Summary
제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.
Abstract
동물과 인간의 심혼에서 심실 심장 근세포의 격리는 심장 연구에서 근본적인 방법입니다. 동물 심근 세포는 일반적으로 소화 효소와 관상 관상 관류에 의해 격리됩니다. 그러나 인간의 심근 세포를 고립시키는 것은 인간 심근 세포가 일반적으로 관상 동맥 관류를 허용하지 않기 때문에 도전적이며, 대체 절연 프로토콜은 실행 가능한 세포의 가난한 수율을 초래합니다. 또한, 인간의 심근 표본은 드물며 현장 심장 수술을 받는 기관에서만 정기적으로 사용할 수 있습니다. 이것은 인간 심근세포에 동물에서 사실 인정의 번역을 방해합니다. 여기에 설명된 인간 및 동물 심근에서 심실 심근세포의 효율적인 격리를 가능하게 하는 신뢰할 수 있는 프로토콜이 있습니다. 세포 손상을 최소화하면서 표면 대 부피 비율을 높이기 위해 심근 조직 슬라이스 300 μm 두께는 진동기를 가진 심근 표본에서 생성됩니다. 조직 조각은 프로테아제와 콜라게나아제로 소화됩니다. 쥐 심근은 유동 세포 계수에 의정서를 확립하고 생존 가능한 칼슘 내성 심근세포의 수율을 정량화하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 사용되는 조직-청크 방법과 비교하여 막대 모양의 심근세포의 상당히 높은 수율을 보였다(41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%, p< 0.05). 프로토콜은 쥐 심근에서와 유사한 수율이 있는 실패하고 실패하지 않는 인간 심근으로 변환되었으며, 다시 조직 청크 방법(45.0 ± 15.0 대 6.87 ± 5.23 세포/mg, p< 0.05)보다 현저하게 높았다. 특히, 제시 된 프로토콜과 함께 가능한 인간의 심근 세포의 합리적인 수를 분리 할 수있다 (9-200 세포 / mg) 조직의 최소한의 양에서 (&50 mg). 따라서, 이 방법은 인간과 동물의 심장 모두에서 건강하고 실패한 심근에 적용가능하다. 더욱이, 감기 심근용액에서 최대 36시간 까지 저장된 인간 조직 표본으로부터 흥분및 수축근구를 분리할 수 있어 현장 심장 수술이 없는 기관의 실험실에 특히 유용한 방법을 렌더링할 수 있다.
Introduction
심근세포 생리학에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있는 길을 열어준 정액 기술은 온전한 심장1에서살아있는 심실 심근세포의 격리이다. 고립 된 심근 세포는 정상적인 세포 구조 와 기능을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다., 또는 생체 내 실험의 결과; 예를 들어, 세포 전기 생리학 또는 심폐소생 수축 커플링의 변화를 평가하기 위해 심장 질환의 동물 모델에서. 추가적으로, 고립된 심근세포는 세포 배양, 약리학 내정간섭, 유전자 전달, 조직 공학 및 많은 그밖 응용을 위해 이용될 수 있습니다. 따라서 심근세포 분리를 위한 효율적인 방법은 기본 및 번역 심장 연구에 근본적인 가치가 있습니다.
설치류와 같은 작은 포유류와 돼지 나 개와 같은 더 큰 포유동물의 심근세포는 일반적으로 조잡한 콜라게나아제 및 / 또는 프로테아제가 함유 된 용액으로 심장의 관상 동맥 관류에 의해 격리됩니다. 이는 심근세포 분리를 위한 "금본위제" 방법으로 설명되어 있으며, 그 결과 실행 가능한 세포2의최대 70%의 수율을 초래한다. 접근은 또한 허용심근세포산출량 3,,4,45의결과로, 인간의 심혼과 함께 이용되었습니다. 그러나 관상 동맥 관류는 관상 동맥 가지를 포함하는 온전한 심근 또는 큰 심근 웨지를 사용할 수 있는 경우에만 가능하기 때문에, 대부분의 인간 심장 표본은 그들의 작은 크기와 적당한 혈관의 부족으로 인해 이 접근에 적합하지 않습니다. 따라서 인간의 심근 세포의 고립은 어렵습니다.
인간 심근 표본은 주로 가변 크기의 조직 덩어리(약 0.5 x 0.5 x 0.5 cm ~ 2 x 2 x 2cm)로 구성하며, 끝막생기 생검6,중격 절제술7,VAD 이식8,또는 심어진 하트9를통해 수득된다. 심근 세포 격리를 위한 일반적인 절차는 가위 또는 메스를 사용하여 조직을 다진 것으로 시작합니다. 세포 대 세포 접촉은 칼슘이 없거나 낮은 칼슘 완충제에 침수하여 중단됩니다. 이것은 원유 효소 추출물 또는 프로테아제 (예 : 트립신), 콜라게나아제, 히알루로니다제 또는 엘라스타제와 같은 정제 효소를 함유한 다중 소화 단계로 이어지며 세포외 매트릭스가 분해되고 심근세포의 해방을 초래합니다. 최종적으로 중요한 단계에서, 생리적 칼슘 농도는 신중하게 회복되어야 하며, 칼슘-역설(10,,11,,12)으로인해 세포 손상이 발생할 수 있다.11 이 격리 방법은 편리하지만 일반적으로 비효율적입니다. 예를 들어, 한 연구는 심근 조직의 거의 1 g후속 실험에 적합한 심근 세포의 충분한 수를 얻기 위해 필요 했다 발견13. 낮은 수율에 대 한 가능한 이유는 조직을 다진의 상대적으로 가혹한 방법. 이 심근 세포는 효소 소화에 의해 방출 될 가능성이 가장 높지만 청크 가장자리에 위치한 심근 세포가 특히 손상 될 수 있습니다.
인간 표본에서 얻은 세포의 격리 효율성 및 품질에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 측면은 조직 허혈의 지속 기간. 대부분의 프로토콜은 좋은 결과를 위한 전제 조건으로 실험실에 짧은 수송 시간을 언급합니다. 이것은 가까운 심장 수술 시설을 가진 실험실에 인간 심실 심근 세포의 연구를 제한합니다. 함께, 이러한 제한은 인간의 심근 세포에 있는 동물 모형에서 중요한 사실 인정의 확인을 방해합니다. 소량의 조직에서 높은 심근세포 수율을 허용하는 향상된 격리 프로토콜은 운송 시간이 연장된 후 심각한 손상없이 바람직하게는 바람직합니다.
여기에 기진도14,,15로생성된 얇은 심근 조직 슬라이스의 효소 소화에 기초한 격리 프로토콜이다. 우리는 조직 조각에서 격리가 가위로 다진 조직 덩어리에서 그것보다 훨씬 더 효율적이다는 것을 보여줍니다. 설명된 방법은 소량의 심근 조직에서 생존 가능한 인간 심근세포의 높은 수율을 허용할 뿐만 아니라 최대 36시간 동안 차가운 심근용액에 저장되거나 운반된 표본에도 적용가능하다.
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Protocol
쥐를 가진 모든 실험은 동물 관리 및 사용 위원회 미텔 프랑켄, 바이에른, 독일에 의해 승인되었습니다. 인간 심장 조직 샘플의 수집 및 사용은 에를랑겐 뉘른베르크 대학과 루르 대학 보훔대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 헬싱키 선언 지침에 따라 연구를 수행했습니다. 환자는 조직 수집 전에 서면 통보 된 동의를 주었습니다.
암컷 위스타 쥐(150-200 g)는 시판적으로 얻어지고, 100 mg/kg의 티오펜탈 나트륨을 주사하여 마취하고, 자궁 경부 탈구에 의해 안락사되어 흉부 절제술과 심장 절제에 뒤따랐다. 인간 심장 조직 샘플은 기계 보조 장치의 이식 중에 좌심실 정맥 코어에서 수집되었으며, 중격 절제술에서, Fallot 교정 수술의 테트라로지에서, 또는 절제 된 심장의 무료 좌심실 벽에서 수집되었습니다. 다음 프로토콜은 인간 심실 조직에서 격리를 설명합니다. 쥐 심근세포의 분리는 그에 따라 수행되었지만 다른 효소(재료 표참조). 프로토콜의 회로도 워크플로우는 그림 1에설명되어 있습니다.
1. 완충제, 솔루션 및 효소 준비
- 표 1에나열된 버퍼 및 솔루션을 준비합니다.
- 용액 1, 2, 3 및 수정된 Tyrode의 용액을 37°C로 데우기. 사용 전까지 절삭 액을 4°C로 저장합니다.
참고: 1-2심근 슬라이스의 경우 총 약 15mL, 8mL 및 5mL의 용액 1, 2 및 3mL의 용액은 하나의 35mm 조직 배양 접시에서 격리가 필요합니다. 여러 접시에서 동시 심근세포 절연을 위해 그에 따라 확장하십시오. 절단 용액은 몇 달 동안 -20 °C에서 동결 및 보관 할 수 있습니다. - 단백질제 XXIV 1 mg(재료 표 참조)을미리 냉각된 15mL 원심분리기 튜브에 넣고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. 이것은 하나의 샘플을 처리하기위한 것입니다. 그에 따라 양을 확장합니다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오.
- 콜라게나아제 CLSI 8 mg(재료 표 참조)을15mL 원심분리기 튜브에 넣고 사용전까지 얼음에 보관하십시오. 이것은 하나의 샘플을 처리하기위한 것입니다. 그에 따라 양을 확장합니다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오.
주의: 효소 분말의 흡입을 피하기 위해 얼굴 마스크를 착용하거나 연기 후드 아래에서 작업하십시오.
참고: 효소 활성은 다른 제비에서 다를 수 있습니다. 따라서, 최적의 농도가 다를 수 있으며 새로 구입한 각효소(16)와함께 결정되어야 한다.
2. 심근 조직의 저장 및 운송
- 냉각, 4°C 절삭 용액(표1)에인간의 심장 샘플을 저장 및 운반한다.
- 추가 조직 처리 및 진동 슬라이싱에 동일한 솔루션을 사용합니다.
참고: 생검 및 외과 심장 샘플은 4°C에서 절삭 용액으로 즉시 이송되어야 하며, 이 프로토콜을 적용하기 전에 최대 36시간 동안 4°C에서 저장또는 운반할 수 있다.
3. 조직의 처리 및 슬라이스
참고: 조직 슬라이스 프로토콜은 피셔 외15를따릅니다.
- 티슈 블록트리밍
주의: 인간의 심장 조직은 잠재적으로 전염성이 있습니다. 항상 보호복을 사용하고 기관의 안전 규정을 준수하십시오. 사용 된 블레이드를 조심스럽게 처리하고 안전 용기에 폐기하십시오.- 표본을 20mL 냉삭식 용액으로 채워진 100mm 조직 배양 접시에 넣고 냉각된 4°C 플레이트를 유지합니다.
- 메스로 과도한 섬유질 조직과 상복부 지방을 제거하십시오. 교원 간 표본의 경우 내카르듐 근처의 trabeculae 및 조직 층을 제거하십시오.
참고: 섬유질 조직은 뻣뻣하고 흰색으로 나타납니다. 지방은 일반적으로 부드럽고 흰색에서 노란색으로 나타납니다. Trabeculae 및 내내막 조직 층은 상피 층의 심근에 비해 느슨한 조직 조성 및 비정렬 섬유 배향으로부터 식별 될 수있다 - 최적의 진동 처리를 위해, 더 큰 조직 견본에서 메스로 약 8mm x 8 mm x 8 mm의 직사각형 조직 블록을 잘라. 작은 생검이 이 단계를 건너뛰고 아가로즈 포함으로 이동하십시오.
- 저융점 아가로즈에 심장 조직을 포함
- 유리 비커에 절삭 용액의 10 mL에 저융점 아가로즈 400 mg을 끓입니다.
주의: 화상을 피하기 위해 장갑과 안전 안경을 착용하십시오. 열 보호 마모로만 핫 유리 제품을 처리하십시오. - 뜨거운 용존 아가로즈 젤로 10mL 주사기를 채웁니다. 주사기를 밀봉하고 아가로즈가 37°C 의 수조에서 15분 이상 평형화되도록 하십시오.
- 집게를 사용하여 숙성된 심장 표본이나 생검을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 넣고 에피카르듐을 아래로 향하고 멸균 면봉으로 과도한 액체를 제거하십시오.
- 주사기를 비우고 조직 위에 평형 아가로즈(3.2.2단계)를 붓습니다. 아가로즈를 붓는 동안 집게로 운동에 대한 조직을 확보하십시오. 조직이 아가로즈에 완전히 침지되어 있는지 확인하십시오.
- 즉시 접시를 얼음 위에 놓고 아가로즈가 10 분 동안 굳어지게하십시오.
- 유리 비커에 절삭 용액의 10 mL에 저융점 아가로즈 400 mg을 끓입니다.
- 심근 을 슬라이스
- 새로운 면도날을 진동의 블레이드 홀더에 장착하고 가능하면 블레이드의 z-편향을 조정하여 진동을 보정합니다.
참고: 이 프로토콜은 적외선 보조 교정 장치와 진동을 사용하여 블레이드를 최소한의 z-편향(측정된 편향 및 0.1 μm)으로 수평 위치에 정렬합니다. - 메스를 사용하여 진동의 표본 홀더에 맞는 아가로즈 조직 블록을 절제하십시오. 안정성을 보장하기 위해 조직이 여전히 아가로즈 (아가로즈 마진 ≥ 8mm)에 충분히 침지되어 있는지 확인하십시오.
- 아가로즈 블록을 시편 홀더에 고정시 얇은 층의 시아노아크라일레이트 접착제와 부드러운 압력으로 고정합니다.
- 시편 홀더를 티슈와 함께 진동 욕조에 넣습니다. 절단 용액으로 목욕을 채우고 진동의 외부 냉각 탱크에 채워진 분쇄 된 얼음으로 가공 내내 4-6 °C에서 유지하십시오.
- ≤0.1 mm/s의 전진 속도, 80Hz의 진동 주파수, 1.5mm의 측면 진폭, 15°의 블레이드 각도로 300μm 두께의 슬라이스를 생성합니다. 슬라이스를 처리 할 때, 조직 자체 대신 아가로즈를 잡고 조직 손상을 피하십시오. 필요한 경우 최대 2시간 동안 절단 용액에 슬라이스를 저장합니다.
참고: 심근세포는 진피에 병행하여 지향됩니다. 따라서 과도한 심구체 손상을 피하기 위해 에피카르듐과 병행하여 절단하는 것이 중요합니다. 일정한 두께의 균일한 조각만 절연에 사용해야 하므로 처음 1-3 개의 슬라이스를 버리는 것이 좋습니다. 작은 조직 생검에 대 한, 그러나, 단지 첫 번째 조각을 폐기. - 40-100x의 배율로 표준 광 현미경의 밑에 심근세포 정렬을 확인합니다.
- 새로운 면도날을 진동의 블레이드 홀더에 장착하고 가능하면 블레이드의 z-편향을 조정하여 진동을 보정합니다.
4. 조직 소화
- 실험실 셰이커에 열판을 놓고 37°C로 데우십시오. 65 rpm에서 실험실 셰이커를 시작합니다.
- 단백질아제(1.3단계에서 제조)를 용액 1(1.1 단계 및 1.2단계)에 2mL로 용해하고 사용전까지 37°C에서 배양한다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오.
- 콜라게나아제(1.4단계에서 제조)를 용액 1(1.1 단계 및 1.2단계)에 2mL로 녹이고 사용전까지 37°C에서 배양한다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오.
주의: 용존 효소가 피부와 눈 부상을 일으킬 수 있기 때문에 보호 안경과 장갑을 착용하십시오. - 염화물(CaCl2)을콜라게나아제 함유 용액(4.3단계에서 제조)에 추가하여 5μM의 최종 농도를 가짐니다.
- 집게를 사용하여 진동 욕조에서 5mL의 미리 냉각 된 절단 용액 (1.1 및 1.2 단계)으로 채워진 깨끗한 60mm 조직 배양 접시로 조직 조각을 옮기고 얼음을 유지하십시오.
- 조심스럽게 블레이드 또는 집게심심심부로 심근 조직에서 아가로즈를 제거합니다.
참고: 심근 조각의 과도한 장력과 전단 응력을 피하십시오. - 초기 세척을 수행하려면, 열판에 깨끗한 35mm 조직 배양 접시를 놓고 2mL의 예열(37°C) 용액 1로 채우십시오. 1-2심 슬라이스를 조리된 접시에 포셉으로 옮기세요. 1mL 파이펫으로 용액을 흡인하고 세척 단계 2x를 수행하여 절단 용액의 잔재를 제거합니다.
참고: 심장 조각을 흡인하지 마십시오. 솔루션과 슬라이스는 교반 열판에서 35 °C의 일정한 온도에 남아 있어야합니다. 필요한 경우 열판 온도를 조정합니다. - 접시에서 용액 1을 제거하고 단백질제 용액의 2mL(단계 4.2)를 추가합니다. 65 rpm에서 열판에서 12 분 동안 배양하십시오.
- 2mL의 예동용 1(37°C)로 2배 세척합니다.
- 접시에서 용액 1을 제거하고 콜라게나제 용액 2mL(4.3 단계 및 4.4)를 추가합니다. 65 rpm에서 열판에서 적어도 30 분 동안 배양하십시오.
- 가벼운 현미경 아래에 접시를 배치하여 30, 35, 40 분 등에서 무료 개별 심근세포에 대한 확인. 솔루션의 상당한 냉각을 피하기 위해 신속하게 작업할 수 있습니다.
참고: 필요한 소화 시간은 조직 체질 및 섬유증 정도에 따라 달라질 수 있습니다. 조직이 눈에 띄게 부드러워지고 부드럽게 당길 때 쉽게 해리되는 즉시 최적의 소화 시간에 도달했습니다. 충분한 조직을 사용할 수 있는 경우, 여러 조각은 다양한 소화 시간과 병행하여 소화될 수 있습니다. - 조직이 소화되고 개별 심낭이 보이면(단계 4.11), 2mL의 예온용 2(37°C)로 세척하고 2mL로 다시 채웁니다.
5. 조직 해리
- 섬유를 조심스럽게 분리하여 소화된 조직 조각을 집게로 분리합니다.
- 일회용 파스퇴르 파이펫(개구부 직경 >2 mm)으로 여러 번 조심스럽게 파이펫을 사용하세요.
참고: 집게와 파이펫팅을 사용하면 기계적 스트레스를 유발하고 심근세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 그러나, 그것은 세포의 분리를 위한 결정적인 단계입니다. 미세 한 집게를 사용하여 셀 손상을 최소화하고 조각을 작은 조각으로 조심스럽게 분리하십시오. - 광 현미경하에서 해방된 막대 모양의 심근세포에 대해 확인하십시오.
6. 생리칼슘 농도 재도입
- 열판에서 35°C에서 교반하는 동안 칼슘 농도를 5 μM에서 1.5m로 천천히 증가시면 됩니다. 10mMM 및 100mM CaCl2 스톡 솔루션을 사용하십시오. 권장 단계: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. 각 단계 사이의 5 분 인큐베이션 간격으로 증가 된 칼슘 수준에 적응 할 수 있습니다.
- 소화되지 않은 조직 덩어리를 집게로 조심스럽게 제거하거나 칼슘 이끝에 180 μm 모공 크기로 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링하십시오.
7. 기계 분리 제의 제거
- 교반을 멈추고 1,000 μL 파이펫으로 상단에서 용액(~700 μL)의 1/3을 천천히 제거합니다. 심근 세포의 포부를 피하십시오.
참고: 소화되지 않은 조직이 제거되면 심근세포가 접시 중앙에 축적되어 세포 없는 용액의 포부를 용이하게 합니다. 그렇지 않은 경우, 세포 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 세포가 35°C에서 10분 동안 퇴적할 수 있도록 한 다음, 슈퍼나탄의 700 μL을 흡인한 다음, 세포를 다시 일시 중단하고, 35mm 조직 배양 접시로 다시 이송하고 7.2단계로 진행한다. - 용액 3의 700 μL을 세포에 추가하고 열판에서 교반을 재개하고 10 분 동안 배양하십시오.
- 7.1 및 7.2 단계를 반복합니다.
- 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 심근세포가 최소 10분, 실온에서 최대 30분 또는 1분 동안 50xg에서 회전할 수 있도록 합니다. 상체를 완전히 제거하고 수정된 Tyrode의 솔루션 또는 원하는 실험 버퍼에서 다시 일시 중지합니다.
참고: 심근세포는 사용하기 전에 37°C 및 5% CO2에서 몇 시간 동안 수정된 Tyrode의 용액(표1)에보관할 수 있습니다. - 40배 및 200배배율의 표준 광 현미경으로 세포 품질을 검증합니다.
참고: 심근세포의 약 30~50%는 막대 모양이어야 하며 멤브레인 블B없이 매끄럽고 명확한 교차 줄무늬를 표시해야 합니다. 실행 가능한 세포의 단지 5-10%는 자발적인 수축을 보여주어야 합니다.
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Representative Results
격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근증과 함께 사용되었고, 실행 가능한 심근세포의 결과 수는 관상 동맥 관류를 통해 격리및 작은 조직 덩어리로부터의 격리에 의해 얻어진 숫자와 비교되었다(청크 절연, 그림 2). 조직 조각으로부터의 청크 격리 및 격리는 동일한 심혼에서 수행되었다. 그러나 관상 동맥 관류를 통한 격리를 위해 온 심장이 사용되었습니다. 관상 동맥 관류는 주로 막대 모양과 교차 줄무늬 심근세포를 산출했다. 심근 슬라이스로부터의 격리로 막대 모양의 세포의 비율이 낮았지만 총 수는 여전히 높았습니다. 대조적으로, 조직 덩어리로부터 격리 한 후, 몇 개의 막대 모양의 세포가 복구되었습니다 (그림 2A). 유동 세포측정은 결과를 정량적으로 비교하는 데 사용되었습니다. 상대적으로 큰 크기와 교차 감소로 인해 심근세포는 일반적으로 전방 및 측면 분산 모두에 대해 큰 값을 표시합니다. 이러한 특성은 유동 세포 분석기로 막대 모양의 심근세포를 계산하는 데 사용되었으며, 과수축 및 둥근 심근세포로부터 막대 모양을 구별하는 간단한 게이팅 방식을 적용했습니다. (보충 도 1). 대표적인 점 플롯은 그림 2B. 통계 분석은 조직 청크 (41.5 ± 11.9 대 7.89 ± 3.6 %, 각각; n =3 격리; p보다 슬라이스로부터 격리를위한 심근 세포 게이트 CM1에서 뚜렷하게 더 높은 수를 보였다. < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (그림 2C). 따라서, 조직 조각으로부터심근세포의 분리는 관상 동맥 관류에 의해 얻어진 수율에 도달하지 못하지만, 조직 덩어리로부터의 격리보다 훨씬 더 많은 수의 막대 모양의 심구세포를 초래하여 후속 실험을 위한 충분한 세포를 제공한다. 세포 수 이외에, 쥐 심근세포의 구조적 파라미터는 정량화되었다. 세포 길이, 세포 폭 및 사컴 길이는 관류 또는 조직 슬라이스로부터 분리된 세포에서 다르지 않았으며(길이 = 길이 = 110.0 ± 5.4 μm 대 99.4 ± 3.2 μm, p > 0.05; 너비 = 33.9 ± 1.9 μm vs. 30.6 ± 1.2 μm, p > 0.05, n = 19 및 n = 21 셀, 각각 1.62 ± 0.04 μm vs. 1.68 ± 0.04 μm, p =23 = 23 = 23 = 23 = 28 = 23 = 28 = 28 = 28 = 23 = 23 = 28 = 28 = 24 = 28 = 24 = 28 = 28 = 23 = 28 = 28 = 23 = 28 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 28 = 24 = 28 = 28 = 24 = 24 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 24 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 28 = 24 = 28 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 28 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 24 = 28 = 28 = 23 = 28 = 28 = 28 = 28 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 28 = 28 = 28 = 24 = 28 = 24 = 28 = 28보충 그림 2A-C). 전기장 자극을 받는 플루오-4 하중 심근세포 사용17 기능적 파라미터도 평가되었다(보충 도 2D–F). 평균 활성화 시간(27.5 ± 1.5 vs. 23.6 ± 2.5 ms, n = 100 대 n = 31 세포; 내큐퓨전 대 슬라이스, p > 0.05) (보충 도 2D) 및 상대 단축(12.2 ± 1.1 vs. 11.3 ± 2.5%, n = 42 vs. n= 7셀, 수혈 대 슬라이스, p > 0.05) (보충 도 2F) 자극에 반응하는 심근세포의 두 그룹 간에 크게 다르지 않았다. 칼슘 과도 진폭 (최대 정규화 된 Ca2+, F / F0) (보충 도 2E) 심근세포는 심근세포에 의해 분리된 심근세포(4.9± 0.2 대 5.7± 0.3, n=104 vs. n=25세포, 배후 대 슬라이스, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (보충 도 2G). 재배 후 세포 품질을 평가하기 위해, 세포 배양에서 48h 후 전기장 자극에 대응하여 수축되는 심낭의 백분율이 결정되었습니다.17. 반응 세포의 분획은 두 그룹에서 약 절반으로 감소하였다 (41.9 ± 3.6 % 대 31.5 ± 2.3%, 관류 대 슬라이스, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (보충 도 2H).
다음으로, 프로토콜은 인간 심근에 적용되었다. 조직 조각으로부터 얻은 막대 모양및 생존 가능한 고립된 인간 심실 심근세포의 수는 동일한 심근 표본의 조직 덩어리로부터 얻은 수와 쌍방향으로 비교하였다(그림3). 우리는 심근 조각으로부터의 격리가 막대 모양의 큰 비율을 산출하고 둥근 심근 세포(그림 3A)의단지 작은 비율을 산출 것을 발견했다. 우리는 넓은 필드 이미지에서 막대 모양의 심근세포를 계산하고 격리에 사용되는 조직 젖은 무게에 의해 자신의 수를 정규화. 정량화는 심근 슬라이스로부터의 격리가 조직 청크(45.0 ± 15.0 대 6.87 ± 5.23 세포/mg, n= 7 절연, p&05, 쌍2꼬리 t-test)(그림3B)에서격리된 것보다 훨씬 더 많은 수의 막대 모양의 심구세포를 초래한 것으로 나타났다. 더욱이, 생존가능성은 MTT 생존성분석법(14)으로평가되었고, 세포 용액내의 총 단백질양으로 광메트릭 포르마잔 흡수를 정상화했다. 광정량화는 심근 슬라이스(4.76 ± 0.47 vs. 1.09 ± 0.18 AU, n= 3절연, p&05, 쌍2꼬리 t-test)(그림3C)로부터격리후 심근세포 생존도가 상당히 높은 것을 확인하였다.
총 30개의 인간 심장으로부터 최대 36h의 수송 시간을 가진 심근 표본에 적용하였다. 30개의 표본의 실행 가능한 세포 중 23개에서 후속 실험을 위해 수득하였다(보충표 1참조). 실패한 실험의 예(즉, 접시당 100세포)는 보충도 도 3에도시된다. 여기에서, 대부분의 세포는 높은 세포외 칼슘및 과수축을 용납하지 않았습니다. 우리는 14개의 격리에서 근구의 수축을 평가하고, 2개의 경우에 세포는 전기 자극에 반응하지 않았습니다. 이 기술은 성인의 심장에서 얻은 큰 표본뿐만 아니라 어린이 심장(보충 도 4)에서작은 생검 (40 mg만큼)으로 작동했습니다.
기술된 프로토콜과 분리된 인간 세포가 구조적 분석을 실시할 수 있음을 입증하기 위해, 그들은 알파-액틴, EC 커플링 단백질 L형 칼슘 채널(LTCC) 및 라야노딘 수용체(RyR)로 염색되었으며, 세포막 및Figure 4핵에 따라, 최근 래트심사이클(17)에 기재된 염색 방법에 따른 것이다. 알파-액틴 염색은 조밀하고 일반 z라인 패턴과 평균 사코프레 길이1.92 ± 0.06 μm을 휴식 심근세포에서 밝혔다(n= 4, 도 4A). LTCC와 RyR은 명확한 군집을 보였으며 예상대로 세포막 및 t-tubules(그림4B)근처에서 지역화되었습니다.
전능성 염료플루오볼트(18)와 칼슘 민감성 염료 플루오-417은 기술된 프로토콜로 분리된 인간 심근세포가 흥분가능하고 세포 전기생리학 또는 흥분 수축 커플링(그림5)에대한 연구에 사용될 수 있음을 입증하기 위해 사용되었다. 동작 잠재력(AP) 모양 및 지속 시간을 분석하였다(그림5A,B). 50% 및 90% AP 지속시간(APD50: 400.6 ± 41.1 ms, APD90: 748.9 ± 56.6 ms, n =10 세포)의 값은 인간의 심장이 실패하여 심실 심근세포에 대해 다른 사람들에 의해 보고된 범위에 있었다4,,6,,7,,9. 플루오4 로딩셀(도 5C,D)의공초점 선 스캐닝에 의해 기록된 칼슘 과도는 자극 후 명확한 업스트로크와 허용 가능한 신호 대 잡음 비율을 보였다. 칼슘 과도 진폭 (최대 F / F0)은2.9 ± 0.5 (n = 31 세포)였다. 수축에 의한 심근세포 단축은 4.6±0.8%(n=31세포의) 평균을 가진 하부 세포 테두리의 편향으로부터 의 예에서 볼 수 있다.
그림 1: 인간의 심장 조직 조각에서 격리 프로토콜의 워크플로우. 인간 심근(왼쪽 위)의 조직 블록 또는 생검은 저융점 아가로즈에 내장되어 있으며 300 μm 두께의 슬라이스는 진동성(위 중간)의 진동 블레이드로 생성됩니다. 슬라이스는 문화 요리로 옮겨져 주변 아가로즈(오른쪽 상단)에서 제거됩니다. 조직 소화는 가열 및 교반 플레이트 (중간, 왼쪽)에 ~35 °C 및 65 rpm에서 수행되며 단백질로 보충 된 명목상 칼슘이없는 용액의 인큐베이션 (단계 4.10) 콜라게나제와 세포 외 성 매트릭스의 소화, (단계 5) 및 심혈의 분리 성 혈관 및 해방을 포함한다. (6단계) 세포외 칼슘 농도의 느린 상승은 5 μM에서 1.5 mM 간격으로 5 분 간격으로. (단계 7) 기계적 단자 2,3-부탄 단색 (BDM)의 단계별 제거. 막대 모양과 교차 줄무늬 인간 심근세포가 회수됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 심근 슬라이스, 관류 및 청크 절연의 심근 세포 수율. (A)관상 동맥 관류(Perfusion), 진동절단 조직(심근 슬라이스) 또는 다진 조직(조직 덩어리)을 통해 분리된 쥐 심근세포의 대표적인 경현미경그래프. (B) A에기재된 심근세포 절연으로부터 각각의 대표적인 유동 세포측정도도플롯. 측면 산란 영역(SSC-Area) 및 전방 산란 영역(FSC-Area)은 각각 세포 세분성 및 크기의 지표로 사용되었다. 심근세포에 대한 게이트 CM1의 게이팅 방식은 검은 선으로 표시되고 퍼센트에 있는 총 수의 각각분획이 표시됩니다. (C)n= 3 세포 격리에서 B에서 설명한 바와 같이 심근세포(CM1)의 분획의 평균 ±표준 오차는 B에서 와 같이 유량 세포 측정 분석에 의해 평가된다. 심근 조각과 조직 덩어리로부터의 격리는 동일한 하트 (쌍 두 꼬리 t-테스트)에서 수행되었습니다. 관류에 의한 격리는 다른 동물의 전체 마음에서 수행되었고 짝을 이루는 두 꼬리 t-test에 의해 비교되었습니다. * p & 0.05, 여러 비교 보정 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 심근 조각과 다진 조직 덩어리로부터 격리 된 후 인간의 심근 세포의 수율 과 생존가능성 비교. (A)조직 조각으로부터 분리 후 칼슘 내성 인간 심실 심근세포의 대표적인 이미지. 막대 모양과 줄무늬 심근세포는 우세(검은 화살)이며 둥근 세포와 과수축 된 세포 (흰색 화살표)만 있습니다. (B)칼슘 내성, 막대 모양의 심근세포의 정량화는 심근 조각 또는 조직 덩어리로부터 넓은 필드 현미경으로 계산되고 n = 7 쌍의 절연으로부터 입력 재료의 젖은 중량(밀리그램)으로 정규화된다. (C)MTT 분석 후 포마잔 염료 흡수도의 광측정 측정에 의한 심근세포의 생존가능성을 정량화한다. 흡수도는 n = 3 쌍의 절연으로부터 BCA 분석에 의해 평가된 총 단백질 양으로 정규화되었다. *p < 0.05, **p & 0.01 (쌍 두 꼬리 t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 격리 후 인간의 심근 세포의 미세 구조 특성화. (A)4′,6-디아미드인-2-페닐린돌(DAPI, 블루)을 가진 알파 액티닌(녹색) 및 핵 얼룩의 면역염색 후 대표적인 공초점 현미경 이미지. 사코프레 길이는 1.92 ± 0.06 μm(n= 4 근세포)였으며, 포리에 스펙트럼을 분석하여 결정하였다. (B)L형 칼슘 채널(LTCC) 및 심장 리모딘 수용체(RyR)를 위해 유피탈리드된 고정된 인간 심실 심근세포의 대표적인 공초점 현미경 이미지. RyR 및 LTCC (오버레이)의 오버레이 및 밀 세균 아글루티닌 (WGA, 마젠타)을 가진 세포 외 매트릭스의 염색도 표시됩니다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 인간의 심실 심근 세포에서 일시적인 작용 잠재력 및 세포 내 칼슘. (A)전능성 염료 플루오볼트(녹색, 488nm 난초 파장)로 적재된 고립된 인간 심근세포의 2차원 공초점 이미지. 레드박스는00.5Hz(B)에서 전기장 자극 시 빠른 선 스캔으로 측정된 t-관형B시스템의 요소를 나타낸다. A (C)칼슘 민감성 염료 플루오-4 AM(488 nm 흥분 파장)을 탑재한 고립된 인간 심근세포의 라인 스캔 영상(488nm 흥분파장). 형광 강도는 회색 값 [AU]로 표시되고 파란색 점은 스캔 된 선을 따라 각 픽셀의 형광 강도 (dF / dt최대)의최대 상승을 나타냅니다. 샘플링 속도는 529Hz(D) 칼슘 과도는 C의 이미지에서 스캔된 선을 따라 각 픽셀의 형광을 평균화하고 자극 전 기준값까지0정규화하여 얻은 529Hz(D)였다.D 모든 실험은 실온에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | mmol/L의 컴포지션 | 보충제 | Ph | mL의 필수 볼륨 |
| 솔루션 1 | 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 포도당, 70 글루타믹 산, 20 타우린, 10 베타 하이드록시부티레이트, 30 BDM | 소 세럼 알부민 2mg/ml | 7.3 KOH | 300 |
| 솔루션 2 | 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 포도당, 70 글루타믹 산, 20 타우린, 10 베타 하이드록시부티레이트, 0.005 CaCl2,30 BDM | 소 세럼 알부민 10 mg/ml | 7.3 KOH | 300 |
| 솔루션 3 | 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 포도당, 70 글루타믹 산, 20 타우린, 10 베타 하이드록시부티레이트, 1.5 CaCl2 | 소 세럼 알부민 10 mg/ml | 7.3 KOH | 300 |
| 수정된 티로드 솔루션 | 130 NaCl, 0.4 NaH2PO4,5.8 NaHCO3,5.4 KCl, 0.5 MgCl2,1.5 CaCl2,25 HEPES, 22 포도당 | 소 세럼 알부민 2mg/ml | 7.3 와 NaOH 에서 5 % CO2 | 100 |
| 절삭 솔루션 | 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4,5.4 KCl, 2 MgCl2,0.5 CaCl2,10 HEPES, 10 포도당, 30 BDM | 7.3 NaOH와 함께 | 500 |
표 1: 버퍼 및 솔루션. 필요한 버퍼 및 솔루션의 구성.
보충 도 1: 심근세포(CM1) 게이팅 방식의 유효성 검사. 유동 세포측정법에서 도트 플롯, 전방향 및 측면 산란 영역(FSC-A, SSC-A)을 측정하여 관류 분리 된 쥐 심근세포로부터 제어 샘플 (CTRL)에서 검출 된 세포의 크기와 세분성을 나타내고 37 °C에서 15 분 동안 동일한 준비에서 심근 세포의 배양 후 37 °C에서 변형 된 칼슘 10m를 함유하고 있습니다. 세포외 칼슘이 높으면 막대 모양의 심근세포의 과수축및 반올림을 일으켜 세포 감소(87.6% 대 6.00%) 정의된 게이트(CM1)에서. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 관류 또는 슬라이스로 분리된 심근세포 특성. 세포길이(A)및 세포폭(B)은관류를 통해 또는 심근 슬라이스로부터 심근 조각을 통해 격리 후 직접 고정된 쥐 심근세포로부터 현미경(n= 19 및 n=21 세포) 각각 결정하였다. 사코메르길이(C)는알파-액틴 및 푸리에 분석(n=24 및 n=23세포)로 면역염색 후 현미경 이미지로부터 결정되었다. 평균 활성화시간(D),최대 F/F0(E)및 상대 단축(F)은 플루오-4 하중 심근세포로부터 풍부하게 제거하거나 심근 조각으로부터 분리하고 전기 자극에 반응하는 것으로 평가하였다(n= 100/31 심근세포D, n= 104/25 심근세포).0 F 전기 자극에 따라 수축된 막대G형 심근세포(G)의 분획은 표준 광 현미경에서 200x 배율에서 10개의 시야에서 막대 모양의 세포 및 수축 세포의 총 수를 계산하여 평가하였다(n= 452/276 세포, 각각). (H)G에서 수행되는 분석하지만 48h의 재배 후(n = 371/329 세포, 각각). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 낮은 수율인간 심근세포 절연. 주로 과수축된(파란색) 또는 둥근 세포(black)와 막대 모양 및 수축된 세포(white)만 소수만으로 격리된 심근세포의 대표적인 광 현미경 이미지. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 4: 유아 심장 생검에서 심근 세포 격리. (A)유아에서 Fallot의 테트라로지에 대한 교정 수술 중에 얻은 내막생검(젖은 무게 약 40 mg)의 이미지. (B)아가로즈에 내장된 A에도시된 조직에서 심근 슬라이스. (C)심근 세포는 B에도시된 바와 같이 심근 슬라이스로부터 분리된다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 인간 환자 데이터. 이 연구에 포함된 인간 환자로부터의 샘플 수 목록이 제공됩니다. 견본은 수술 모형, 나이, 질병 병인학 및 수송 시간에 따라 분류되었습니다, 견본의 각각 합계 수 및 성공적인 심근세포 격리의 수와. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
살아있는 심근세포의 고립은 40년 전에 확립되었고 여전히 심장 연구에서 많은 실험적 접근법의 전제 조건이지만 예측할 수 없는 결과를 가진 어려운 기술로 남아 있습니다. 효소 용액을 가진 관상 동맥의 관류를 통해 심근 세포 절연은 일반적으로 작은 동물의 심혼을 위해 이용되고 실행 가능한 세포의 다수를 산출합니다. 그러나, 이것은 상대적으로 복잡한 시스템과 전문 지식이 필요합니다. 더욱이, 대부분의 인간 조직 견본은 이 방법에 적합하지 않습니다, 때문에 그들의 작은 크기 또는 관상 동맥 분기의 부재, 이는 바람직한 인간 심근세포의 격리를 위한 새로운 방법을 만듭니다. 여기에 설명된 프로토콜은 얇은 심장 조직 조각의 외상성 생성을 기반으로 하며, 이는 효소 소화를 받게 됩니다. 그것은 왼쪽 심실 보조 장치 이식에서 apical 코어와 같은 동물 심근 심근 및 인간 심근체에 적용될 수 있습니다, 중격 심근 절제술에서 내막 생검, 또는 절제 된 심근 (보충 표 1참조), 안정적으로 실행 가능한, 칼슘 내성 심근 세포의 충분 한 금액을 생산1심장 같은 실험에 사용할 수 있습니다.
다진 조직 덩어리보다 진동 절단 조직 조각에서 심근 세포의 높은 수율을 위한 주요 이유는 슬라이스 도중 심근세포 손상의 더 낮은 정도일 지도 모릅니다. 관상 동맥 관류가 불가능한 경우, 조직 표본을 자르거나 다진 것은 효소를 소화하기 위한 접촉 면을 증가시키는 데 필요하다. 약 8mm x 8mm x 0.3mm의 슬라이스 치수는 상대적으로 큰 표면 대부율(~7mm-1)으로 인해 효소에 잘 접근할 수 있습니다.-1 가위를 사용하면 시편을 약 1mm x 1mm x 1mm의 작은 조각으로 다진하여 유사한 표면 대 볼륨 비율(~6mm-1)을달성할 수 있습니다. 효소 소화 전에 슬라이스와 다진 덩어리의 심근 세포 손상이 정량화되지 않았지만, 진동을 슬라이스하면 섬유 방향으로 부드럽게 절단할 수 있기 때문에 손상이 상당히 적을 수 있습니다. 실제로, 진동기 절단 조각에서 심근세포의 5% 미만이19로손상된 것으로 추정되었다. 결과는 인간 심근세포가 조직 청크에 비해 실행 가능한 세포의 훨씬 더 높은 비율로 제공된 프로토콜로 아주 효율적으로 격리될 수 있다는 것을 보여줍니다. 이것은 심방조직(20)에서슬라이스를 사용한 프로토콜에 따른 것이다. 우리의 방법은 조직의 밀리그램 당 최대 200 칼슘 내성 심실 심근세포체를 산출하고 격리하기 전에 최대 36 시간 동안 심장 조직을 저장하거나 운반 할 수있는 가능성을 제공합니다. 이렇게 하면 현장 심장 수술없이 실험실에 적용되는 프로토콜을 렌더링하여 협업 가능성을 확장합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 진동기와 소화에 슬라이스심근의 올바른 처리뿐만 아니라 칼슘 재도입 및 BDM의 세척의 마지막 단계입니다. 다른 방법과는대조적으로(19),21,심장 조직은 슬라이스 시술 시(14),,15동안의연을 피하기 위해 낮은 용융 온도로 아가로즈에 내장된다.14 이것은 조직 블록을 안정화하고 균일 한 조각을 생성하는 데 필요했다. 조직을 포함할 때, 아가로즈는 여전히 액체여야 하지만, 고온증에 의한 세포 손상을 피하기 위해 온도가 37-38°C를 초과해서는 안 된다. 반대로, 아가로즈가 너무 추워지면(&35°C), 조직 블록에 잘 결합하지 않고 슬라이스 중에 파손될 수 있다. 진동수 처리 후 근세포 생존가능성을 시험하기 위해, 광현미경검사에 의한 세포 생존가능성을 빠르게 평가하고 또한 광메트릭 분석에 의한 정량화를 가능하게 하는 간단한 MTT 분석이14,,22를제안한다. 심근세포 손상은 칼슘이 없는용액(23,,24)에서잠복한 후 세포외 칼슘을 재도입하는 동안발생할 수 있다. 고립 된 세포에서 이러한 칼슘 역설 현상은 심근세포가 적응할 수 있도록 칼슘 수준의 느리고 단계적으로 증가하여 완화 될 수 있습니다. 이 단계는 35 °C에서 연속 동요 하고 5 분의 간격으로 신중하게 수행해야합니다. 약간의 저체온증(21°C)은 재도입 시 쥐 심근세포의 칼슘 내성을증가시킨다. 그러나, 인간 심근세포는 35°C 또는 21°C에서 칼슘 내성에 있는 큰 차이를 보여주지 않았다. 절단, 소화 및 칼슘재도입 시 BDM을 사용하면 심근세포 수축및 세포 에너지 지출뿐만 아니라 과수축을 방지하므로 보호합니다. 그러나, 심장 수축 또는 흥분 수축 커플링을 평가하는 후속 실험의 경우, BDM은26을제거해야 한다. 자발적인 과수축을 최소화하기 위해 점진적인 세척이 적용되었습니다. BDM은 생략될 수 있지만, 이는 이전 실험 및 연구6에서관찰된 바와 같이 과계약 된 심근세포의 양을 현저하게 증가시킬 것이다.
설명된 프로토콜은 높은 칼륨과 소화를 위한 나트륨의 흔적만 포함하는 해결책을 사용합니다. 이 용액은 막대 모양의 교차 줄무늬 심근세포의 가장 높은 수율을 제공했습니다. 효소 소화를 위해, 그러나, 그것은 콜라게나아제의 높은 농도 필요 (4 mg/mL) 일반 Tyrode의 용액에서 소화에 비해 (1.5 mg/mL). 세포외 나트륨은 세포내 나트륨 과부하로 이어질 수 있으며, 칼슘 역설의 부정적인 영향을 악화시켜 세포 수율27을감소시킵니다. 따라서 높은 칼륨과 낮은 나트륨을 가진 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 세포외 마그네슘 농도는 심근세포 격리 프로토콜33,28에서자주 사용되며, 허혈-재관류 손상을 감소시키고29,,30을 감소시키고 감기 허혈(31)의 연장된 기간 후에 심장 기능을 향상시키는 것으로 나타났다.31 따라서 여기에 적용된 용액에는 고농도의 마그네슘(10mMM)도 포함되어 있다. 그러나, 흥분성, 수축력 및 전도 속도가 높은 마그네슘농도(32)에의해 감소될 수 있음을 보여주었다. 비록 이러한 효과 가역 표시 되었다, 고립 된 심 근 세포에 효과 제외 될 수 없습니다. 따라서 생리적 농도(1-2mMM)에서 마그네슘을 사용하면 전체 세포 수율이 낮아지지만 흥분성을 향상시킬 수 있습니다.
최적의 소화 시간은 세포외 매트릭스 또는 섬유증의 양이 인간 실패 심근에서 상당히 다를 수 있기 때문에 매우 가변적입니다. 조직이 여전히 해리시에 단단히 연결되어 있는 경우, 가능한 근세포가 거의 방출되지 않고, 5분 단계로 소화 시간을 늘리고 정기적으로 무료 심낭을 확인하고 슬라이스의 질감을 확인하는 것이 좋습니다. 조직이 장기간(>45분) 후에 소화되지 않은 상태로 유지되면 1 mg/mL 단계로 콜라게나아제 농도를 증가하거나 다른 효소 배치를 테스트하는 것이 좋습니다16. 이 작업에 제시된 각각의 값은 심근세포의 강력한 분리를 위한 프라이머 역할을 할 수 있지만, 최적의 수율과 생존을 위한 조건은 효소 활동 및 조직 체질의 큰 가변성을 고려하여 각 실험실에서 정제될 수 있다. 이 방법의 장점은 소량의 필요한 조직과 작은 배치의 간단한 워크플로우로 인해 여러 테스트를 병렬로 수행 할 수 있다는 것입니다. 따라서 최적의 프로토콜을 신속하게 달성할 수 있습니다.
고품질 심근 슬라이스의 생성에는 고정밀 진동이 필요합니다. 고정밀 조직 슬라이서 또는 진동기에 대한 필요성은 모든 실험실에서 쉽게 사용할 수 없기 때문에 방법의 가능한 단점이다. 이 연구에 사용되는 장치는 다른 곳에서 더 자세히설명된다 14,,15. ,다른그룹(33,34,35)에의해 심근 조각을 생성하는 데 다양한 장치가 성공적으로 사용되었습니다., 따라서, 전진 속도, 블레이드 진폭 및 진동 주파수의 설정이 충족될 수 있고 0.1 μm 이하의 z-편향을 가진 수평 블레이드 방향을 사용할 수 있는 경우, 성공적인 슬라이스 및 격리는 다른 진동과 함께 가능해야 한다. 또한, 조직 슬라이스는 정교하고 프로토콜의 지속 시간을 크게 연장 (약 1-2 시간). BDM을 기계적 분리제로 사용하는 것은 세포 에너지 노출, 허혈성 손상 및과수축(26,,36,,37)을감소시킴으로써 보호 효과가 있다. BDM의 음이노트로픽 효과는 세척 후 빠르게 되돌릴 수 있는 것으로 나타났지만38,,39,BDM이 심근세포기능(40)에알려지지 않은 결과를 초래할 수 있는지는 명확하지 않다. 이 연구는 세포가 최대 36 시간의 조직 저장 시간 후에 높은 수율로 격리될 수 있고 인간 심근세포가 이 방법으로 격리 한 후 최대 3 일 동안 배양 될 수 있음을 보여줍니다17. 짧고 긴 저장 시간이 있는 근세포 간의 기능적 또는 구조적 차이를 눈치채지 못했습니다. 그러나, 이것은 체계적으로 평가되지 않았습니다. 한편, 토끼 전체에 대해, 30mM BDM을 함유한 세포외 용액에서 감기 허혈에 노출된 신선한 심혼과 심장간의 기능적 차이는 무시할 수 있는31이었으며,이 경우도 마찬가지일 수 있다.
제시된 프로토콜은 고립 된 심실 심근 세포와 실험의 모든 종류에 대한 견고한 기초를 제공하고 인간의 심근 표본에 대한 연구에 특히 중요 할 수 있습니다. 일부 적응을 통해 섬유아세포 나 내피 세포와 같은 다른 심장 세포의 격리도 가능한41로보인다. 다른 실험실에서 냉장 저장 용액으로 출하할 수 있는 소량의 조직만 필요하기 때문에 프로토콜을 적용하면 희생된 실험실 동물의 수가 줄어들 수 있습니다. 사실, 프로토콜은 토끼와 돼지 심장 조직에 성공적으로 적용되었습니다. 더욱이, 장기 재배심근 조직 조각을 이용한 실험이21,,33,,42로 증가하고 있으며, 최적의 배양 조건을 제공하기 위해 지속적으로 개선됨에 따라15,,43,,44,슬라이스 재배 후 용이하게 적용할 수 있다. 따라서 경작 된 심근에서 단세포 격리는 시험관 내에서 약리학적 또는 물리적 개입 후 심근 세포의 변화를 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 실험 의학의 월터 브렌델 센터에서 안드레아스 덴도르퍼감사하고 싶습니다, LMU 뮌헨, 슬라이스 프로토콜에 대한 도움. 인간 심근 조직 샘플을 제공하기 위해 우리는 심장 외과의 학과에서 가잘리 미나바리와 크리스티안 하임, 대학 병원 에를랑겐, 에리히 & 한나 Klessmann 연구소에서 헨드릭 밀팅, Ruhr-대학 보훔과 무한나드 알카사르 소아 심장 학부, 대학 병원 에를랑겐에서 감사드립니다. 흐름 세포측정을 지원하기 위해 우리는 번역 연구 센터 (TRC), 대학 병원 에를랑겐에서 사이먼 Völkl과 동료에게 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 기술 지원을 위해 세포 및 분자 생리학 에를랑겐 연구소의 로렌츠 맥카고와 셀린 그뤼닝거에게 감사드립니다.
이 작품은 DZHK에 의해 지원되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터), 임상 연구를위한 학제 간 센터 (IZKF) 에를랑겐 뉘른베르크 대학의 대학 병원에서, 그리고 Universitätsbund 에를랑겐 뉘른베르크.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
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