Biliopankreatik Kanala Sodyum Taurocholate Retrograd Enjeksiyonu Kullanılarak Fare Şiddetli Akut Pankreatit Modelinin Kurulması

Akut pankreatit (AP), ana pankreasın tıkanması ve daha sonra düktal distansiyon ve pankreas otodijsiyonunun anormal şekilde aktive edilen enzimleri tarafından engellenmesi ile karakterize pankreasın akut iltihabıdır. Klinik bulguları lokal veya sistemik inflamasyon, karın ağrısı ve serum amilaz ^{yüksekliği1,2'dir}. Şiddet sınıflandırmasına ^göre3, AP hafif, orta ve şiddetli formlarda ortaya çıkabilir ve bunların arasında şiddetli akut pankreatit (SAP), % 30'dan fazla ölüm oranı nedeniyle en endişe verici durumdur ^4.. Amerika Birleşik Devletleri'nde AP, 200.000'den fazla hastayı etkileyen hastaneye yatışın en yaygın nedenlerinden ^biridir5. Ayrıca, AP, özellikle SAP, her yıl artmakta ve genç yaş gruplarını ^{etkilememaktadır6}. Ancak mevcut klinik pratikte etkili tedavi seçenekleri eksikliği ^vardır6,7. Bu nedenle, AP'de yer alan moleküler mekanizmaları araştırmak ve böylece tedavi iyileştirmesini kolaylaştırmak gerekir.

AP'de yer alan mekanizmaları incelemek ve farklı tedavi yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek için köklü deneysel hayvan modelleri gereklidir. Transgenik ve nakavt suşlarının kolay erişilebilirliği ve in vivo değerlendirme için gerekli ilaç dozlarını en aza indiren küçük boyutları ile AP araştırmaları için fareler tercih edilmektedir. Bu nedenle, farelerde birkaç AP modeli ^{geliştirilmiştir8,9}.

Caerulein10 intravenöz uygulama yoluyla indüklenen hafif bir pankreatit sıçan modelinden çalışan Niederau ve arkadaşları, aynı ilaç ve enjeksiyon ^yolu11 kullanılarak indüklenen acınar hücre nekrozu ile sunulan bir SAP fare modeli geliştirdi. Bu model noninvazivlik, hızlı indüksiyon, geniş tekrarlanabilirlik ve uygulanabilirlik dahil olmak üzere çeşitli avantajlara sahip olsa da, en büyük dezavantaj, çoğu durumda sadece hafif bir AP formunun geliştirilmesi ve böylece klinik alaka düzeyini sınırlamasıdır. Alkol AP'nin başlıca etiyolojik faktörlerinden biri olarak kabul edilir; Bununla birlikte, Foitzik ve arkadaşları pankreas hasarına sadece ekzokrin hiperstimülasyon12 gibi diğer faktörlerle birleştirildiğinde neden olduğunu bildirdi. Ayrıca, alkol kaynaklı AP modelleri farklı yönetim yolları üzerinden geliştirilmiş ve ilaç dozları ^13,14,15 bildirilmiştir, ancak en büyük dezavantajları bunları yeniden üretmenin zorluğudur. L-arginin intraperitoneal yönetimi de farelerde AP'ye neden ^olabilir16; ancak düşük klinik ilgisi uygulamasını engellemez. Bir safra tuzu olan taurocholate, ilk olarak 1965 yılında Creutzfeld ve arkadaşları tarafından pankreas kanalı infüzyonu yoluyla insan AP'lerine benzeyen bir durumu teşvik ettiği için önerildi17. Patofizyolojide klinik ilgisi ile ilgili tartışmalar olsa ^da18,19, taurocholate kaynaklı pankreatit SAP için vazgeçilmez bir model olmaya devam etmektedir.

Bu modelin farkına varmak basit olduğundan ve farelerde de etkili olduğundan, şimdi küçük hayvan in vivo çalışmaları için en çok kullanılan AP modellerinden biridir. Perides ve arkadaşları, ^mice20'de SAP'yi teşvik etmek için sodyum taurocholate (TC) çalıştırdı ve patolojisini anlamak için içgörüler sağladı. Genetik modifikasyon teknikleri ile birlikte, bu model AP'de yer alan birkaç spesifik geni doğrulamamızı sağladı. Örneğin, Bicozo ve ark. CD38 geninin bir nakavtının BIR TC-infüzyon pankreatit modeline karşı korunduğunu gösterdi ve mekanizmaları hücre içi ^Ca2+ sinyalizasyonundaki değişikliklere ^bağladı21. Fanczal ve ark., fare pankreas acinar ve düktal hücrelerin plazma zarında TRPM2 ekspresyonunun fizyolojik etkilerini araştırdı ve TRPM2 nakavt farelerinde TC kaynaklı SAP'nin şiddetinin azaldığını ^gösterdi22. Ayrıca, bu model aynı zamanda birçok yeni ilacı vivo olarak test etmek için basit ve etkili bir yol sağlar. Örneğin, bu yöntem kafeinin terapötik etkilerinin doğrulanmasını ^sağladı23, dehidrokolik ^asit24 ve çeşitli antioksidanlar ve antikoagülanlar25,26. Bu kanıt, TC kaynaklı SAP modelinin çok yönlülüğünü göstermektedir. Wittel ve arkadaşları benzer bir fare ^modeli27 tanımlasa da, uygulama prosedürleriyle ilgili ayrıntıların eksikliği bulguların yeniden üretilememesine neden olabilir. Bu makalede, basit bir ev yapımı mikrosentemi kullanarak yöntemlere odaklanıyoruz ve TC kaynaklı SAP'yi inceliyoruz, böylece sadece AP patogenezinin ve tedavisinin daha fazla incelenmesi için değil, aynı zamanda diğer birçok madde için mükemmel bir şekilde uyarlanabilir deneysel bir yöntem için de olası rehberlik sağlıyoruz.

Hayvanları içeren tüm deneyler Soochow Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı. Tüm cerrahi işlemler tam anestezi altında yapıldı. Analjezikler, önceki literatürlere göre hastalığın doğal seyrine müdahaleyi önlemek için ^{kullanılmamıştır28,29}. Analjezi eksikliği için onay, Soochow Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından da verildi.

1. Hazırlık

1. Ameliyattan önce C57BL/6 vahşi tip fareyi 8-12 saat hızlı kullanın.
2. %0,9 sodyum klorüre seyreltilmiş %5 (w/v) TC çözeltisi (93 mM) hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm filtreden filtreleyin.
3. Forseps, makas, bıçak tutucu, iğne tutucu, hemostatik klips, vasküler kelepçeler ve steril perdeler de dahil olmak üzere cerrahi aletleri ve malzemeleri 30 dakika boyunca 121 °C sıcaklıkta basınç sterilizatörü kullanarak otoklavlayın.
4. Ev yapımı bir mikrosentez hazırlayın. Bunu yapmak için, 25 μL düz uç Microliter şırıngasına manuel olarak tek kullanımlık bir insülin ucu ve uzun süreli bir plastik pipet ucu takın. Işıtlama yoluyla sterilize edin.

2. Anestezi ve ameliyat öncesi hazırlık

1. 6 ila 8 haftalık erkek C57BL/6 vahşi tip fare (yaklaşık 21-23 g) ağırlığındadır. 50 mg/kg dozda %1 pentobarbital sodyum çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonu ile genel anesteziye neden olabilir.
2. Fareyi bantla anirradiatedfoam düz plaka üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
3. Sol ve sağ tarafları ön aksiller çizgiye paralel olarak, xiphoid proses seviyesinden bilateral ön üst iliak omurganın bağlantı hattına kadar bir depilasyon kremi ile kürkünü çıkararak her hayvanın operasyon bölgesini hazırlayın.
4. Özellikle cerrahi alana odaklanan, hayvan üzerinde ve cerrahın önünde hazırlanan alandan oluşan steril bir cerrahi alan hazırlayın.
   1. Tezgah üstü dezenfekte edin.
   2. Kesi bölgesini birden fazla cerrahi ovma solüsyonu uygulaması ile temizleyin. Cildi% 0,5 iodoforla iki ila üç kez silin ve her seferinde 1-2 dakika kurumasını bekleyin.
   3. Fareyi steril perdelerle örtün.

3. Cerrahi prosedür

NOT: Şekil 1'de , TC'nin mikroenjeksiyon ile biliopankreatik kanala retrograd enjeksiyonundan önce ve sonra fare pankreasının anatomisi ve morfolojisi açıkalmaktadır.

1. Yaklaşık 2 ila 3 cm uzunluğunda ortanca karın kesiği yapın.
2. Duodenumu mide boyunca soldan sağa doğru bulun. Pankreası, biliopankreatik kanalı ve duodenal papillayı açığa çıkarmak için cerrahi tokmaklar ve dezenfektanla ıslatılmış pamuklu çubuk kullanarak duodenumu yavaşça dışarı ve sol tarafa çekin. Bağırsak duvarına veya ilgili damarlara yaralanmamaya dikkat edin.
3. 8-0 kullan papillanın etrafındaki duodenum ve pankreas arasındaki bağlantıdan geçmek için dikişler ve duodenumu düzeltmek için fare gövdesinin sol tarafına çekin.
4. Cildi ve karaciğerin alt kenarını yavaşça kenara çekin. Portal damarı veya pankreası sıkıştırmamaya dikkat larak ortak hepatik kanalı kelepçeleyin. Proksimal biliopankreatik kanalı kelepçeleyin.
5. Mikroenjektörü distal biliopankreatik kanala geriye dönük olarak delin. İğne ucunu duodenal papillanın yakınına bir kelepçe ile sabitleyin. Pankreas kanalına 5 μL/dk hızında %5 TC'nin 10 μL'sini aşılayın.
6. Sabit bir basınç elde etmek için biliopankreatik kanalı 5 dakika kapalı tutun. Ardından, mikroenjektörü çıkarın ve kelepçeleri çıkarın.
7. Duodenumu orijinal anatomik konuma getirin ve kanamayı kontrol edin.
8. Yarayı 6-0 dikişle kapatın ve% 0.5 iodofor ile dezenfekte edin.

4. İyileşme ve ameliyat sonrası yönetim

1. Hayvanları 37 °C termal ped üzerinde anesteziden kurtarın. Tüm hayvanlar uyanana kadar ameliyat edilen hayvanları zamansal ameliyat sonrası odaya göndermeyin.
2. Sıvı takviyesi için 0,8 mL%0,9 salin deri altı ve yavaşça yönetin.
3. Hayvanları ameliyat sonrası genel durumları ve enfeksiyon veya hastalık belirtileri açısından izleyin.

5. Serolojik test ve histoloji değerlendirmesi

1. Ameliyat sonrası 24 saat, aynı doz ve enjeksiyon rotasını kullanarak fareleri pentobarbital sodyum ile uyuşturun.
2. Tüm kanı abdominal aorttan toplayın (fare başına yaklaşık 0,8 mL) ve serumu daha fazla test için izole etmek için 15 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
3. Pankreas dokularını toplayın.
4. Akciğer dokularını toplamak için göğüs boşluğunu açın.
5. Amilaz, lipaz, karaciğer fonksiyonu (alanin transaminaz (ALT) ve aspartat transaminaz (AST)) ve böbrek fonksiyonu (üre ve kreatin) dahil olmak üzere serumdan biyokimya fonksiyon indekslerini, üreticilerin talimatlarına göre ticari kitler kullanarak ölçün.
6. Akciğer ve pankreas dokularını homojenize edin ve üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanarak miyeoperoksidaz (MPO) seviyesini ölçün.
7. Torasik boşluğu açın ve 20 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez perfüze edin, ardından pankreası toplayın. 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine dalın. Bir dizi alkol konsantrasyonunda susuz kalsın ve parafin içine gömün.
8. 5 μm kalınlığında pankreas dokusu bölümleri hazırlamak için bir mikrotom kullanın.
9. Pankreasın histolojik değerlendirmesi için H&E lekeleme gerçekleştirin.
10. Patolojik puanları Schmidt ve ^ark.30 tarafından önerilen kriterlere göre değerlendirin.

Yukarıdaki talimatları dikkatle izleyerek, yaklaşık 40 dakikalık ortalama bir ameliyat süresi elde ettik. Fareler hafif hareketsizdi ve operasyon sonrası sırasıyla 24 saat, 48 saat ve 72 saat'te yaklaşık 0.5-1.75 g, 0.85-1.85 g ve 0.5-4.73 g ağırlık kaybetmişti (Şekil 2).

Ameliyat tamamlandığından ameliyat sonrası 24 saate kadar, hastalık geliştikçe fareler aktif hale geldi ve yavaş yanıtlar ve eylemler gösterdi.

Kontrol ve SAP farelerinin sağkalım oranları operasyon sonrası 72 saat olarak sırasıyla %100 (8/8) ve %72,7 (8/11) idi (Şekil 3).

Pankreas bölümlerinden elde edilen H&E boyama (Şekil 4) ve patolojik skor (Şekil 5) sonuçlarına göre, belirgin ödem (puan: 3.14 ± 0.51 vs. 0.10 ± 0.08), inflamasyon (skor: 1.41 ± 0.81 ve nekroz (skor: 3.03 ± 0.77 vs. 0) SAP farelerinde kontrol farelerine göre gözlenebilir. Bu arada, her iki fare grubunda da kanamada önemli bir değişiklik bulunamadı (puan: 0.125 ± 0.31 vs. 0), SAP farelerinde önemli ölçüde yüksek toplam patoloji puanına neden oldu (puan: 7.72 ± 1.61 ve 0.10 ± 0.08).

Ayrıca, kontrol farelerininkine kıyasla, önemli ölçüde artmış amilaz seviyeleri ([46,740,32 ± 12,801,30] U/L vs. [3,324,40 ± 753,66] U/L, s < 0,001), lipaz ([545,02 ± 356,28] U/L vs. [18.32 ± 25.22] U/L, s < 0.05) ve pankreas ve akciğer MPO (pankreas: [5.5.5) 18 ± 3.26] U/g ile karşı [0.71 ± 0.41] U/g, p < 0.05; akciğer: [11.70 ± 1.31] SAP farelerinde U/g ile [1.56 ± 0.45] U/g, s < 0.001) bulundu (Şekil 6).

Buna ek olarak, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, SAP fareleri aşağıdaki indekslerde gösterildiği gibi karaciğer ve böbrek fonksiyonlarında bozulma gösterdi: ALT ([164.36 ± 47.66] U/L ile [77.15 ± 31.06] U/L, p < 0,001), AST ([222,35 ± 82,13] U/L karşılaştırması [116,61 ± 64,79] U/L, p < 0,01), kan üre azot (BUN) ([37,59 ± 16,36] mM ve [14,80 ± 3,74] mM, s < 0.001) ve kreatinin ([40.33 ± 11.53] μM ve [28.66 ± 4.53] μM, p < 0.01) (Şekil 7).

Şekil 1. Fare pankreasının anatomisi ve morfolojisi, sodyum taurokolat (TC) retrograd enjeksiyonundan önce ve sonra biliopankreatik kanala enjekte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Kontrol (n = 8) ve şiddetli akut pankreatit (n = 11) farelerin ağırlık değişimlerinin zaman seyri. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Kontrol (n = 8) ve şiddetli akut pankreatit (n = 11) farelerin sağkalım eğrisi izlenmesi. Mavi ve kırmızıdaki sayılar, sırasıyla kontrol ve SAP gruplarında belirli bir zaman noktasında hayatta kalan farelerin sayısını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Kontrolden ve şiddetli akut pankreatit (SAP) farelerinden pankreas bölümlerinin histopatolojisi. Siyah ok enflamatuar hücrelerin sızmayı, kırmızı ok kanamayı, siyah ters üçgen acinar nekrozu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Histoloji puanları. Kontrol ve şiddetli akut pankreatit (SAP) farelerinden pankreas bölümünün histoloji skorları (ödem, nekroz, iltihaplanma, kanama ve toplam skorlar dahil). Her siyah nokta, bir fareden karşılık gelen puanı temsil eder. ns: önemli değil; **p < 0,01; s < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Amilaz ve lipazın serolojik değerlendirilmesi ve pankreas ve akciğer miyeoperoksidaz (MPO) aktivitesinin belirlenmesi. SAP farelerinde fareleri kontrol etmeye göre önemli ölçüde artmış amilaz, lipaz ve pankreas ve akciğer MPO seviyeleri bulunmuştur. Bir siyah nokta bir fareyi temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. *p < 0,05; s < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7. Karaciğer fonksiyon indeksleri (ALT: alanin aminotransferaz ve AST: aspartat aminotransferaz) ve böbrek fonksiyon indeksleri (kreatinin ve BUN: kan üre azot), kontrol ve şiddetli akut pankreatit (SAP) fareleri. SAP farelerinde kontrol farelerine göre önemli ölçüde artmış ALT, AST, BUN ve kreatinin seviyeleri bulunmuştur. Bir siyah nokta bir fareyi temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. *p < 0,05; **p < 0,01; s < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

TC kaynaklı SAP modeli mükemmel bir araştırma aracıdır. Bu çalışmada gösterildiği gibi, bu model belirli cihazlar kullanmadan genel laboratuvarlarda çok kolay bir şekilde gerçekleştirilir. Histoloji ve biyokimyasal analiz ile birlikte kullanıldığında, AP'yi indükleme ve değerlendirme için maliyet -(ucuz reaktifler) ve zaman kazandıran (24 saat aralığı) bir yaklaşım sağlar. TC konsantrasyonunun ayarlanması aynı zamanda hafif ve ılımlı AP üretme imkanı da sunar. Perides ve diğerleri ayrıca farelerde SAP'yi teşvik etmek için TC'yi ^kullandı20 ve en büyük fark, TC infüzyonu için bir pompa kullanmalarıydı. bu da daha doğru bir infüzyon dozu sağlayabilir.

Deneyimlerimize göre, model kuruluşunun cerrahi sürecinde, en önemli faktörler biliopankreatik kanalın tam olarak maruz kalması, mikroinjektörün pürüzsüz delinmesi ve TC'nin biliopankreatik kanala ve pankreas kanalına nispeten sabit bir hızda enjekte edilmesidir. Ameliyat sırasında aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir. İlk olarak, duodenum, duodenal nekroza neden olabilecek aşırı kuvvet uygulamasından kaçınmak için hafifçe çekilmelidir. Biliopankreatik kanalın açılması duodenumun iç kenarı boyunca (duodenal papilla olarak da adlandırılır) bulunur ve biliopankreatik kanal daha sonra bulunabilir. Başarılı olursa, biliopankreatik kanalı şekillendiren ve yaprak şeklindeki pankreastan geçen beyaz duodenal papilla ve tübüller tanımlanabilir olmalıdır. Biliopankreatik kanalın yeterli maruz kalması sonraki prosedürleri kolaylaştırmalıdır. İkinci olarak, duodenumu dikişler kullanılarak sırtüstü konuma yerleştirilen farenin sol alt tarafına sabitlerken orta derecede çekme kuvveti uygulanmalıdır, böylece biliopankreatik kanal gerginlik kaybı olmadan düzeltilmelidir. Aşırı ve yetersiz çekme kuvvetleri, duodenumun duvarının yırtılmasına ve biliopankreatik kanalın yetersiz maruz kalmasına neden olabilir ve bu da sonraki delinmeyi olumsuz yönde etkileyebilir. Duodenum dikişler kullanılarak sol alt tarafa sabitlendiğinde pürüzsüz bir delinme sağlamak için dikey bir açı önerilir. Daha sonra, delinme sırasında, delinme yönünün biliopankreatik kanalın yönüne paralel olduğundan emin olun. Delinirken, iğne ucunun eğimli düzlemi duodenum duvarından geçmek ve daha sonra biliopankreatik kanala girmek için aşağı doğru yönlendirilmeli ve biliopankreatik kanalın delinmesini önlemek için uygun kuvveti kullandığınızdan emin olmalıdır. Başarılı bir delinme sonrasında biliopankreatik kanala girerken direnç hissedilmemeli, iğne ucu hafifçe sallandığında biliopankreatik kanal duvarının gerginliği hissedilmelidir. Son olarak, işlem sırasında, duodenum aktivitesini korumak için sıcak normal salin ile nemli tutulmalıdır.

Ancak, bu yöntemin bazı sınırlamaları da vardır. İlk olarak, tekrarlanabilirlik her fareden TC'ye verilen farklı reaksiyonlardan etkilenebilir. Bu nedenle, bu etkileri en aza indirmek için her fareden karşılık gelen sonuçların eşleştirilmiş bir karşılaştırması yapılabilir. İkincisi, duodenal papillanın yaralanması, delinme işlemi sırasında akut pankreatite de neden olabilen yaygın bir fenomendir. Bu nedenle, bu modelleme yöntemini yerine getirmek için yeterli cerrahi becerileri geliştirmek için daha uzun bir eğitim süresi gerekebilir. Ek olarak, fareleri uygun bir boyutta tutmak cerrahi sonuçların sağlanması için faydalı olabilir.

Bu sınırlamalara rağmen, bu model AP'yi teşvik etmek ve AP sürecinde yeni tedavileri ve olası moleküler olayları araştırmak için bugüne kadar en yaygın kullanılan ve en iyi karakterize edilen modellerden biridir. Daha önceki çalışmalara göre, TC üzerinden indüklenen SAP'nin hedef tedavi değerlendirmesine uygun olduğu da tanımlanmıştır çünkü bu modelle elde edilen şiddet insan hastalığına benzer ve kolayca çoğaltılabilir. Quercetin müdahalesinin TLR4/MyD88/p38 MAPK inhibisyonu ve endoplazmik retikulum stresi (ERS) aktivasyonu ile bu SAP modelinde pankreas ve ileal patolojik hasarı hafiflettiği ^{bildirilmiştir31}. Seçici bir Orai1 kanal engelleyici olan CM4620'nin yönetimi, bu SAP modelinin şiddetini önemli ölçüde azaltabilir; tripinojen aktivasyonunun önlenmesi, acinar hücre ölümü, NF-φB ve aktif T hücrelerinin nükleer faktörü (NFAT) aktivasyonu ve inflamatuar yanıtların alttaki mekanizmalar olarak hizmet ettiği ^{gösterilmiştir32}. TC'ye ek olarak, taurolithokolik asit 3-sülfat (TLCS), AP indüksiyonunda sıklıkla kullanılan bir başka safra asididir. Petersen ve ^ark.33 tarafından incelenen gibi, TLCS tarafından acinar hücrelerde indüklenen yüksek kalsiyum iyon konsantrasyonları sadece hücre içi mitokondriyal ATP üretimini değil, aynı zamanda kalsiyum iyon eksositozu yoluyla pankreasta bulunan diğer hücreleri (acınar, yıldız ve makrofajlar) da etkileyebilir; Oysa TC, periacinar stellat hücreleri üzerindeki etkisi ile acınar hücrelere dolaylı hasar verebilir.

Bu nedenle, TC kaynaklı SAP modeli AP patogenezine mükemmel içgörüler sağlar ve yeni ilaçları klinik öncesi olarak doğrulamak için son derece alakalı bir araçtır. Ayrıca, bu model AP tedavisi için tedavilerden kaynaklanan hoş olmayan ve beklenmedik etkileri daha fazla değerlendirmek için büyük hayvanlara uyarlanabilir.