Isolamento e Cultura In vitro de Macrófagos Derivados da Medula Óssea para o Estudo da Biologia NO-Redox

Macrófagos foram estabelecidos como um tipo celular interessante em uma grande variedade de doenças e condições, muitas aparentemente não relacionadas ao seu foco tradicional na imunidade inata. Como a fisiologia do macrófago é fortemente dependente do tecido ou ambiente em que residem, muitos métodos e modelos surgiram para estudar sua função e as diversas vias envolvidas. Historicamente, as linhas celulares do macrófago, como raw264.7, dominaram o campo, mas estas foram gradualmente substituídas em favor de vários modelos de células primárias. Por exemplo, macrófagos murinos podem ser isolados da lavagem peritoneal após o tratamento com tioglicolato. Embora fornecendo um modelo útil para o estudo de células residentes por tecidos, esses macrófagos peritoneais têm demonstrado uma resposta mais moderada a vários estímulos externos, limitando assim sua adequação para muitas aplicações a jusante¹.

Como alternativa, macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), derivados de células progenitoras mieloides na medula óssea, surgiram como um modelo valioso para estudar vários aspectos da biologia macfago, incluindo a maturação e os diversos fenótipos clássicos associados a macrófagos, M0 (ingênuo, não ativado), M1 (pró-inflamatório, geralmente ativado com LPS/IFN) e M2 (pró-resolução, geralmente ativado com IL-4)^{2, 3}. No entanto, a diferenciação das células progenitoras mieloides em BMDMs depende da presença de fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) na mídia cultural ^4,5. Isso pode ser fornecido na forma de proteína purificada adicionada à mídia ou a partir de mídia condicionada L929 (LCM). As vantagens do uso de BMDMs (custo e eficiência) devem ser ponderadas contra as limitações apresentadas por sua sensibilidade a diversos estímulos (citocinas, intermediários metabólicos e RNS/ROS).

Dados anteriores indicam que os conteúdos do LCM são pouco definidos e intrinsecamente variáveis, resultando em sua não-inadequação e inadequado para uma variedade de aplicações a jusante, especialmente aquelas especificamente relacionadas à biologia NO ou redox, pois estas podem ser fortemente influenciadas pela presença de compostos exógenos⁶. Como tal, este protocolo detalhado exige o uso de DMEM bem definido: mídia F12 com variação de lote baixo para lote e a adição de murine recombinante M-CSF e GM-CSF (fator estimulante da colônia granulocito-macrófago). Além disso, o soro bovino fetal normalmente usado como suplemento na mídia de cultura tecidual fornece mais uma fonte de compostos mal definidos e variabilidade inerente. É necessário, portanto, controlar e otimizar o uso desses aditivos para garantir a cultura confiável dos BMDMs. Usando uma fonte de baixa endotoxina definida de FBS e garantindo que os lotes únicos sejam adquiridos em massa, as condições de cultura são definidas de forma confiável e a reprodutibilidade é garantida. O protocolo descrito aqui foi demonstrado para produzir uma cultura de macrófago acima de 95% de pureza quando avaliado para os marcadores de superfície macfago CD45 e CD11b por citometria^{de fluxo 6}.

Todos os procedimentos animais foram aprovados e realizados de acordo com o comitê de ética da Universidade de Oxford e o Uk Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Todos os procedimentos conformes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu.

1. Isolamento das células da medula óssea

1. Sacrificar ratos do tipo selvagem (C57BL/6) ou Gch1-deficiente (R26-CreER^T2Gch^fl/fl) (10-16 semanas de idade) por luxação cervical e coletar os membros traseiros.
   NOTA: Nenhuma preferência para qualquer sexo é feita. As fêmeas combinadas com a idade serão ligeiramente menores do que seus homólogos masculinos, afetando o rendimento inicial do material inicial.
   1. Pulverizar os camundongos com 70% de etanol para reduzir o risco de contaminação.
   2. Faça um pequeno corte no abdômen com uma tesoura de dissecção para remover pele e pele do corpo. Retire a pele para expor o músculo nos membros traseiros.
   3. Coloque o rato em seu abdômen e desloque os membros traseiros levantando-o da articulação do joelho e colocando pressão sobre os quadris. A luxação pode ser sentida na articulação do quadril.
   4. Remova as pernas traseiras cortando cuidadosamente o músculo do quadril, garantindo que não ocorra danos ao fêmur.
   5. Corte acima da articulação do tornozelo, retire o pé e limpe qualquer pele restante da perna.
   6. Coloque as pernas dissecadas em um tubo de 50 mL com 25 mL de PBS gelado (sem necessidade de antibiótico) e coloque-a no gelo.
      NOTA: Vários animais podem ser dissecados, e as pernas mantidas no gelo.
2. Em condições estéreis em uma capa de cultura tecidual, remova os músculos das pernas e remova as extremidades dos ossos para expor a medula óssea.
   1. Coloque as pernas em 70% de etanol por 2 minutos para reduzir a contaminação e lavar qualquer pele ou resíduo.
   2. Transfira as pernas para uma placa de Petri limpa, estéril e bacteriológica. Use fórceps e um bisturi para raspar com firmeza e cuidado ao longo dos ossos com o lado da lâmina para remover os músculos. Corte os tendões para facilitar o processo.
   3. Remova a epífise na extremidade de cada osso para expor a medula óssea. O fêmur é cortado em ambos os lados, apenas aquém das respectivas articulações.
   4. A tíbia é cortada na parte superior, apenas aquém da articulação do joelho, e na parte inferior logo acima do ponto de intersecção com a fíbula.
3. Retire a medula óssea dos ossos com PBS e colete-a em um tubo estéril de 50 mL.
   1. Encha uma seringa de 10 mL com 10 mL de PBS e conecte-se a uma agulha de 25 G x 0,5 x 16 mm. Isso é suficiente para lavar todos os ossos de um rato.
   2. Insira a agulha na cavidade medular do osso e lave suavemente a medula óssea com 1-2 mL de PBS, passando a agulha para cima e para baixo através do osso para garantir que toda a medula óssea seja desalojada.
   3. Repita para todos os ossos, coletando a medula óssea lavada em uma placa de Petri limpa.
   4. Usando uma seringa estéril de 1 mL, desagrega a medula óssea puxando a suspensão para dentro e para fora da seringa 5-10 vezes até que quaisquer caroços sejam quebrados.
   5. Colete a medula óssea desagregada na seringa de 1 mL e passe-a através de um coador de células de 70 μM em um tubo de centrífuga de 50 mL limpo. Coloque a medula óssea coletada no gelo enquanto outras amostras são coletadas.
      NOTA: Veja o esquema de protocolo na Figura 1 - Parte 1.

2. Seleção, diferenciação e estimulação de BMDMs

1. Para congelar a medula óssea para uso posterior, pelotar a medula óssea por centrifugação a 1000 x g por 5 min e resuspend em 2 mL de baixa endotoxina FBS contendo 5% De Sulfóxido de Dimetil (DMSO).
   1. Centrifugar a suspensão da medula óssea a 1000 x g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Uma pelota vermelha de sangue se formará.
   2. Descarte o supernatante.
   3. Resuspenque suavemente a pelota em 2 mL de FBS de baixa endotoxina contendo 5% de DMSO e congele a -80 °C durante a noite antes de transferir para nitrogênio líquido em fase de vapor para armazenamento a longo prazo.
2. Para usar a medula óssea imediatamente, lise os glóbulos vermelhos antes de emplacar a medula óssea.
   1. Centrifugar a suspensão da medula óssea a 1000 x g por 5 min no RT. Uma pelota vermelha de sangue se formará.
   2. Resuspense a pelota em 3 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar na RT por 5 min.
   3. Adicione 10 mL de PBS e centrífuga a 1000 x g por 5 min na RT. Descarte o supernascente.
   4. Emplaque as células para uso imediato, continuando a partir da etapa 2.3.5.
3. Descongele os macrófagos e resuspende em 3 mL de mídia de revestimento antes de pelleting as células.
   1. Prepare ODMEM: F12 contendo 5% de baixa endotoxina FBS, penicilina/estreptomicina 1x, L-glutamina e 25 ng/mL M-CSF.
      NOTA: M-CSF e GM-CSF podem ser preparados com ressus pendentes de proteína seca em água estéril contendo BSA 0,1% estéril, e as alíquotas podem ser congeladas a -80 °C para uso posterior.
   2. Descongele a suspensão da célula congelada rapidamente a 37 °C.
   3. Transfira a suspensão celular (0,5 mL) para um tubo limpo e estéril contendo 3 mL do DMEM preparado: mídia F12.
   4. Pelota as células por centrifugação a 1000 x g por 5 min na RT. Descarte o sobrenante.
   5. Resuspense a pelota em 3 mL do DMEM preparado: mídia F12.
   6. Conte as células por um método preferido.
4. Dia 0: Emplacar as células.
   1. Placa das células em plástico não revestido de TC em DMEM: mídia F12 contendo 5% de baixa endotoxina FBS, penicilina/estreptomicina 1x, L-glutamina e 25 ng/mL M-CSF.
      NOTA: As densidades representativas de semeadura estão descritas na Tabela 1. Um par completo de pernas de um rato fornece 15-20 milhões de células precursoras.
   2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂.
5. Dia 5: Alimente as células.
   1. Alimente as células adicionando 50% do volume original de DMEM: mídia F12 contendo 5% de baixa endotoxina FBS, penicilina/estreptomicina 1x, L-glutamina e 50 ng/mL M-CSF.
6. Dia 6: Estimule as células com GM-CSF.
   1. Adicione GM-CSF preparado a uma concentração final de 50 ng/mL diretamente à mídia de cultura celular nas células.
7. Substitua a mídia por DMEM preparado: F12.
   1. Remova todas as mídias das células.
   2. Lave as células brevemente em PBS pré-aquecido.
   3. Adicionar DMEM: mídia F12 contendo 2% de baixa endotoxina FBS, penicilina 1x/estreptomicina, L-glutamina, 25 ng/mL M-CSF e 50 ng/mL GM-CSF.
   4. Ative os macrófagos nos fenótipos M0, M1 ou M2 com as estimulações descritas nas etapas 2.7.5-2.7.7.
   5. M0 - Não é necessária estimulação. Incubar as células durante a noite na mídia.
   6. M1 - Estimule as células com 100 ng/mL LPS e 10 ng/mL IFNγ (concentrações finais) durante a noite.
   7. M2 - Estimular células com 100 ng/mL IL-4 (concentração final) durante a noite.
8. Dia 8: Colhe as células.
   1. Remova a mídia das células (colete mídia e congele a -80 °C para ensaios a jusante).
   2. Incubar as células em PBS gelado (50% do volume de mídia) por 5 min.
   3. Retire as células da placa com raspagem suave ou tubulação repetida.
   4. Pelota as células por centrifugação a 2500 x g por 5 min na RT. Descarte o sobrenante.
   5. Congele as pelotas de célula a -80 °C para uso posterior.
      NOTA: Veja o esquema de protocolo Figura 1 - Parte 2.

Antes de demonstrar a eficiência deste protocolo nos níveis de macrófagos, nitrito e BH4 foram avaliados em mídia suplementada com 10% de FBS contendo 10% de LCM ou apenas M-CSF recombinante e GM-CSF. O nitrito, embora considerado por muito tempo como um produto final do metabolismo do óxido nítrico, é agora considerado como armazenamento fisiológico de óxido nítrico, que pode ser reciclado quando necessário e, portanto, é frequentemente usado como um indicador da biodissebilidade de óxido nítrico⁷. BH4 é um coator essencial do NOS para nenhuma produção. Como visto na Figura 2, a mídia suplementada com 10% de FBS apresentava níveis semelhantes de nitrito, independentemente do M-CSF/GM-CSF ou LCM. No entanto, observou-se maior variabilidade entre diferentes lotes de LCM. Essa observação também se aplica à medição bh4. Na verdade, um lote de LCM (lote nº 3) apresentou nível significativamente maior de BH4 do que os outros dois (lotes #1 e #2). Além disso, os lotes de LCM continham significativamente mais biopterina do que a mídia suplementada com 10% de FBS e citocinas recombinantes. Também foi medida uma variabilidade significativa do total de biopterinas entre os lotes. Esses resultados demonstram a importância do uso de uma fonte menos variável de M-CSF do que a LCM.

Além disso, a mídia suplementada com 10% de FBS continha níveis significativamente mais elevados de nitrito em comparação com os meios que contêm 2% ou 5% da FBS. A diferença entre 10% e 5% foi altamente significativa (p < 0,05) para BH4. No entanto, níveis semelhantes de biopterinas foram quantificados. Em comparação, o OptiMEM + 0,2% BSA foi desprovido de nitrito e BH4, tornando-o um meio de comunicação muito limpo e adequado. No entanto, como descrito por Bailey et al., embora o OptiMEM seja feito para ser usado apenas uma vez durante a noite ao estimular macrófagos, observou-se morte celular devido à fome. DMEM: O F12 complementado com 2% da FBS foi escolhido para superar essa questão, permitindo a mínima contaminação por nitrito e BH4, ao mesmo tempo em que contém nutrientes suficientes para a obtenção de células saudáveis. De fato, apesar de alguns nitrito serem detectados, os níveis são insignificantes (~0,2 μM) em comparação com macrófagos estimulados por LPS/IFN (30-80 μM para 1 x 10⁶ células; dados não mostrados).

Para validar este protocolo aprimorado com dados experimentais, o isolamento e a caracterização de BMDMs de um novo modelo de mouse deficiente BH4, o R26-CreER^T2Gch^fl/fl é apresentado aqui. BH4 é produzido pelo gene GTP cyclohydrolase I (Gch1). Como mostrado na Figura 3A, a deficiência no Gch1 leva à perda de BH4 e ao desaparecimento resultante de NO e, posteriormente, nitrito, e um aumento no ânion superóxido causando estresse oxidativo, como demonstrado anteriormente por McNeill et ^al.8. Embora este protocolo já tenha sido bem definido e usado para cultivar outros macrófagos deficientes BH4 de diferentes sistemas Cre, como o modelo Gch^fl/flT2C ^6,8, o modelo R26-CreER^T2Gch^fl/fl é único, pois utiliza a ativação condicional do sistema Cre-ER^T2 para remover o gene Gch1 após o tratamento de tamoxifen (Figura 3B, C). Isso permite nocaute em vários pontos de tempo e o uso de controle interno na forma de um veículo vs. tratamento tamoxifen. Neste exemplo, as células foram tratadas com um veículo (95% etanol) ou 0,1/1,0 μM 4-OH tamoxifen nos dias 1 e 3 (ambos os veículos e ações de tamoxifen diluídos 1:100 em mídia antes de 0,7/7.0 μL adicionado a 1 mL do volume de cultura existente).

Como visto na Figura 3D, a proteína GTPCH é abolida após o tratamento de Tamoxifen nas células R26-CreER^T2Gch^fl/fl, mas não no Gch^fl/fl um. É importante ressaltar que as células de controle R26-CreER^T2Gch^fl/fl e Gch^fl/fl ainda são capazes de produzir iNOS após a estimulação LPS/IFN (Figura 3B,C). Essas alterações na expressão genética Gch1 e a consequente alteração na proteína GTPCH levaram a níveis de BH4 intracelulares significativamente perturbados e à produção atenuada de nitrito. Como mostrado na Figura 4, os BMDMs isolados e cultivados a partir de ratos R26-CreER^T2Gch^fl/fl apresentaram significativamente diminuído a produção bh4 e diminuíram o acúmulo de nitrito na mídia, em comparação com aqueles de células GCH^fl/fl de controle na presença de tamoxifen. Da mesma forma, as mesmas células cultivadas nos meios de LCM também mostraram expressão Gch1 abolida; embora essas células ainda produzissem quantidades significativas tanto de BH4 quanto de nitrito após o nocaute da expressão Gch1 com 4 OH tamoxifen, possivelmente devido à contaminação da mídia e FBS com BH4. Isso representa uma clara melhoria do novo método, sobre a cultura das células em mídia contendo células L.

A caracterização adicional deste modelo não demonstra diferenças significativas na morfologia entre os BMDMs não ativados (M0) Gch^fl/fl e^{R26-CreER T2}Gch^fl/fl/fl no dia 8, seguindo diferentes concentrações de tamoxifen. Como mostrado na Figura 5, ambos os modelos exibem uma quantidade semelhante de células aderentes feitas de uma forma redonda com extremidades alongadas, tipicamente as características esperadas de macrófagos não estimulados⁹.

Juntos, esses resultados demonstram que esse método de isolamento e cultura de BMDMs proporciona uma população pura de células adequadas à cultura dos macrófagos murinos. Este método permite a cultura de macrófagos murinos sem a interferência de compostos exógenos presentes em algumas formulações midiáticas.

Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra o isolamento das células de medula óssea (Parte 1) para a seleção, diferenciação e estimulação de BMDMs (Parte 2) Em condições estéreis, as pernas dissecadas são colocadas em uma placa de petri bacteriológica limpa após serem lavadas em 70% de etanol. (B) Os músculos são cuidadosamente removidos usando fórceps e arranhões de bisturi ao longo dos ossos. (C) As extremidades dos ossos são então cortadas para expor a medula óssea. (D) A medula óssea é lavada dos ossos usando uma seringa de 10 mL preenchida com 10 mL de PBS inserindo a agulha no lúmen do osso. (E) A agulha é executada para cima e para baixo através do osso para garantir que toda a medula óssea seja desalojada. O osso deve parecer branco e claro nessa fase com a medula óssea desalojada coletada na placa de petri. (F-G) Repita para todos os ossos, coletando a medula óssea desagregada na seringa de 1 mL, e passe-a através de um coador de células de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL limpo. Gire para baixo e resuspend células em mídia de congelamento para uso posterior. Parte 2 mostra a seleção, diferenciação e estímulo de BMDMs Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Nitrito e BH4 níveis em DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF ou DMEM: mídia de células L F12+. (A) Os níveis de nitrito em diferentes mídias foram medidos usando o método Griess Assay. (B) Os níveis bh4 e biopterinas foram medidos em diferentes mídias pela quantificação HPLC utilizando um padrão BH4. Os dados são expressos como a média (n = 3) ± os dados foram analisados utilizando-se a ANOVA unidirecional por várias comparações. Os símbolos representam p < 0,05 entre os grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Introdução do modelo R26CreERT2. (A) Esquema que ilustra o papel do BH4 como cofator nos na biologia redox. (B) Esquema detalhando a excisão dos exons críticos (2 e 3) em Gch1 devido aos locais de loxP flanqueamento e à ativação condicional do Cre-ERT2 com tamoxifen neste modelo murino. (C) PCR (representante de n = 3 animais independentes) demonstrando excisão do exon crítico quando os BMDMs são tratados com tamoxifen. Os camundongos WT produzem um produto PCR de 1030 bp, enquanto na presença do Cre, é produzido um produto de 1392 bps, confirmando a excisão dos exons críticos. (D) Imunoblot de iNOS, GCH e B-tubulin (representante de n = 3 animais independentes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Caracterização da deficiência BH4 em macrófagos. (A,B) qRT-PCR confirma perda de expressão Gch1 no modelo R26-CreER^T2Gch^fl/fl tratado com tamoxifen. Azul = Novo método MCSF, método Verde = LCM clássico. (C,D) A análise do BH4 intracelular pelo HPLC revela que 0,1 μM e 1,0 μM são suficientes para diminuir significativamente os níveis de BH4. (E, F) A medição do nitrito na mídia usando o ensaio griess mostra que BMDMs não estimulados não produzem níveis detectáveis de nitrito, enquanto Gch^fl/fl e^{R26-CreER T2}Gch^fl/fl/fl BMDMs produzem nitrito na presença de LPS/IFNγ. Significativamente, o tratamento de tamoxifen de R26-CreER^T2Gch^fl/fl reduz significativamente os níveis de nitrito em BMDMs estimulados. Os dados são expressos como a média de (n = 3) ± SD. Os dados foram analisados utilizando-se de uma ANOVA unidirecional por várias comparações. Os símbolos representam p < 0,05 entre os grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Comparação da morfologia dos BMDMs. Fotos obtidas por microscopia óptica de BMDMs no dia 8 com o tratamento variado de tamoxifen. A escala é indicada na imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Densidades representativas de semeadura.

Este protocolo de cultura BH4 e NO-deficiente de BMDMs foi projetado para investigar a biologia no-redox em macrófagos primários através da redução da tetrahidrobiopterina (BH4) e outros artefatos interferentes com o objetivo de aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir desses modelos experimentais.

As etapas críticas incluem o uso do material plástico correto. Progenitores macrófagos são células aderentes e muito pegajosas; portanto, o uso de placas tratadas não-teciduais (TC) é crucial para selecioná-las e isolá-las de outras células progenitoras, que poderiam de outra forma anexar e reduzir a pureza. No dia da colheita, macrófagos descolados de placas requerem PBS gelado, mas o uso de EDTA ou mesmo células de raspagem muito suavemente pode ser realizado dependendo da aplicação a jusante (experimento de células vivas lysed versus live, por exemplo). Deve-se também tomar cuidado especial em relação à contaminação. Ao eliminar a medula óssea, pode ocorrer uma possível contaminação cruzada com bactérias ou partículas virais de restos de pele e pele. É, então, essencial ser o mais cuidadoso e estéril possível; por isso, a queda das pernas dissecadas em 70% de etanol por alguns minutos é incentivada. Da mesma forma, o uso de antibióticos durante o cultivo de macrófagos é altamente recomendado.

Outra limitação deste protocolo surge da densidade de revestimento celular no dia 0. A medula óssea corada contém uma variedade de células, que podem ser erroneamente contadas e incluídas como progenitoras de macrófago, levando assim a um falso número total de células. Para evitar a variabilidade subsequente e potencial, os macrófagos isolados podem ser suavemente lavados usando PBS quente no dia 7 e re-banhados na densidade correta em 2%FBS DMEM: F12 pelo menos 1 h antes da estimulação para permitir a adesão.

Finalmente, verificar os níveis de nitrito por griess ensaio usando mídia de macrófagos cultivados é imperativo para analisar dados. No lado positivo, este ensaio é rápido e barato de executar.

Como demonstrado aqui, este protocolo personalizado é uma alternativa mais definida e melhorada ao protocolo mais comum usado para isolar e cultivar macrófagos usando mídia condicionada de células L (LCM). De fato, uma das principais preocupações que o uso do LCM ao estudar a biologia no-redox são suas quantidades significativas de biopterinas detectadas, levando a potenciais alterações metabólicas¹⁰. Por exemplo, o exógeno BH4 pode repor rapidamente modelos deficientes e atuar como um cofator para iNOS, levando à produção indesejada de óxido nítrico. Outra desvantagem do uso do LCM está em sua produção - LCM é uma mistura de fatores estimulantes de colônias, citocinas e outros subprodutos secretados diretamente pelas células L-929, que podem afetar a fisiologia do macrófago⁶. Apesar de sua grande oferta em M-CSF, essencial para a proliferação e sobrevivência do macrófago, a variação de cada componente de lote para lote aumenta o risco de variabilidade entre os experimentos.

Para resolver ambas as questões, este novo protocolo utiliza o bem definido DMEM: mídia F12 contendo baixos níveis de biopterinas aos quais uma quantidade controlada de M-CSF purificado e GM-CSF é adicionada. Ambas as citocinas auxiliam na diferenciação e crescimento dos macrófagos. O M-CSF leva especialmente à geração de BMDMs a partir de células progenitoras de medula óssea, garantindo a diferenciação das células-tronco hematopoiéticas em macrófagos¹¹. Além disso, o GM-CSF tem sido mostrado para aumentar a citocina inflamatória e a produção DE NO quando adicionado antes da estimulação, um benefício real ao estudar biologia no-redox ^12,13.

O outro fator principal que este novo método aborda é o da FBS, geralmente utilizada como fonte de nutrientes essenciais para a boa saúde e crescimento das células. Semelhante ao LCM, o FBS contém níveis significativos de biopterna. Enquanto a fome completa de soro das células antes da estimulação foi inicialmente considerada usando OptiMEM + 0,2% BSA, os macrófagos apresentaram sinais de descolamento, indicativos de diminuição da viabilidade celular, como descrito por Bailey et ^al.6. No entanto, como os macrófagos demonstraram um requisito absoluto para o soro, a Endotoxina Ultra-Baixa FBS da BioWest foi selecionada. Os lotes foram testados para biopterinas e pré-selecionados antes da compra em massa para garantir uma oferta confiável e bem definida. Para avançar ainda mais no sentido de reduzir as fontes poluentes de biopterinas, foram, portanto, testadas concentrações reduzidas de FBS. Em vez de usar 10% de soro como comumente usado na cultura celular, o nível de FBS é mantido para 5% ao longo da diferenciação de 7 dias da medula óssea em macrófagos e ainda reduzido a 2% durante a estimulação durante a noite no último dia. Isso garante níveis insignificantes de biopterinas detectadas, mas nutrientes suficientes para a boa saúde e adesão de macrófagos. Embora este protocolo recém-otimizado usando M-CSF recombinante resulte em um ambiente mais controlado para a cultura e ativação de macrófagos primários, a principal limitação é que este método é mais caro do que usar o método LCM.

Levando em consideração todos esses fatores, os dois métodos foram então comparados diretamente. É importante ressaltar que o protocolo recém-modificado aqui apresentado usando m-CSF recombinante e GM-CSF resultou em um sistema mais reprodutível onde a mídia era desprovida de contaminar BH4. Os efeitos disso foram duas vezes; As células deficientes bh4 estavam realmente carentes de BH4, o que resultou em um mínimo de acúmulo de nitrito detectável na mídia após a estimulação ao status M1 com LPS. Isso contrastava com as mesmas células BMDM cultivadas em LCM, onde foram detectadas significativas BH4 e nitrito.

Para concluir, a força deste método reside no esforço de controlar os níveis de biopterinas, avaliando minuciosamente cada parâmetro que poderia afetar a sinalização NO e redox em macrófagos. Em particular, isso garante a máxima reprodutibilidade e padronização no campo da biologia no-redox.