建立小鼠重症急性胰腺炎模型，将牛磺胆酸钠逆行注射到胆胰管中

急性胰腺炎（AP）是胰腺的急性炎症，其特征在于主胰管阻塞，随后导管扩张和胰腺自身消化不良。其临床表现包括局部或全身炎症、腹痛和血清淀粉酶升高^1，2。根据严重程度分类³，AP可以轻度，中度和重度形式出现，其中，重症急性胰腺炎（SAP）是最令人担忧的疾病，因为它的死亡率超过30%⁴。在美国，AP 是住院的最常见原因之一，影响了超过 200，000 名患者⁵。此外，AP，尤其是SAP，每年都在增加，并影响到较年轻的年龄组⁶。然而，在目前的临床实践中缺乏有效的治疗方案^6，7。因此，有必要探索AP中涉及的分子机制，从而促进治疗的改善。

需要完善的实验动物模型来研究AP所涉及的机制并评估不同治疗方式的有效性。由于转基因和敲除菌株易于获得，并且其体积小，从而最大限度地减少 了体内 评估所需的药物剂量，小鼠是AP研究的首选。因此，已经在小鼠中开发了几种AP模型^8，9。

Niederau等人从通过静脉内给药caerulein10诱导的轻度胰腺炎大鼠模型开始，开发了一种SAP小鼠模型，该模型使用相同的药物和注射途径¹¹诱导腺泡细胞坏死。尽管该模型具有几个优点，包括无创性，快速诱导性，广泛的可重复性和适用性，但主要缺点是在大多数情况下仅开发轻度形式的AP，从而限制了其临床相关性。酒精被认为是AP的主要病因之一;然而，Foitzik等人报告说，只有当与其他因素（例如外分泌过度刺激）结合使用时，它才会引起胰腺损伤¹²。此外，尽管通过不同的给药途径开发的酒精诱导的AP模型，并且已经报道了药物剂量^13，14，15，但它们的主要缺点是难以重现它们。腹膜内给予l-精氨酸也可以诱导小鼠^AP16;然而，其低临床相关性阻碍了其应用。牛磺胆酸盐是一种胆汁盐，由 Creutzfeld 等人于 1965 年首次提出，用于通过胰管输注诱导类似于人 AP 的疾病¹⁷。尽管在病理生理学中的临床相关性存在争议^18，19，但牛磺胆酸盐诱发的胰腺炎仍然是 SAP 不可或缺的模型。

由于该模型易于实现且对小鼠也有效，因此它现在是小动物 体内 研究最常用的AP模型之一。Perides等人使用牛磺胆酸钠（TC）在小鼠中诱导^SAP20，为了解其病理学提供了见解。结合基因修饰技术，该模型使我们能够确认AP中涉及的几个特定基因。例如，Bicozo等人表明，CD38基因的敲除可以防止TC输注胰腺炎模型，并将这些机制归因于细胞内^{Ca2 +} 信号传导的改变²¹。Fanczal等人研究了TRPM2在小鼠胰腺泡和导管细胞质膜中的生理意义，并证明了TC诱导的SAP在TRPM2敲除小鼠中的严重程度降低²²。此外，该模型还为 在体内测试许多新药提供了一种简单有效的方法。例如，该方法能够验证咖啡因²³，脱氢胆酸²⁴以及各种抗氧化剂和抗凝剂的治疗效果^25，26。这一证据证明了TC诱导的SAP模型的多功能性。尽管Wittel等人描述了类似的小鼠模型²⁷，但缺乏有关实现过程的详细信息可能导致无法重现这些发现。在本文中，我们重点介绍使用简单的自制微量注射器的方法，并研究TC诱导的SAP，从而不仅为进一步研究AP的发病机制和治疗提供了可能的指导，而且还为许多其他物质的完美适应性实验方法提供了可能的指导。

所有涉及动物的实验均获得苏州大学动物伦理委员会的批准。所有外科手术均在完全麻醉下进行。根据以前的文献，没有使用镇痛药来避免干扰疾病的自然过程^28，29。对缺乏镇痛药的认可也得到了苏州大学动物伦理委员会的批准。

1. 准备工作

1. 在手术前8-12小时快速使用C57BL / 6野生型小鼠。
2. 准备5%（w / v）TC溶液（93mM）稀释成0.9%氯化钠。通过0.22μm过滤器过滤溶液。
3. 高压灭菌手术器械和材料，包括镊子，剪刀，刀片架，针头支架，止血夹，血管夹和无菌窗帘，使用压力灭菌器在121°C的温度下30分钟。
4. 准备一个自制的微量注射器。为此，手动将一次性胰岛素吸头和延长的塑料移液器吸头安装到25μL扁平吸头微升注射器上。通过辐照灭菌。

2. 麻醉和术前准备

1. 称量6至8周龄的雄性C57BL / 6野生型小鼠（约21-23克）。腹膜内注射1%戊巴比妥钠溶液，剂量为50mg / kg，诱导全身麻醉。
2. 用胶带将鼠标固定在膨射泡沫平板上的仰卧位置。
3. 准备每只动物的手术区域，方法是用脱毛膏从xiphoid工艺水平向下到双侧前髂上脊柱的连接线，左右两侧平行于前腋窝线。
4. 准备一个无菌手术区域，特别关注手术区域，包括动物和外科医生前部准备的区域。
   1. 对台面进行消毒。
   2. 使用多次应用手术擦洗液清洁切口部位。用0.5%碘伏擦拭皮肤两到三次，每次让它干燥1-2分钟。
   3. 用无菌窗帘覆盖鼠标。

3. 外科手术

注： 图1 描述了通过显微注射将TC逆行注射到胆胰管之前和之后小鼠胰腺的解剖结构和形态。

1. 做一个大约2至3厘米长的腹部正中切口。
2. 沿着胃从左到右定位十二指肠。使用手术钳和消毒剂浸泡的棉签轻轻地将十二指肠拉出并向左侧拉出，以暴露胰腺，胆胰管和十二指肠。注意不要伤害肠壁或相关血管。
3. 使用 8-0缝合线通过十二指肠和周围胰腺之间的连接，并将它们拉到小鼠身体的左侧以固定十二指肠。
4. 轻轻地将皮肤和肝脏的下边缘拉到一边。钳夹肝总管，确保不要钳夹门静脉或胰腺。钳夹近端胆胰管。
5. 逆行将显微注射器刺入远端胆胰管。用钳子固定十二指肠附近的针尖。以5μL / min的速率将10μL的5%TC输注到胰管中。
6. 保持胆胰管闭合5分钟，以达到稳定的压力。然后，拉出微注射器并取下夹具。
7. 将十二指肠恢复到原始解剖位置并检查出血。
8. 用6-0缝合线闭合伤口，并用0.5%碘磷消毒。

4. 恢复和术后管理

1. 在37°C的热垫上从麻醉中恢复动物。在所有动物醒来之前，不要将手术动物送到术后时间室。
2. 皮下缓慢给药 0.8 mL 0.9% 生理盐水，以补充液体。
3. 术后监测动物的一般状况和感染或疾病的迹象。

5. 血清学检测和组织学评估

1. 在手术后24小时，使用相同的剂量和注射途径用戊巴比妥钠麻醉小鼠。
2. 从腹主动脉收集所有血液（每只小鼠约0.8mL），并以1，500× g 旋转15分钟以分离血清以进行进一步测试。
3. 收集胰腺组织。
4. 打开胸腔以收集肺组织。
5. 根据制造商的说明，使用商业试剂盒测量血清中的生化功能指标，包括淀粉酶，脂肪酶，肝功能（丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST））和肾功能（尿素和肌酸）。
6. 根据制造商的说明，对肺和胰腺组织进行均质化，并使用商业试剂盒测量髓过氧化物酶（MPO）水平。
7. 打开胸腔，用20 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注两次，然后收集胰腺。浸入4%多聚甲醛溶液中24小时。在一系列酒精浓度下脱水并嵌入石蜡中。
8. 使用切片机制备5μm厚的胰腺组织切片。
9. 进行H&E染色以评估胰腺的组织学。
10. 根据Schmidt等人提出的标准评估病理评分³⁰。

通过仔细遵循上述说明，我们获得了大约40分钟的平均手术持续时间。小鼠略微无活性，在术后24小时，48小时和72小时分别损失了约0.5-1.75g，0.85-1.85g和0.5-4.73g的重量（图2）。

从手术完成到手术后24小时，随着疾病的发展，小鼠变得不活跃，并表现出缓慢的反应和动作。

在术后72 h，对照组和SAP小鼠的存活率分别为100%（8/8）和72.7%（8/11）（图3）。

根据胰腺切片的H&E染色（图4）和病理评分（图5）结果，相对于对照小鼠，可以在SAP小鼠中观察到胰腺组织的明显水肿（评分：3.14±0.51对0.10±0.08），炎症（评分：1.41±0.81对0）和坏死（评分：3.03±0.77对0）。同时，两组小鼠的出血（评分：0.125±0.31对0）均未发现显着变化，导致SAP小鼠的总病理学评分显着升高（评分：7.72±1.61对0.10±0.08）。

此外，与对照小鼠相比，淀粉酶（[46，740.32±12，801.30] U / L与[3，324.40 ±753.66] U / L，p <0.001），脂肪酶（[545.02 ± 356.28] U / L vs. [18.32 ±25.22] U / L，p <0.05）的水平显着增加，胰腺和肺MPO（胰腺：[5.18±3.26] U / g vs. [0.71 ±0.41] U / g，p <0.05; 肺： [11.70 ± 1.31]在SAP小鼠中发现U / g与[1.56±0.45] U / g，p<0.001）（图6）。

此外，与对照组小鼠相比，SAP小鼠表现出肝肾功能受损，如以下指标所示：ALT（[164.36 ±47.66] U / L vs. [77.15 ± 31.06] U / L，p <0.001），AST（[222.35 ±82.13] U / L vs. [116.61 ± 64.79] U / L，p < 0.01），血尿素氮（BUN）（[37.59 ±16.36] mM vs. [14.80 ± 3.74] mM， p<0.001）和肌酐（[40.33 ±11.53] μM vs. [28.66 ± 4.53] μM，p < 0.01）（图7）。

图 1.将牛磺胆酸钠（TC）逆行注射到胆胰管之前和之后小鼠胰腺的解剖结构和形态。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2.对照组（n=8）和重症急性胰腺炎（n=11）小鼠体重变化的时间过程。 误差线表示标准偏差 （SD）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3.监测对照组（n = 8）和严重急性胰腺炎（n = 11）小鼠的生存曲线。 蓝色和红色的数字分别代表对照组和SAP组中特定时间点存活小鼠的数量。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4.对照组和重度急性胰腺炎（SAP）小鼠的胰腺切片的组织病理学。 黑色箭头表示炎症细胞浸润，红色箭头表示出血，黑色倒三角形表示腺泡坏死。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 5.组织学评分。 对照组和重度急性胰腺炎 （SAP） 小鼠的胰腺切片的组织学评分（包括水肿、坏死、炎症、出血和总评分）。每个黑点代表一个鼠标的相应分数。ns：不重要;**p < 0.01;p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 6.淀粉酶和脂肪酶的血清学评估以及胰腺和肺髓过氧化物酶（MPO）活性的测定。 相对于对照组，在SAP小鼠中发现淀粉酶，脂肪酶，胰腺和肺MPO水平显着增加。一个黑点代表一只鼠标。误差线表示标准偏差 （SD）。*p < 0.05;p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 7.对照和重度急性胰腺炎（SAP）小鼠的肝功能指数（ALT：丙氨酸氨基转移酶和AST：天冬氨酸氨基转移酶）和肾功能指数（肌酐和尿素氮：血尿素氮）。 相对于对照组，在SAP小鼠中发现ALT，AST，BUN和肌酐水平显着增加。一个黑点代表一只鼠标。误差线表示标准偏差 （SD）。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

TC诱导的SAP模型是一种出色的研究工具。如本研究所示，该模型在一般实验室中非常容易实现，而无需使用特定设备。当与组织学和生化分析结合使用时，它提供了一种成本（廉价的试剂）和省时（24小时时间窗口）的方法来诱导和评估AP。调整TC的浓度也提供了产生轻度和中度AP的可能性。Perides等人还使用TC在小鼠中诱导^SAP20，主要区别在于他们使用泵进行TC输注， 这可能提供更准确的输注剂量。

根据我们的经验，在模型建立的手术过程中，最重要的因素包括双胰管完全暴露，显微注射器的平滑穿刺，以及以相对恒定的速度将TC注射到胆胰管和胰管中。手术过程中应注意以下几点。首先，应轻轻地将十二指肠拉出，以避免过度用力，这可能导致十二指肠坏死。胆胰管的开口位于十二指肠的内缘（也称为十二指肠），随后可以定位胆胰管。如果成功，应可识别形成胆胰管并穿过叶状胰腺的白色十二指肠和小管。胆胰管的充分暴露应有助于后续手术。其次，当使用缝合线将十二指肠固定在置于仰卧位的小鼠左下方时，应施加适度的拉力，从而矫直胆胰管而不会失去张力。过度和不足的拉力可能分别导致十二指肠壁撕裂和胆胰管暴露不足，这可能会对随后的穿刺产生不利影响。建议使用垂直角度，以确保使用缝合线将十二指肠固定在左下侧时平滑穿刺。然后，在穿刺过程中，确保穿刺方向与胆胰管的方向平行。穿刺时，针尖的倾斜平面应朝下，穿过十二指肠壁，随后进入胆胰管，确保使用适当的力避免刺穿胆胰管。穿刺成功后，进入胆胰管时不应感到阻力，轻轻摇晃针尖时应感觉到胆胰管壁的张力。最后，在手术过程中，十二指肠应用温暖的生理盐水保持湿润，以保持其活性。

但是，此方法也有一些限制。首先，再现性可能受到每只小鼠对TC的不同反应的影响。因此，可以对来自每个鼠标的相应结果进行配对比较，以最大程度地减少这些影响。其次，十二指肠损伤是穿刺过程中的常见现象，也可引起急性胰腺炎。因此，可能需要更长的培训时间来发展足够的手术技能来实现这种建模方法。此外，保持小鼠合适的大小可能有助于确保手术结果。

尽管有这些局限性，但该模型是迄今为止使用最广泛和最具表征性的模型之一，用于诱导AP并研究AP过程中的新疗法和可能的分子事件。根据以前的研究，通过TC诱导的SAP也被描述为适合靶向治疗评估，因为该模型实现的严重程度与人类疾病相似，并且可以很容易地复制。据报道，槲皮素干预 通过 抑制TLR4 / MyD88 / p38 MAPK和内质网应激（ERS）激活来减轻该SAP模型中的胰腺和回肠病理损伤³¹。CM4620（一种选择性Orai1通道阻滞剂）的施用可以显着降低该SAP模型的严重性;预防胰蛋白酶原活化、腺泡细胞死亡、NF-κB和活化T细胞核因子（NFAT）活化和炎症反应被证明是潜在的机制³²。除TC外，牛磺酰氧胆酸3-硫酸盐（TLCS）是另一种经常用于AP诱导的胆汁酸。正如Petersen等人^所回顾的那样，TLCS在腺泡细胞中诱导的钙离子浓度升高不仅会影响细胞内线粒体ATP的产生，还会影响 通过 钙离子胞吐作用位于胰腺中的其他细胞（腺泡，星状细胞和巨噬细胞）;然而，TC可能 通过其 对星状周围细胞的影响对腺泡细胞造成间接损害。

因此，TC诱导的SAP模型为AP的发病机制提供了极好的见解，并且是临床前验证新药的高度相关工具。此外，该模型可以适用于大型动物，以进一步评估治疗AP的疗法所产生的不愉快和意想不到的效果。