, moderate e gravi e, tra queste, la pancreatite acuta grave (SAP) è la condizione più preoccupante a causa del suo alto tasso di mortalità superiore al 30%⁴. Negli Stati Uniti, l'AP è uno dei motivi più comuni per il ricovero in ospedale, che colpisce oltre 200.000 ^pazienti5. Inoltre, AP, in particolare SAP, aumenta ogni anno e colpisce le fasce di età più ^giovani6. Tuttavia, vi è una mancanza di opzioni di trattamento efficaci nella pratica clinica ^attuale6,7. Pertanto, è necessario esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nell'AP, facilitando così il miglioramento del trattamento.

Modelli animali sperimentali consolidati sono necessari per studiare i meccanismi coinvolti nell'AP e valutare l'efficacia delle diverse modalità di trattamento. Con la facile accessibilità dei ceppi transgenici e knockout e le loro piccole dimensioni, che riducono al minimo le dosi di farmaci necessarie per la valutazione in vivo, i topi sono preferiti per la ricerca AP. Pertanto, diversi modelli di AP sono stati sviluppati nei ^topi8,9.

Lavorando da un modello di ratto di pancreatite lieve indotto attraverso la somministrazione endovenosa di ^caeruleina10, Niederau et al. hanno sviluppato un modello murino SAP presentato con necrosi a cellule acinari indotta utilizzando lo stesso farmaco e via di ^iniezione11. Sebbene questo modello possieda diversi vantaggi, tra cui non invasività, induzione rapida, ampia riproducibilità e applicabilità, il principale svantaggio è che nella maggior parte dei casi viene sviluppata solo una forma lieve di AP, limitando così la sua rilevanza clinica. L'alcol è considerato uno dei principali fattori eziologici di AP; tuttavia, Foitzik et al. hanno riferito che provoca lesioni pancreatiche solo se combinato con altri fattori, come l'iperstimolazione esocrina12. Inoltre, sebbene siano stati riportati modelli ap indotti da alcol sviluppati attraverso diverse vie di somministrazione e dosi di farmaci13,14,15, il loro principale svantaggio è la difficoltà a riprodurli. La somministrazione intraperitoneale di L-arginina può anche indurre AP nei ^topi16; tuttavia, la sua bassa rilevanza clinica ne ostacola l'applicazione. Il taurocolato, un sale biliare, è stato proposto per la prima volta da Creutzfeld et al. nel 1965 per indurre una condizione simile all'AP umano tramite infusione del dotto ^{pancreatico17}. Sebbene esistano controversie sulla sua rilevanza clinica in fisiopatologia18,19, la pancreatite indotta da taurocolato rimane un modello indispensabile per SAP.

Poiché questo modello è semplice da realizzare ed è efficace anche nei topi, è ora uno dei modelli AP più utilizzati per gli studi in vivo sui piccoli animali. Perides et al. hanno impiegato taurocolato di sodio (TC) per indurre SAP nei ^topi20, fornendo approfondimenti per comprendere la sua patologia. Combinato con tecniche di modificazione genetica, questo modello ci ha permesso di confermare diversi geni specifici coinvolti nell'AP. Ad esempio, Bicozo et al. hanno dimostrato che un knockout del gene CD38 proteggeva contro un modello di pancreatite da infusione TC e attribuiva i meccanismi alle alterazioni nella segnalazione intracellulare di ^Ca2+21. Fanczal et al. hanno studiato l'implicazione fisiologica dell'espressione di TRPM2 nella membrana plasmatica delle cellule acinari e duttali pancreatiche di topo e hanno dimostrato una ridotta gravità del SAP indotto da TC nei topi knockout ^TRPM222. Inoltre, questo modello fornisce anche un modo semplice ed efficace per testare molti nuovi farmaci in vivo. Ad esempio, questo metodo ha permesso la convalida degli effetti terapeutici della ^caffeina23, dell'acido deidrocolico24 e di vari antiossidanti e anticoagulanti25,26. Questa evidenza dimostra la versatilità del modello SAP indotto da TC. Sebbene Wittel et al. abbiano descritto un modello murino ^simile27, la mancanza di dettagli sulle procedure di implementazione potrebbe comportare l'incapacità di riprodurre i risultati. In questo articolo, ci concentriamo sui metodi che utilizzano una semplice microsiringa fatta in casa e studiamo il SAP indotto da TC, fornendo così una possibile guida non solo per ulteriori studi sulla patogenesi e il trattamento dell'AP, ma anche per un metodo sperimentale perfettamente adattabile per molte altre sostanze.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati dal Comitato etico animale della Soochow University. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in anestesia completa. Gli analgesici non sono stati usati per evitare interferenze con il decorso naturale della malattia secondo le letterature ^{precedenti28,29}. L'approvazione per la mancanza di analgesia è stata concessa anche dal Comitato etico animale dell'Università di Soochow.

1. Preparazione

1. Veloce un topo wild-type C57BL/6 8-12 ore prima dell'intervento.
2. Preparare una soluzione di TC al 5% (p/v) (93 mM) diluita in cloruro di sodio allo 0,9%. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm.
3. Autoclave degli strumenti e dei materiali chirurgici, tra cui pinze, forbici, supporto per lame, portaago, clip emostatica, morsetti vascolari e teli sterili, utilizzando uno sterilizzatore a pressione ad una temperatura di 121 °C per 30 min.
4. Preparare una microsiringa fatta in casa. Per fare ciò, installare manualmente una punta per insulina monouso e una punta per pipetta di plastica prolungata su una siringa Microliter a punta piatta da 25 μL. Sterilizzare attraverso l'irradiazione.

2. Anestesia e preparazione preoperatoria

1. Pesare topi maschi C57BL/6 wild-type di età compresa tra 6 e 8 settimane (circa 21-23 g). Indurre l'anestesia generale con un'iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital sodico all'1% alla dose di 50 mg/kg.
2. Fissare il mouse in posizione supina su una piastra piana di schiuma irradiata con il nastro.
3. Preparare la regione operativa di ciascun animale rimuovendo la sua pelliccia con una crema di depilazione dal livello del processo xifoide fino alla linea di collegamento della colonna iliaca superiore anteriore bilaterale, con i lati sinistro e destro paralleli alla linea ascellare anteriore.
4. Preparare un campo chirurgico sterile con particolare attenzione all'area chirurgica, costituita dall'area preparata sull'animale e dalla parte anteriore del chirurgo.
   1. Disinfettare il piano di lavoro.
   2. Pulire il sito di incisione con più applicazioni di soluzione di scrub chirurgico. Pulire la pelle due o tre volte con lo 0,5% di iodoforo e lasciarla asciugare per 1-2 minuti ogni volta.
   3. Coprire il mouse con tende sterili.

3. Procedura chirurgica

NOTA: La Figura 1 illustra l'anatomia e la morfologia del pancreas del topo prima e dopo l'iniezione retrograda di TC nel dotto biliopancreatico mediante microiniezione.

1. Fai un'incisione addominale mediana lunga circa 2-3 cm.
2. Individuare il duodeno da sinistra a destra lungo lo stomaco. Estrarre delicatamente il duodeno e sul lato sinistro usando una pinza chirurgica e un batuffolo di cotone imbevuto di disinfettante per esporre il pancreas, il dotto biliopancreatico e la papilla duodenale. Fare attenzione a non ferire la parete intestinale o i vasi correlati.
3. Utilizzare 8-0 suture per passare attraverso la connessione tra il duodeno e il pancreas intorno alla papilla e tirarli sul lato sinistro del corpo del topo per fissare il duodeno.
4. Tirare delicatamente la pelle e il bordo inferiore del fegato da parte. Bloccare il dotto epatico comune, assicurandosi di non bloccare la vena porta o il pancreas. Bloccare il dotto biliopancreatico prossimale.
5. Perforare retrogradamente il microiniettore nel dotto biliopancreatico distale. Fissare la punta dell'ago vicino alla papilla duodenale con un morsetto. Infondere 10 μL del 5% di TC nel dotto pancreatico ad una velocità di 5 μL/min.
6. Tenere chiuso il dotto biliopancreatico per 5 minuti per ottenere una pressione stabile. Quindi, estrarre il microiniettore e rimuovere i morsetti.
7. Ripristinare il duodeno nella posizione anatomica originale e controllare il sanguinamento.
8. Chiudere la ferita con 6-0 punti di sutura e disinfettare con lo 0,5% di iodoforo.

4. Recupero e gestione postoperatoria

1. Recuperare gli animali dall'anestesia su un cuscinetto termico a 37 °C. Non inviare gli animali operati nella stanza temporale postoperatoria fino a quando tutti gli animali non si sono svegliati.
2. Somministrare 0,8 ml di soluzione salina allo 0,9% per via sottocutanea e lentamente per l'integrazione di liquidi.
3. Monitorare gli animali postoperatoriamente per le loro condizioni generali e segni di infezioni o malattie.

5. Test sierologici e valutazione istologica

1. A 24 ore dopo l'operazione, anestetizzare i topi con pentobarbital sodico usando la stessa dose e via di iniezione.
2. Raccogliere tutto il sangue dall'aorta addominale (circa 0,8 ml per topo) e ruotare a 1.500 x g per 15 minuti per isolare il siero per ulteriori test.
3. Raccogliere i tessuti del pancreas.
4. Aprire la cavità toracica per raccogliere i tessuti polmonari.
5. Misurare gli indici di funzione biochimica del siero, tra cui amilasi, lipasi, funzionalità epatica (alanina transaminasi (ALT) e aspartato transaminasi (AST)) e funzionalità renale (urea e creatina), utilizzando kit commerciali secondo le istruzioni dei produttori.
6. Omogeneizzare i tessuti polmonari e pancreatici e misurare il livello di mieloperossidasi (MPO) utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore.
7. Aprire la cavità toracica e perfondere con 20 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) due volte, quindi raccogliere il pancreas. Immergere in soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore. Disidratare in una serie di concentrazioni di alcol e incorporare nella paraffina.
8. Utilizzare un microtomo per preparare sezioni di tessuto pancreatico spesse 5 μm.
9. Eseguire la colorazione H & E per la valutazione istologica del pancreas.
10. Valutare i punteggi patologici secondo i criteri proposti da Schmidt et ^al.30.

Seguendo attentamente le istruzioni di cui sopra, abbiamo ottenuto una durata media dell'intervento di circa 40 minuti. I topi erano leggermente inattivi e avevano perso circa 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g e 0,5-4,73 g di peso rispettivamente a 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo l'operazione (Figura 2).

Dal momento del completamento dell'intervento chirurgico a 24 ore dopo l'operazione, quando la malattia si è sviluppata, i topi sono diventati inattivi e hanno mostrato risposte e azioni lente.

I tassi di sopravvivenza dei topi di controllo e SAP sono stati rispettivamente del 100% (8/8) e del 72,7% (8/11), a 72 ore dopo l'operazione (Figura 3).

Secondo i risultati della colorazione H&E (Figura 4) e del punteggio patologico (Figura 5) delle sezioni del pancreas, l'edema evidente (punteggio: 3,14 ± 0,51 vs 0,10 ± 0,08), l'infiammazione (punteggio: 1,41 ± 0,81 vs 0) e la necrosi (punteggio: 3,03 ± 0,77 vs. 0) del tessuto pancreatico potrebbero essere osservati nei topi SAP rispetto ai topi di controllo. Nel frattempo non sono stati riscontrati cambiamenti significativi sull'emorragia (punteggio: 0,125 ± 0,31 contro 0) in entrambi i gruppi di topi, con conseguente punteggio di patologia totale sostanzialmente elevato nei topi SAP (punteggio: 7,72 ± 1,61 vs 0,10 ± 0,08).

Inoltre, rispetto a quelli dei topi di controllo, i livelli significativamente aumentati di amilasi ([46.740,32 ± 12.801,30] U/L vs. [3.324,40 ± 753,66] U/L, p < 0,001), lipasi ([545,02 ± 356,28] U/L vs. [18,32 ± 25,22] U/L, p < 0,05) e MPO pancreas e polmone (pancreas: [5,18 ± 3,26] U/g vs. [0,71 ± 0,41] U/g, p < 0,05; polmone: [11.70 ± 1.31] U/g vs. [1,56 ± 0,45] U/g, p < 0,001) sono stati trovati in topi SAP (Figura 6).

Inoltre, rispetto ai topi di controllo, i topi SAP hanno dimostrato una compromissione delle funzioni epatiche e renali, come illustrato dai seguenti indici: ALT ([164,36 ± 47,66] U/L vs. [77,15 ± 31,06] U/L, p < 0,001), AST ([222,35 ± 82,13] U/L vs. [116,61 ± 64,79] U/L, p < 0,01), azoto ureico nel sangue (BUN) ([37,59 ± 16,36] mM vs. [14,80 ± 3,74] mM, p < 0,001) e creatinina ([40,33 ± 11,53] μM vs. [28,66 ± 4,53] μM, p < 0,01) (Figura 7).

Figura 1. L'anatomia e la morfologia del pancreas del topo prima e dopo l'iniezione retrograda di taurocolato di sodio (TC) nel dotto biliopancreatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Decorso temporale dei cambiamenti di peso del controllo (n = 8) e pancreatite acuta grave (n = 11) topi. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Monitoraggio della curva di sopravvivenza dei topi di controllo (n = 8) e pancreatite acuta grave (n = 11). I numeri in blu e rosso rappresentano il numero di topi sopravvissuti in un punto temporale specifico nei gruppi di controllo e SAP, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Istopatologia dei tratti pancreatici da topi di controllo e pancreatite acuta grave (SAP). La freccia nera indica l'infiltrazione delle cellule infiammatorie, la freccia rossa indica sanguinamento, il triangolo nero invertito indica la necrosi acinare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Punteggi di istologia. Punteggi istologici (inclusi edema, necrosi, infiammazione, emorragia e punteggi totali) della sezione pancreas da topi di controllo e pancreatite acuta grave (SAP). Ogni punto nero rappresenta il punteggio corrispondente da un mouse. ns: non significativo; **p < 0,01; p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Valutazione sierologica dell'amilasi e della lipasi e determinazione dell'attività della mieloperossidasi pancreatica e polmonare (MPO). Livelli significativamente aumentati di amilasi, lipasi e MPO del pancreas e del polmone sono stati trovati nei topi SAP rispetto ai topi di controllo. Un punto nero rappresenta un mouse. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). *p < 0,05; p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Indici di funzionalità epatica (ALT: alanina aminotransferasi e AST: aspartato aminotransferasi) e indici di funzionalità renale (creatinina e BUN: azoto ureico nel sangue), nei topi di pancreatite acuta (SAP) di controllo e grave. Livelli significativamente aumentati di ALT, AST, BUN e creatinina sono stati trovati nei topi SAP rispetto ai topi di controllo. Un punto nero rappresenta un mouse. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il modello SAP indotto da TC è un eccellente strumento di ricerca. Come mostrato in questo studio, questo modello è molto facilmente realizzabile nei laboratori generali senza utilizzare dispositivi specifici. Se utilizzato in combinazione con l'istologia e l'analisi biochimica, fornisce un approccio basato sui costi (reagenti economici) e sul risparmio di tempo (finestra temporale di 24 ore) per indurre e valutare AP. La regolazione della concentrazione di TC offre anche la possibilità di produrre AP lieve e moderato. Perides et al. hanno anche impiegato TC per indurre SAP nei ^topi20, e la differenza principale era che utilizzavano una pompa per infusione TC, che può fornire una dose di infusione più accurata.

Secondo la nostra esperienza, durante il processo chirurgico della creazione del modello, i fattori più importanti includevano la piena esposizione del dotto biliopancreatico, la puntura liscia del microiniettore e l'iniezione di TC nel dotto biliopancreatico e nel dotto pancreatico a una velocità relativamente costante. Si dovrebbe prestare attenzione ai seguenti punti durante l'intervento chirurgico. In primo luogo, il duodeno deve essere estratto delicatamente per evitare l'applicazione di una forza eccessiva, che può causare necrosi duodenale. L'apertura del dotto biliopancreatico si trova lungo il bordo interno del duodeno (chiamato anche papilla duodenale) e il dotto biliopancreatico può essere successivamente localizzato. In caso di successo, la papilla duodenale bianca e i tubuli che modellano il dotto biliopancreatico e passano attraverso il pancreas a forma di foglia dovrebbero essere identificabili. Un'adeguata esposizione del dotto biliopancreatico dovrebbe facilitare le procedure successive. In secondo luogo, è necessario applicare una forza di trazione moderata quando si fissa il duodeno sul lato inferiore sinistro del mouse posto in posizione supina usando suture, raddrizzando così il dotto biliopancreatico senza perdita di tensione. Forze di trazione eccessive e insufficienti potrebbero causare rispettivamente la lacerazione della parete del duodeno e un'esposizione inadeguata del dotto biliopancreatico, che potrebbe influire negativamente sulla successiva puntura. Si consiglia un angolo verticale per garantire una puntura liscia quando il duodeno è fissato al lato inferiore sinistro utilizzando suture. Quindi, durante la puntura, assicurarsi che la direzione della puntura sia parallela alla direzione del dotto biliopancreatico. Durante la perforazione, il piano inclinato della punta dell'ago deve essere orientato verso il basso per passare attraverso la parete del duodeno e successivamente entrare nel dotto biliopancreatico, assicurandosi di utilizzare la forza appropriata per evitare di perforare il dotto biliopancreatico. Dopo una puntura di successo, non si deve avvertire alcuna resistenza quando si entra nel dotto biliopancreatico e la tensione della parete del dotto biliopancreatico deve essere avvertita quando si scuote delicatamente la punta dell'ago. Infine, durante la procedura, il duodeno deve essere mantenuto umido con soluzione salina normale calda per mantenere la sua attività.

Tuttavia, questo metodo ha anche alcune limitazioni. In primo luogo, la riproducibilità può essere influenzata da diverse reazioni alla TC da ciascun topo. Pertanto, è possibile eseguire un confronto accoppiato dei risultati corrispondenti di ciascun mouse per ridurre al minimo questi impatti. In secondo luogo, la lesione della papilla duodenale è un fenomeno comune durante il processo di puntura, che può anche causare pancreatite acuta. Pertanto, potrebbe essere necessario un tempo di formazione più lungo per sviluppare adeguate capacità chirurgiche per soddisfare questo metodo di modellazione. Inoltre, mantenere i topi di dimensioni adeguate potrebbe essere utile per garantire i risultati chirurgici.

Nonostante queste limitazioni, questo modello è uno dei modelli più utilizzati e meglio caratterizzati fino ad oggi per indurre AP e studiare nuove terapie e possibili eventi molecolari durante il processo di AP. Secondo studi precedenti, SAP indotto attraverso TC è stato anche descritto come adatto per la valutazione della terapia target perché la gravità raggiunta con questo modello è simile alla malattia umana e può essere facilmente riprodotta. È stato riportato che l'intervento di quercetina attenua il danno patologico pancreatico e ileale in questo modello SAP attraverso l'inibizione di TLR4/MyD88/p38 MAPK e l'attivazione dello stress del reticolo endoplasmatico (ERS)³¹. La somministrazione di CM4620, un bloccante selettivo del canale Orai1, potrebbe ridurre significativamente la gravità di questo modello SAP; la prevenzione dell'attivazione del tripsinogeno, della morte delle cellule acinari, dell'NF-κB e dell'attivazione del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) e delle risposte infiammatorie hanno dimostrato di servire come meccanismi ^{sottostanti32}. Oltre alla TC, l'acido taurolitocolico 3-solfato (TLCS) è un altro acido biliare frequentemente utilizzato nell'induzione AP. Come esaminato da Petersen et ^al.33, elevate concentrazioni di ioni calcio indotte da TLCS nelle cellule acinari potrebbero influenzare non solo la produzione intracellulare di ATP mitocondriale, ma anche altre cellule (acinari, stellati e macrofagi) situate nel pancreas tramite l'esocitosi degli ioni calcio; mentre, TC potrebbe esercitare danni indiretti alle cellule acinari attraverso il suo effetto sulle cellule stellate periacinari.

Pertanto, il modello SAP indotto da TC fornisce eccellenti informazioni sulla patogenesi dell'AP ed è uno strumento altamente rilevante per la convalida preclinica di nuovi farmaci. Inoltre, questo modello può essere adattato ad animali di grossa taglia per valutare ulteriormente gli effetti spiacevoli e inaspettati derivanti dalle terapie per il trattamento dell'AP.