Summary
गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के एक माउस मॉडल यहाँ वर्णित है। यहां प्रस्तुत प्रक्रिया बहुत तेज, सरल और सुलभ है, जिससे संभावित रूप से आणविक तंत्र के अध्ययन और एक सुविधाजनक तरीके से तीव्र अग्नाशयशोथ में विभिन्न चिकित्सीय हस्तक्षेपों की अनुमति मिलती है।
Abstract
तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी), विशेष रूप से गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एसएपी) का प्रसार, सालाना युवा आयु समूहों में बढ़ रहा है। हालांकि, वर्तमान नैदानिक अभ्यास में प्रभावी उपचार की कमी है। ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों और उनके छोटे आकार की आसान पहुंच के साथ, जो विवो मूल्यांकन में आवश्यक दवाओं की न्यूनतम खुराक की अनुमति देता है, चूहों में एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक मॉडल एपी अनुसंधान के लिए पसंद किया जाता है। इसके अलावा, सोडियम टॉरोकोलेट (टीसी) के माध्यम से प्रेरित एसएपी वर्तमान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले और सबसे अच्छी विशेषता वाले मॉडलों में से एक है। इस मॉडल को एपी की प्रक्रिया के दौरान उपन्यास उपचार और संभावित आणविक घटनाओं के लिए जांच की गई है। यहां, हम सोडियम टॉरोकोलेट और एक साधारण घर का बना माइक्रोसिरिंज का उपयोग करके एक एपी माउस मॉडल की पीढ़ी प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम बाद के हिस्टोलॉजी और सीरोलॉजिकल परीक्षण के लिए पद्धति भी प्रदान करते हैं।
Introduction
तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) अग्न्याशय की एक तीव्र सूजन है जो बाद के डक्टल डिस्टेंशन और अग्न्याशय ऑटोडाइजेशन के साथ मुख्य अग्नाशयी वाहिनी की रुकावट की विशेषता है जो इसके असामान्य रूप से सक्रिय एंजाइमों द्वारा है। इसकी नैदानिक अभिव्यक्तियों में स्थानीय या प्रणालीगत सूजन, पेट में दर्द, और सीरम एमाइलेज 1,2 की ऊंचाई शामिल है। गंभीरता वर्गीकरण 3 के अनुसार, एपी हल्के, मध्यम और गंभीर रूपों में मौजूद हो सकता है, और उनमें से, गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एसएपी) 30% से अधिक की उच्च मृत्यु दर के कारण सबसे अधिक संबंधित स्थिति है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, एपी अस्पताल में भर्ती होने के सबसे आम कारणों में से एक है, जो 200,000 से अधिक रोगियों को प्रभावित करता है। इसके अलावा, एपी, विशेष रूप से एसएपी, सालाना बढ़ रहा है और युवा आयु समूहों को प्रभावित कर रहा है। हालांकि, वर्तमान नैदानिक अभ्यास 6,7 में प्रभावी उपचार विकल्पों की कमी है। इसलिए, एपी में शामिल आणविक तंत्र का पता लगाना आवश्यक है, जिससे उपचार में सुधार की सुविधा मिलती है।
एपी में शामिल तंत्र का अध्ययन करने और विभिन्न उपचार पद्धतियों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों और उनके छोटे आकार की आसान पहुंच के साथ, जो विवो मूल्यांकन में आवश्यक दवाओं की खुराक को कम करता है, चूहों को एपी अनुसंधान के लिए पसंद किया जाता है। इसलिए, एपी के कई मॉडल चूहों 8,9 में विकसित किए गए हैं।
caerulein10 के अंतःशिरा प्रशासन के माध्यम से प्रेरित एक हल्के अग्नाशयशोथ चूहे मॉडल से काम करते हुए, Niederau et al. एक ही दवा और इंजेक्शन route11 का उपयोग कर प्रेरित acinar सेल परिगलन के साथ प्रस्तुत एक एसएपी माउस मॉडल विकसित किया। यद्यपि इस मॉडल में noninvasiveness, तेजी से प्रेरण, व्यापक reproducibility, और प्रयोज्यता सहित कई फायदे हैं, प्रमुख नुकसान यह है कि ज्यादातर मामलों में एपी का केवल एक हल्का रूप विकसित किया जाता है, जिससे इसकी नैदानिक प्रासंगिकता सीमित हो जाती है। अल्कोहल को एपी के प्रमुख etiologic कारकों में से एक माना जाता है; हालांकि, Foitzik et al. ने बताया कि यह अग्नाशय की चोट का कारण बनता है जब अन्य कारकों के साथ संयुक्त होता है, जैसे कि एक्सोक्राइन हाइपरस्टिमुलेशन 12। इसके अलावा, हालांकि विभिन्न प्रशासन मार्गों के माध्यम से विकसित शराब-प्रेरित एपी मॉडल, और दवा की खुराक 13,14,15 की सूचना दी गई है, उनका प्रमुख नुकसान उन्हें पुन: उत्पादन करने में कठिनाई है। एल-आर्जिनिन के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन भी चूहों 16 में एपी को प्रेरित कर सकते हैं; हालांकि, इसकी कम नैदानिक प्रासंगिकता इसके आवेदन में बाधा डालती है। टॉरोकोलेट, एक पित्त नमक, पहली बार 1965 में Creutzfeld et al. द्वारा अग्नाशयी वाहिनी infusion17 के माध्यम से मानव एपी जैसी स्थिति को प्रेरित करने के लिए प्रस्तावित किया गया था। यद्यपि pathophysiology18,19 में इसकी नैदानिक प्रासंगिकता के बारे में विवाद मौजूद हैं, टॉरोकोलेट-प्रेरित अग्नाशयशोथ एसएपी के लिए एक अपरिहार्य मॉडल बना हुआ है।
जैसा कि यह मॉडल महसूस करना आसान है और चूहों में भी प्रभावी है, यह अब विवो अध्ययन में छोटे जानवरों के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले एपी मॉडल में से एक है। Perides et al. ने चूहों 20 में SAP को प्रेरित करने के लिए सोडियम टॉरोकोलेट (टीसी) को नियोजित किया, जो इसकी विकृति को समझने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। आनुवांशिक संशोधन तकनीकों के साथ संयुक्त, इस मॉडल ने हमें एपी में शामिल कई विशिष्ट जीनों की पुष्टि करने की अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, Bicozo et al. से पता चला है कि CD38 जीन के एक नॉकआउट ने टीसी-इन्फ्यूजन अग्नाशयशोथ के एक मॉडल के खिलाफ संरक्षित किया और इंट्रासेल्युलर Ca2 + सिग्नलिंग 21 में परिवर्तन के लिए तंत्र को जिम्मेदार ठहराया। Fanczal et al. माउस अग्नाशय acinar और डक्टल कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में TRPM2 अभिव्यक्ति के शारीरिक निहितार्थ की जांच की, और TRPM2 नॉकआउट mice22 में TC-प्रेरित SAP की कम गंभीरता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, यह मॉडल विवो में कई उपन्यास दवाओं का परीक्षण करने का एक सरल और प्रभावी तरीका भी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इस विधि ने कैफीन 23, डिहाइड्रोकोलिक एसिड 24, और विभिन्न एंटीऑक्सिडेंट और एंटीकोआगुलंट्स 25,26 के चिकित्सीय प्रभावों के सत्यापन को सक्षम किया। यह सबूत टीसी-प्रेरित एसएपी मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है। हालांकि Wittel et al. ने एक समान माउस मॉडल 27 का वर्णन किया है, कार्यान्वयन प्रक्रियाओं पर विवरण की कमी के परिणामस्वरूप निष्कर्षों को पुन: पेश करने में असमर्थता हो सकती है। इस लेख में, हम एक साधारण होममेड माइक्रोसिरिंज का उपयोग करने और टीसी-प्रेरित एसएपी का अध्ययन करने के तरीकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिससे न केवल एपी के रोगजनन और उपचार के आगे के अध्ययन के लिए संभव मार्गदर्शन प्रदान किया जाता है, बल्कि कई अन्य पदार्थों के लिए पूरी तरह से अनुकूलनीय प्रयोगात्मक विधि के लिए भी।
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Protocol
जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों को Soochow University की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं को पूर्ण संज्ञाहरण के तहत किया गया था। एनाल्जेसिक का उपयोग पिछले साहित्य 28,29 के अनुसार बीमारी के प्राकृतिक पाठ्यक्रम के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए नहीं किया गया था। एनाल्जेसिया की कमी के लिए अनुमोदन भी Soochow विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति द्वारा प्रदान किया गया था।
1. तैयारी
- सर्जरी से पहले एक C57BL / 6 जंगली प्रकार माउस 8-12 घंटे तेज करें।
- 5% (w/v) TC समाधान (93 mM) तैयार करें, जिसे 0.9% सोडियम क्लोराइड में पतला किया गया हो। एक 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
- संदंश, कैंची, ब्लेड धारक, सुई धारक, हेमोस्टेटिक क्लिप, संवहनी क्लैंप, और बाँझ ड्रेप्स सहित सर्जिकल उपकरणों और सामग्रियों को आटोक्लेव करें, 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर दबाव स्टरलाइज़र का उपयोग करके।
- एक घर का बना माइक्रोसिरिंज तैयार करें। ऐसा करने के लिए, मैन्युअल रूप से एक डिस्पोजेबल इंसुलिन टिप और एक 25 μL फ्लैट टिप माइक्रोलीटर सिरिंज पर एक लंबे समय तक प्लास्टिक पिपेट टिप स्थापित करें। विकिरण के माध्यम से निष्फल.
2. संज्ञाहरण और प्रीपेरेटिव तैयारी
- वजन 6- से 8-सप्ताह के पुरुष C57BL / 6 जंगली प्रकार के चूहों (लगभग 21-23 ग्राम) है। 50 मिलीग्राम / किलोग्राम की खुराक पर 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम समाधान के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ सामान्य संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
- टेप के साथ anirradiatedfoam फ्लैट प्लेट पर सुपाइन स्थिति में माउस को ठीक करें।
- प्रत्येक जानवर के ऑपरेशन क्षेत्र को xiphoid प्रक्रिया स्तर से एक depilation क्रीम के साथ अपने फर को हटाने के द्वारा तैयार द्विपक्षीय पूर्वकाल बेहतर इलियाक रीढ़ की कनेक्टिंग लाइन के लिए नीचे, सामने एक्सिलरी लाइन के समानांतर बाएं और दाएं पक्षों के साथ।
- सर्जिकल क्षेत्र पर विशेष ध्यान देने के साथ एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें, जिसमें जानवर और सर्जन के सामने तैयार क्षेत्र शामिल है।
- बेंचटॉप को कीटाणुरहित करें।
- सर्जिकल स्क्रब समाधान के कई अनुप्रयोगों के साथ चीरा साइट को साफ करें। 0.5% आयोडोफोर के साथ त्वचा को दो से तीन बार पोंछें और इसे हर बार 1-2 मिनट के लिए सूखने दें।
- बाँझ drapes के साथ माउस को कवर.
3. सर्जिकल प्रक्रिया
नोट: चित्रा 1 माउस अग्न्याशय की शारीरिक रचना और आकृति विज्ञान को दर्शाता है, इससे पहले और बाद में माइक्रोइंजेक्शन द्वारा बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट में टीसी के प्रतिगामी इंजेक्शन।
- एक अनुमानित 2 से 3 सेमी लंबा माध्यिका पेट चीरा बनाओ।
- पेट के साथ बाएं से दाएं तक ग्रहणी का पता लगाएं। धीरे से ग्रहणी को बाहर खींचें और सर्जिकल संदंश और अग्न्याशय, बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट और ग्रहणी पैपिला को उजागर करने के लिए एक कीटाणुनाशक-भिगोए हुए कपास झाड़ू का उपयोग करके बाईं ओर खींचें। ध्यान रखें कि आंतों की दीवार या संबंधित वाहिकाओं को चोट न पहुंचे।
- 8-0 का उपयोग करें पपीला के चारों ओर ग्रहणी और अग्न्याशय के बीच संबंध के माध्यम से गुजरने के लिए टांके, और ग्रहणी को ठीक करने के लिए उन्हें माउस शरीर के बाईं ओर खींचें।
- धीरे से त्वचा और जिगर के निचले किनारे को एक तरफ खींचें। आम यकृत वाहिनी क्लैंप, पोर्टल नस या अग्न्याशय क्लैंप नहीं करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। समीपस्थ बिलिओपैन्क्रियाटिक नलिका को दबाएं।
- माइक्रोइंजेक्टर को डिस्टल बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट में प्रतिगामी रूप से पियर्स करें। एक क्लैंप के साथ ग्रहणी पैपिला के पास सुई की नोक को ठीक करें। 5 μL / मिनट की दर से अग्नाशयी वाहिनी में 5% टीसी के 10 μL infuse।
- एक स्थिर दबाव प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट को बंद रखें। फिर, माइक्रोइंजेक्टर को बाहर निकालें और क्लैंप को हटा दें।
- ग्रहणी को मूल शारीरिक स्थिति में पुनर्स्थापित करें और रक्तस्राव की जांच करें।
- 6-0 टांके के साथ घाव को बंद करें और 0.5% आयोडोफोर के साथ कीटाणुरहित करें।
4. वसूली और पश्चात प्रबंधन
- एक 37 डिग्री सेल्सियस थर्मल पैड पर संज्ञाहरण से जानवरों को पुनर्प्राप्त करें। जब तक सभी जानवर जाग नहीं जाते तब तक संचालित जानवरों को अस्थायी पश्चात के कमरे में न भेजें।
- 0.9% खारा चमड़े के नीचे और धीरे-धीरे द्रव पूरकता के लिए 0.8 मिलीलीटर प्रशासित करें।
- जानवरों को उनकी सामान्य स्थिति और संक्रमण या बीमारी के संकेतों के लिए पोस्टऑपरेटिव रूप से मॉनिटर करें।
5. सीरोलॉजिकल परीक्षण और histology मूल्यांकन
- ऑपरेशन के बाद 24 घंटे में, एक ही खुराक और इंजेक्शन मार्ग का उपयोग करके पेंटोबार्बिटल सोडियम के साथ चूहों को एनेस्थेटिक करें।
- पेट की महाधमनी (माउस प्रति लगभग 0.8 मिलीलीटर) से सभी रक्त एकत्र करें और आगे के परीक्षण के लिए सीरम को अलग करने के लिए 15 मिनट के लिए 1,500 x g पर स्पिन करें।
- अग्न्याशय ऊतकों को इकट्ठा करें।
- फेफड़ों के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए वक्ष गुहा खोलें।
- एमाइलेज, लाइपेस, यकृत समारोह (अलैनिन ट्रांसमिनेस (एएलटी) और एस्पार्टेट ट्रांसमिनेस (एएसटी)) और गुर्दे के कार्य (यूरिया और क्रिएटिन) सहित सीरम से जैव रसायन समारोह सूचकांकों को मापें, निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक किट का उपयोग करके।
- फेफड़े और अग्न्याशय के ऊतकों को homogenize और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर myeloperoxidase (एमपीओ) स्तर को मापने।
- वक्ष गुहा खोलें और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के 20 मिलीलीटर के साथ दो बार परफ्यूज करें, फिर अग्न्याशय को इकट्ठा करें। 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान में विसर्जित करें। अल्कोहल सांद्रता की एक श्रृंखला में निर्जलित करें और पैराफिन में एम्बेड करें।
- 5 μm मोटी अग्न्याशय ऊतक वर्गों को तैयार करने के लिए एक microtome का उपयोग करें।
- अग्न्याशय के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन करें।
- श्मिट एट अल.30 द्वारा प्रस्तावित मानदंडों के अनुसार पैथोलॉजिकल स्कोर का मूल्यांकन करें।
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Representative Results
ऊपर दिए गए निर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन करके, हमने लगभग 40 मिनट की औसत सर्जरी अवधि प्राप्त की। चूहे थोड़े निष्क्रिय थे और क्रमशः 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे के ऑपरेशन के बाद लगभग 0.5-1.75 ग्राम, 0.85-1.85 ग्राम और 0.5-4.73 ग्राम वजन खो चुके थे (चित्रा 2)।
सर्जरी के पूरा होने के समय से 24 घंटे के ऑपरेशन के बाद तक, जैसे-जैसे बीमारी विकसित हुई, चूहे निष्क्रिय हो गए और धीमी प्रतिक्रियाओं और कार्यों को दिखाया।
नियंत्रण और एसएपी चूहों की जीवित रहने की दर क्रमशः 100% (8/8) और 72.7% (8/11) थी, जो 72 घंटे के बाद ऑपरेशन (चित्रा 3) पर थी।
अग्न्याशय वर्गों से एच एंड ई धुंधला (चित्रा 4) और पैथोलॉजिकल स्कोर (चित्रा 5) परिणामों के अनुसार, स्पष्ट एडिमा (स्कोर: 3.14 ± 0.51 बनाम 0.10 ± 0.08), सूजन (स्कोर: 1.41 ± 0.81 बनाम 0), और नेक्रोसिस (स्कोर: 3.03 ± 0.77 बनाम 0) अग्न्याशय ऊतक के नियंत्रण चूहों के सापेक्ष एसएपी चूहों में देखा जा सकता है। इस बीच चूहों के दोनों समूहों में रक्तस्राव (स्कोर: 0.125 ± 0.31 बनाम 0) पर कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं पाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एसएपी चूहों में काफी ऊंचा कुल पैथोलॉजी स्कोर होता है (स्कोर: 7.72 ± 1.61 बनाम 0.10 ± 0.08)।
इसके अलावा, नियंत्रण चूहों की तुलना में, एमिलेज के स्तर में काफी वृद्धि हुई है ([46,740.32 ± 12,801.30] यू / एल बनाम [3,324.40 ± 753.66] यू / एल, पी < 0.001), लाइपेस ([545.02 ± 356.28] यू < / एल बनाम ± [18.32 ± ± 25.22] यू / एल < 0.25 < 0.22) [11.70 ± 1.31] U/g बनाम [1.56 ± 0.45] U/g, p < 0.001) SAP चूहों (चित्रा 6) में पाए गए थे।
इसके अलावा, नियंत्रण चूहों की तुलना में, SAP चूहों ने बिगड़ा हुआ जिगर और गुर्दे के कार्यों का प्रदर्शन किया, जैसा कि निम्नलिखित सूचकांकों द्वारा दर्शाया गया है: ALT ([164.36 ± 47.66] U/L बनाम [77.15 ± 31.06] U/L, p < 0.001), AST ([222.35 ± 82.13] U/< L बनाम [116.61 ± 64.79] U/L बनाम [116.61 ± ± 64.7 ±9] U/L बनाम [116.61 ± 04.00] पी < 0.001) और क्रिएटिनिन ([40.33 ± 11.53] μM बनाम [28.66 ± 4.53] μM, p < 0.01) (चित्रा 7)।
चित्र 1. माउस अग्न्याशय की शरीर रचना और आकृति विज्ञान से पहले और बाद में सोडियम टॉरोकोलेट (टीसी) के प्रतिगामी इंजेक्शन को बिलिओपैन्क्रियाटिक नलिका में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. नियंत्रण (एन = 8) और गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एन = 11) चूहों के वजन में परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. नियंत्रण (एन = 8) और गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एन = 11) चूहों की उत्तरजीविता वक्र निगरानी। नीले और लाल रंग में संख्याएं क्रमशः नियंत्रण और एसएपी समूहों में एक विशिष्ट समय बिंदु पर जीवित चूहों की संख्या का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4. नियंत्रण और गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एसएपी) चूहों से अग्नाशय के वर्गों के हिस्टोपैथोलॉजी। काला तीर भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ को इंगित करता है, लाल तीर रक्तस्राव को इंगित करता है, काला उलटा त्रिकोण एसिनर नेक्रोसिस को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5. हिस्टोलॉजी स्कोर। नियंत्रण और गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (एसएपी) चूहों से अग्न्याशय अनुभाग के हिस्टोलॉजी स्कोर (एडिमा, नेक्रोसिस, सूजन, रक्तस्राव और कुल स्कोर सहित)। प्रत्येक काला बिंदु एक माउस से संबंधित स्कोर का प्रतिनिधित्व करता है। एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; ** पी < 0.01; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6. एमाइलेज और लाइपेस का सीरोलॉजिकल मूल्यांकन और अग्न्याशय और फेफड़ों के मायलोपेरोक्सीडेस (एमपीओ) गतिविधि का निर्धारण। एमाइलेज, लाइपेस, और अग्न्याशय और फेफड़ों के एमपीओ के स्तर में काफी वृद्धि हुई है जो चूहों को नियंत्रित करने के सापेक्ष एसएपी चूहों में पाए गए थे। एक काला बिंदु एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. * पी < 0.05; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7. जिगर समारोह अनुक्रमणिका (ALT: alanine aminotransferase, और AST: aspartate aminotransferase) और गुर्दे समारोह सूचकांक (क्रिएटिनिन और BUN: रक्त यूरिया नाइट्रोजन), नियंत्रण और गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (SAP) चूहों में। एएलटी, एएसटी, बीयूएन और क्रिएटिनिन के स्तर में काफी वृद्धि हुई है, जो चूहों को नियंत्रित करने के सापेक्ष एसएपी चूहों में पाए गए थे। एक काला बिंदु एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
टीसी प्रेरित एसएपी मॉडल एक उत्कृष्ट अनुसंधान उपकरण है। जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है, इस मॉडल को विशिष्ट उपकरणों को नियोजित किए बिना सामान्य प्रयोगशालाओं में बहुत आसानी से महसूस किया जाता है। जब हिस्टोलॉजी और जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो यह एपी को प्रेरित करने और मूल्यांकन करने के लिए लागत- (सस्ती अभिकर्मक) और समय-बचत (24 घंटे की समय खिड़की) दृष्टिकोण प्रदान करता है। टीसी की एकाग्रता को समायोजित करने से हल्के और मध्यम एपी के उत्पादन की संभावना भी मिलती है। पेरिडेस एट अल ने चूहों 20 में एसएपी को प्रेरित करने के लिए टीसी को भी नियोजित किया, और प्रमुख अंतर यह था कि उन्होंने टीसी जलसेक के लिए एक पंप का उपयोग किया, जो एक और अधिक सटीक जलसेक खुराक प्रदान कर सकते हैं.
हमारे अनुभव के अनुसार, मॉडल स्थापना की सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान, सबसे महत्वपूर्ण कारकों में बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट का पूर्ण एक्सपोजर, माइक्रोइंजेक्टर का चिकनी पंचर, और बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट में टीसी का इंजेक्शन और अपेक्षाकृत स्थिर गति से अग्नाशयी वाहिनी शामिल थी। सर्जरी के दौरान निम्नलिखित बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, ग्रहणी को अत्यधिक बल के आवेदन से बचने के लिए धीरे से बाहर निकाला जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप ग्रहणी नेक्रोसिस हो सकता है। बिलिओपैन्क्रियाटिक नलिका का उद्घाटन ग्रहणी के आंतरिक किनारे के साथ स्थित है (जिसे ग्रहणी पैपिला भी कहा जाता है), और बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट को बाद में स्थित किया जा सकता है। यदि सफल होता है, तो सफेद ग्रहणी पैपिला और नलिकाएं जो बिलिओपैन्क्रियाटिक नलिका को आकार देती हैं और पत्ती के आकार के अग्न्याशय से गुजरती हैं, उन्हें पहचाना जाना चाहिए। बिलिओपैन्क्रियाटिक नलिका के पर्याप्त जोखिम को बाद की प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाना चाहिए। दूसरा, मध्यम खींचने बल लागू किया जाना चाहिए जब ग्रहणी माउस के निचले बाईं ओर टांके का उपयोग कर सुपाइन स्थिति में रखा के लिए ठीक है, जिससे तनाव हानि के बिना biliopancreatic वाहिनी सीधा. अत्यधिक और अपर्याप्त खींचने वाले बलों के परिणामस्वरूप ग्रहणी की दीवार को फाड़ दिया जा सकता है और क्रमशः बिलिओपैन्क्रियाटिक वाहिनी का अपर्याप्त जोखिम हो सकता है, जो बाद के पंचर को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकता है। एक ऊर्ध्वाधर कोण को एक चिकनी पंचर सुनिश्चित करने की सिफारिश की जाती है जब ग्रहणी को टांके का उपयोग करके निचले बाईं ओर तय किया जाता है। फिर, पंचर के दौरान, सुनिश्चित करें कि पंचर दिशा बिलिओपैन्क्रियाटिक नलिका की दिशा के समानांतर है। puncturing करते समय, सुई की नोक के झुके हुए विमान को ग्रहणी की दीवार से गुजरने के लिए नीचे की ओर उन्मुख किया जाना चाहिए और बाद में बिलियोपैन्क्रियाटिक डक्ट में प्रवेश करना चाहिए, जिससे बिलियोपैन्क्रियाटिक डक्ट को पंक्चर करने से बचने के लिए उचित बल का उपयोग करना सुनिश्चित किया जा सके। एक सफल पंचर के बाद, बिलियोपैन्क्रियाटिक डक्ट में प्रवेश करते समय कोई प्रतिरोध महसूस नहीं किया जाना चाहिए, और सुई की नोक को धीरे से हिलाते समय बिलिओपैन्क्रियाटिक डक्ट दीवार का तनाव महसूस किया जाना चाहिए। अंत में, प्रक्रिया के दौरान, ग्रहणी को अपनी गतिविधि को बनाए रखने के लिए गर्म सामान्य खारा के साथ नम रखा जाना चाहिए।
हालांकि, इस विधि की कुछ सीमाएं भी हैं। सबसे पहले, पुनरुत्पादन प्रत्येक माउस से टीसी के लिए विभिन्न प्रतिक्रियाओं से प्रभावित हो सकता है। इसलिए, इन प्रभावों को कम करने के लिए प्रत्येक माउस से संबंधित परिणामों की एक युग्मित तुलना की जा सकती है। दूसरा, ग्रहणी पैपिला की चोट पंचर प्रक्रिया के दौरान एक आम घटना है, जो तीव्र अग्नाशयशोथ का कारण भी बन सकती है। इसलिए, इस मॉडलिंग विधि को पूरा करने के लिए पर्याप्त सर्जिकल कौशल विकसित करने के लिए एक लंबे समय तक प्रशिक्षण समय की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, चूहों को एक उपयुक्त आकार रखना सर्जिकल परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है।
इन सीमाओं के बावजूद, यह मॉडल एपी को प्रेरित करने और एपी की प्रक्रिया के दौरान उपन्यास उपचार और संभावित आणविक घटनाओं की जांच करने के लिए आज तक के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले और सबसे अच्छी विशेषता वाले मॉडलों में से एक है। पिछले अध्ययनों के अनुसार, टीसी के माध्यम से प्रेरित एसएपी को भी लक्ष्य चिकित्सा मूल्यांकन के लिए उपयुक्त होने के लिए वर्णित किया गया है क्योंकि इस मॉडल के साथ प्राप्त गंभीरता मानव रोग के समान है और इसे आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है। Quercetin हस्तक्षेप TLR4 / MyD88 / p38 MAPK और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव (ईआरएस) सक्रियण 31 के निषेध के माध्यम से इस SAP मॉडल में अग्नाशय और इलियल पैथोलॉजिकल क्षति को क्षीण करने के लिए सूचित किया गया है। CM4620 का प्रशासन, एक चयनात्मक Orai1 चैनल अवरोधक, इस SAP मॉडल की गंभीरता को काफी कम कर सकता है; ट्रिप्सिनोजेन सक्रियण की रोकथाम, acinar सेल मौत, NF-πB, और सक्रिय टी कोशिकाओं (NFAT) सक्रियण और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के परमाणु कारक अंतर्निहित तंत्र के रूप में सेवा करने के लिए दिखाया गया था32. टीसी के अलावा, टॉरोलिथोकोलिक एसिड 3-सल्फेट (टीएलसीएस) एक और पित्त एसिड है जो अक्सर एपी प्रेरण में उपयोग किया जाता है। जैसा कि पीटरसन एट अल.33 द्वारा समीक्षा की गई है, एसीनार कोशिकाओं में टीएलसीएस द्वारा प्रेरित ऊंचा कैल्शियम आयन सांद्रता न केवल इंट्रासेल्युलर माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन को प्रभावित कर सकती है, बल्कि कैल्शियम आयन एक्सोसाइटोसिस के माध्यम से अग्न्याशय में स्थित अन्य कोशिकाओं (एसीनार, ताराकार और मैक्रोफेज) को भी प्रभावित कर सकती है; जबकि, टीसी पेरिएसिनर ताराकार कोशिकाओं पर इसके प्रभाव के माध्यम से एसिनर कोशिकाओं को अप्रत्यक्ष नुकसान पहुंचा सकता है।
इसलिए, टीसी-प्रेरित एसएपी मॉडल एपी के रोगजनन में उत्कृष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और नई दवाओं को प्रीक्लिनिकल रूप से मान्य करने के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक उपकरण है। इसके अलावा, इस मॉडल को एपी के इलाज के लिए उपचार के परिणामस्वरूप अप्रिय और अप्रत्याशित प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए बड़े जानवरों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
हम निम्नलिखित अनुदानों से समर्थन के लिए आभारी हैं: NCRCH [2020WSA01] का एक ट्रांसलेशनल रिसर्च ग्रांट, युवा विद्वानों के लिए स्वास्थ्य के Suzhou आयोग से एक KJXW वैज्ञानिक अनुदान [KJXW2020002], Suzhou सिटी की एक विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (SKY2021038 और SKJY2021050), Jiangsu उच्च शिक्षा संस्थानों (PAPD) के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास से एक अनुदान ( BED2) और एक प्राथमिक अनुसंधान योजना (BED2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
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