Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Представлен протокол для изоляции человека и животных желудочков кардиомиоцитов от вибрато-вырезать миокарда ломтиками. Высокие урожаи клеток, терпимых к кальцию (до 200 клеток/мг), можно получить из небольшого количества тканей (lt;50 мг). Протокол применим к миокарду, подвергаемому воздействию холодной ишемии на срок до 36 ч.

Abstract

Изоляция желудочковых сердечных миоцитов от сердца животных и человека является фундаментальным методом в кардиологических исследованиях. Кардиомиоциты животных обычно изолируются коронарной перфузией с пищеварительными ферментами. Тем не менее, изоляция человеческих кардиомиоцитов является сложной задачей, потому что человеческие образцы миокарда, как правило, не позволяют коронарной перфузии, и альтернативные протоколы изоляции привести к низкой урожайности жизнеспособных клеток. Кроме того, образцы миокарда человека встречаются редко и доступны только в учреждениях с кардиохирургией на месте. Это препятствует переводу находок с животных на кардиомиоциты человека. Описано здесь надежный протокол, который позволяет эффективно изоляции желудочковых миоцитов от человека и животных миокарда. Для увеличения соотношения поверхности к объему при минимизации повреждения клеток, ломтики миокардной ткани толщиной 300 мкм генерируются из образцов миокарда с вибромом. Ткань ломтиками затем переваривается с протеазы и коллагеназы. Крысиный миокард использовался для установления протокола и количественной оценки урожайности жизнеспособных, терпимых к кальцию миоцитоцитов путем подсчета потоко-цитометрических клеток. Сравнение с широко используемым методом тканей-куска показало значительно более высокие урожаи родообразных кардиомиоцитов (41,5 и 11,9 против 7,89 и 3,6%, р 0,05). Протокол был переведен на неудачный и несовершеный миокард человека, где урожайность была такой же, как в крысином миокарде, и, опять же, заметно выше, чем при методе тканевой кусок (45,0 и 15,0 против 6,87 и 5,23 клетки/мг, p lt; 0,05). Примечательно, что с представленным протоколом можно изолировать разумное количество жизнеспособных кардиомиоцитов человека (9–200 клеток/мг) от минимального количества тканей (lt;50 мг). Таким образом, метод применим к здоровому и отсутствию миокарда как из сердца человека, так и из сердца животных. Кроме того, можно изолировать возбудимые и контрактильные миоциты из образцов тканей человека, хранящихся до 36 ч в холодном кардиоплегическом растворе, что делает метод особенно полезным для лабораторий в учреждениях без кардиохирургии.

Introduction

Семенной метод, который проложил путь к важной идеи в кардиомиоцитов физиологии является изоляция живых желудочков кардиомиоцитов из нетронутыхсердец 1. Изолированные кардиомиоциты могут быть использованы для изучения нормальной клеточной структуры и функции, или последствия экспериментов in vivo; например, для оценки изменений в клеточной электрофизиологии или возбуждении-сокращении связи в животных моделях сердечных заболеваний. Кроме того, изолированные кардиомиоциты могут быть использованы для клеточной культуры, фармакологических вмешательств, передачи генов, тканевой инженерии и многих других применений. Поэтому эффективные методы изоляции кардиомиоцитов имеют основополагающее значение для фундаментальных и трансляционных сердечных исследований.

Кардиомиоциты мелких млекопитающих, таких как грызуны, и от крупных млекопитающих, таких как свиньи или собаки, обычно изолированы коронарной перфузией сердца с растворами, содержащими сырые коллагеназы и/или протеазы. Это было описано как "золотой стандарт" метод для кардиомиоцитов изоляции, в результате чего дает до 70% жизнеспособных клеток2. Подход также был использован с человеческим сердцем, в результате чего приемлемые кардиомиоцитыдает 3,,4,,5. Однако, поскольку коронарная перфузия возможна только в том случае, если имеется нетронутое сердце или большой клин миокарда, содержащий ветку коронарной артерии, большинство образцов сердца человека не подходят для такого подхода из-за их небольшого размера и отсутствия соответствующей сосудов. Таким образом, изоляция человеческих кардиомиоцитов является сложной задачей.

Образцы миокарда человека в основном состоят из кусков тканей переменного размера (примерно 0,5 х 0,5 х 0,5 см до 2 х 2 х 2 см), полученных через эндомиокардабиопсии 6,перегородки миэктомии 7, ВАЗимплантации 8, или от explantedсердца 9. Наиболее распространенные процедуры для изоляции кардиомиоцитов начинаются с заминки ткани с помощью ножниц или скальпеля. Контакты от клетки к клетке затем нарушаются погружением в буферы без кальция или с низким содержанием кальция. За этим следуют несколько шагов пищеварения с сырыми экстрактами ферментов или очищенных ферментов, таких как протеазы (например, трипсин), коллагеназа, гиалуронидаза или эластаза, что приводит к распаду внеклеточной матрицы и освобождению кардиомиоцитов. В заключительном, критическом шаге, физиологическая концентрация кальция должна быть тщательно восстановлена, или повреждение клеток может произойти из-закальция-парадокса 10,,11,,12. Такой подход к изоляции удобен, но обычно неэффективен. Например, одно исследование показало, что почти 1 г ткани миокарда требуется для получения достаточного количества кардиомиоцитов, пригодных для последующихэкспериментов 13. Возможной причиной низкой урожайности является относительно жесткий метод дования тканей. Это может особенно повредить кардиомиоциты, расположенные на краю куска, хотя эти миоциты, скорее всего, будут освобождены от энзиматического пищеварения.

Другим аспектом, который может повлиять на эффективность изоляции и качество клеток, полученных из человеческих образцов, является продолжительность ишемии тканей. В большинстве протоколов в качестве предпосылки для хороших результатов упоминается короткое время транспортировки в лабораторию. Это ограничивает изучение желудочковых кардиомиоцитов человека в лабораториях с близлежащими средствами кардиохирургии. В совокупности эти ограничения препятствуют проверке важных выводов, полученных от моделей животных в кардиомиоцитах человека. Поэтому желательно улучшить протоколы изоляции, которые позволяют высокой урожайности кардиомиоцитов из небольшого количества тканей, предпочтительно без серьезных повреждений после длительного времени транспортировки.

Описано здесь протокол изоляции, основанный на энзиматическом пищеварении тонких ломтиков миокарда ткани, генерируемых вибромой14,15. Мы демонстрируем, что изоляция от ломтиков тканей является гораздо более эффективным, чем от тканей куски фарш с ножницами. Описанный метод не только позволяет высокую урожайность жизнеспособных человеческих кардиомиоцитов из небольшого количества миокардной ткани, но и применим к образцам, хранящимся или транспортируемым в холодном кардиоплегическом растворе до 36 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с крысами были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Mittelfranken, Бавария, Германия. Сбор и использование образцов сердечной ткани человека было одобрено Институциональными советами по обзору Университета Эрлангена-Нюрнберга и Рур-Университета Бохума. Исследования проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией. Пациенты дали письменное информированное согласие до сбора тканей.

Самки крыс Wistar (150-200 г) были получены на коммерческой основе, под наркозом путем введения 100 мг/кг тиопентал-натрия интраперитонически, и усыпляется шейки матки дислокации следуют торакотомии и иссечение сердца. Образцы сердечной ткани человека были собраны из лево-желудочковой аперической ядры во время имплантации механических вспомогательных устройств, из перегородки миэктомии, из тетралогии коррекционной хирургии Фалло или из свободной левой желудочковой стенки эксплантированных сердец. Следующий протокол описывает изоляцию от желудочковой ткани человека. Изоляция крысиных кардиомиоцитов была выполнена соответственно, но с различными ферментами (см. таблицу материалов). Схематический рабочий процесс протокола иллюстрируется на рисунке 1.

1. Подготовка буферов, растворов и ферментов

  1. Подготовка буферов и решений, перечисленных в таблице 1.
  2. Разогреть растворы 1, 2, 3 и модифицированный раствор тирода до 37 градусов по Цельсию. Храните раствор для резки при 4 градусах Цельсия до его использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1-2 ломтиков миокарда в общей сложности около 15 мл, 8 мл и 5 мл растворов 1, 2 и 3 необходимы для изоляции в одном 35 мм ткани культуры блюдо. Масштабируйте соответственно для одновременных изоляций миоцитов в нескольких блюдах. Раствор для резки можно заморозить и держать при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
  3. Взвесить 1 мг протеиназы XXIV (см.Таблицу материалов) в предварительно облицованную 15 мл центрифуг трубки и хранить на льду до использования. Это для обработки одного образца. Масштабируйте сумму соответствующим образом. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
  4. Взвешивание 8 мг коллагеназы CLSI (см. Таблица материалов) в предварительно облицованную 15 мл центрифуг трубки и хранить на льду до использования. Это для обработки одного образца. Масштабируйте сумму соответствующим образом. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
    ВНИМАНИЕ: Носите маску для лица или работать под капотом дыма, чтобы избежать вдыхания ферментного порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активность ферментов может варьироваться в разных количествах. Таким образом, оптимальная концентрация может отличаться и должна быть определена с каждым недавно приобретеннымферментом 16.

2. Хранение и транспортировка миокардной ткани

  1. Хранить и транспортировать образцы сердца человека в охлаждее, 4 КК резки раствора(таблица 1).
  2. Используйте тот же раствор для дальнейшей обработки тканей и вибромной нарезки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия и хирургические образцы сердца должны быть немедленно переданы в раствор резки при 4 градусов по Цельсию, а затем могут храниться или транспортироваться при 4 градусов по Цельсию максимум за 36 ч до применения этого протокола.

3. Обработка и нарезка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для нарезки тканей следует Фишер и др.15.

  1. Обрезка блока тканей
    ВНИМАНИЕ: Сердечная ткань человека потенциально заразна. Всегда используйте защитный износ и следуйте правилам безопасности вашего учреждения. Тщательно обработать использованные лезвия и выбросить в контейнерах безопасности.
    1. Поместите образец в 100 мм ткани культуры блюдо заполнены 20 мл холодного раствора резки и держать на охлажденной, 4 градусов по Цельсию пластины.
    2. Удалите избыток фиброзной ткани и эпикардиального жира скальпелем. В случае трансмурального образца удалите трабекулы и слои тканей вблизи эндокарда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиброзная ткань жесткая и выглядит белой. Толстяк, как правило, мягкий и выглядит белым желтым. Слои ткани Трабекула и эндокарда можно определить по их свободному составу тканей и неприсоединивой ориентации по сравнению с миокардом эпикардиальных слоев
    3. Для оптимальной обработки вибромы вырежьте прямоугольные блоки тканей примерно на 8 мм х 8 мм х 8 мм скальпелем из более крупного образца ткани. Для небольших биопсий пропустить этот шаг и перейти к агарозы встраивания.
  2. Встраивание сердечной ткани в низкоплавильную агарозу
    1. Отварить 400 мг низкоплавильной точки агарозы в 10 мл раствора резки в стеклянном стакане.
      ВНИМАНИЕ: Носите перчатки и защитные очки, чтобы избежать ожогов. Ручка горячей стеклянной посуды только с износом теплозащиты.
    2. Заполните шприц 10 мл горячим, растворенным гелем агарозы. Печать шприца и дайте агарозе уравночные в 37 градусов по Цельсию водяной бане, по крайней мере 15 мин.
    3. Используйте типсы, чтобы поместить обрезанный образец сердца или биопсию в чистое блюдо культуры ткани 35 мм с эпикардием лицом вниз и удалить избыток жидкости с стерильным тампоном.
    4. Налейте уравновешенную агарозу (шаг 3.2.2) на ткань, опорожнив шприц. Закрепим ткань от движения щипсями при заливке агарозы. Убедитесь, что ткань полностью погружена в агарозу.
    5. Немедленно поместите блюдо на лед и дайте агарозе затвердеть в течение 10 минут.
  3. Нарезка миокарда
    1. Накрените новое лезвие бритвы к держателю лезвия вибромы и откалибровать виброму, регулируя z-отклонение лезвия, если это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует вибром с инфракрасным калибровочные устройства для выравнивания лезвия в горизонтальном положении с минимальным z-отклонения (измеренное отклонение lt;0.1 мкм).
    2. Используйте скальпель, чтобы выкавырить блок агарозной ткани, который подходит владельцу образца вибромы. Для обеспечения стабильности убедитесь, что ткань по-прежнему достаточно погружена в агарозу (края агарозы - 8 мм).
    3. Зафиксировать блок агарозы к держателю образца с тонким слоем клея цианоакрилата и нежным давлением.
    4. Поместите держатель образца с тканью в вибромную ванну. Заполните ванну раствором для резки и держите при 4-6 градусов по Цельсию на протяжении всей обработки дробленым льдом, заполненным внешним охлаждающим баком вибромы.
    5. Создать 300 мкм толщиной ломтики с прогресся скоростью 0,1 мм / с, колеблющейся частотой 80 Гц, боковой амплитуды 1,5 мм, и угол лезвия 15 ". При обработке ломтиков, держать агарозу вместо самой ткани, чтобы избежать повреждения тканей. При необходимости храните ломтики в растворе для резки при 4 градусах Цельсия максимум 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты ориентированы параллельно эпикардию. Поэтому важно, чтобы сократить параллельно эпикардии, чтобы избежать чрезмерного повреждения миоцитов. Для изоляции рекомендуется отказаться от первых 1-3 ломтиков, так как для изоляции следует использовать только однородные ломтики постоянной толщины. Для небольших биопсий тканей, однако, только отказаться от первого ломтика.
    6. Проверьте выравнивание кардиомиоцитов под стандартным световым микроскопом с увеличением в 40-100 раз.

4. Пищеварение тканей

  1. Поместите тепловую пластину на лабораторный шейкер и подогрейте ее до 37 градусов по Цельсию. Запустите лабораторный шейкер при 65 об/мин.
  2. Растворите протеиназу (подготовленную в шаге 1.3) в 2 мл раствора 1 (шаг 1.1 и 1.2) и инкубировать при 37 градусах цельсия до использования. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
  3. Растворите коллагеназу (подготовленную в шаге 1.4) в 2 мл раствора 1 (шаг 1.1 и 1.2) и инкубировать при 37 градусах цельсия до использования. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
    ВНИМАНИЕ: Носите защитные очки и перчатки, потому что растворенные ферменты могут вызвать повреждения кожи и глаз.
  4. Добавьте хлорид кальция (CaCl2) в коллагеназу, содержащую раствор (подготовленный в шаге 4.3) к окончательной концентрации 5 МКМ.
  5. Используйте типсы для переноса ломтика ткани из вибромной ванны в чистую 60-мм культурную тарелку из ткани диаметром 60 мм, наполненную 5 мл предварительно обрезаемого раствора (шаг 1.1 и 1.2) и держите на льду.
  6. Аккуратно удалите агарозу из миокарда с помощью лезвия или типса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте избыточного напряжения и стрижки нагрузку на ломтики миокарда, потому что они могут повредить кардиомиоциты.
  7. Для выполнения первоначального мытья, поместите чистую 35 мм ткани культуры блюдо на тепловой пластине и заполнить его с 2 мл довоенной (37 градусов по Цельсию) раствор 1. Перенесите 1-2 ломтика миокарда в приготовленное блюдо с типсами. Аспирировать раствор с 1 мл пипетки и выполнять шаги мытья 2x, чтобы удалить остатки режущего раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не аспирировать сердечные ломтики. Растворы и ломтики должны оставаться при постоянной температуре 35 градусов по Цельсию на взволнованной тепловой плите. При необходимости отрегулируйте температуру тепловой плиты.
  8. Удалить раствор 1 из блюда и добавить 2 мл раствора протеиназы (шаг 4.2). Инкубировать в течение 12 минут на тепловой плите при 65 об/мин.
  9. Вымойте 2x с 2 мл довоенированного раствора 1 (37 градусов по Цельсию).
  10. Удалить раствор 1 из блюда и добавить 2 мл раствора коллагеназы (шаги 4,3 и 4,4). Инкубировать не менее 30 минут на тепловой плите при 65 об/мин.
  11. Проверьте бесплатно отдельные миоциты на 30, 35, 40 минут и т.д., поместив блюдо под легким микроскопом. Работайте быстро, чтобы избежать значительного охлаждения раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое время пищеварения может варьироваться в зависимости от конституции тканей и степени фиброза. Как только ткань становится заметно мягкой и разобщается легко, когда мягко вытащил, оптимальное время пищеварения было достигнуто. При наличии достаточного количества тканей, несколько ломтиков можно усваить параллельно с различным временем пищеварения.
  12. Когда ткань переваривается и отдельные миоциты видны (шаг 4.11), мыть 2x с 2 мл довоенного раствора 2 (37 градусов по Цельсию) и заполнить снова с 2 мл.

5. Диссоциация тканей

  1. Отмежеваться переваренной ткани ломтиками с типсами, тщательно потянув волокна друг от друга.
  2. Аккуратно пипетка несколько раз с одноразовым пипеткой Pasteur (диаметр открытия 2 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование типсов и пипетки может вызвать механический стресс и вызвать повреждение кардиомиоцитов. Тем не менее, это важный шаг для разделения клеток. Используйте тонкие типсы, чтобы свести к минимуму повреждение клеток и тщательно разобщить ломтики на более мелкие кусочки.
  3. Проверьте наличие освобожденных родообразных кардиомиоцитов под световым микроскопом.

6. Реинтродукция физиологической концентрации кальция

  1. Медленно увеличьте концентрацию кальция с 5 МКМ до 1,5 мМ при агитации при температуре 35 градусов по Цельсию на тепловой пластине. Используйте 10 мМ и 100 мМ. CaCl2 фондовых решений. Рекомендуемые шаги: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1200, 1500 МКМ. Разрешить клеткам адаптироваться к повышенным уровням кальция в 5 мин инкубационых интервалов между каждым шагом.
  2. Удалите непереваренные куски ткани тщательно с типсами или фильтровать подвеску клетки через нейлоновую сетку с размером 180 мкм поры в конце увеличения кальция.

7. Удаление механического размеханого агента

  1. Остановите агитацию и медленно удалите одну треть раствора (700 мкл) сверху с помощью пипетки 1000 мкл. Избегайте аспирации кардиомиоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если непереваренная ткань была удалена, кардиомиоциты будут накапливаться в центре блюда, что облегчает стремление клеточного раствора. Если нет, перенесите клеточный раствор в трубку центрифуги 15 мл и дайте клеткам отбросить осадок в течение 10 мин при 35 градусов по Цельсию, затем аспирировать 700 мкл супернатанта и выбросить, повторно использовать клетки, перенести их обратно в 35-мм культурную тарелку ткани и продолжить шаг 7.2.
  2. Добавьте 700 МКЛ раствора 3 в клетки, возобновите агитацию на тепловой плите и инкубировать в течение 10 мин.
  3. Повторите шаги 7.1 и 7.2.
  4. Перенесите раствор в центрифугу 15 мл трубки и дайте кардиомиоцитам от осадки в течение как минимум 10 минут и максимум 30 минут при комнатной температуре или спина при 50 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант полностью и resuspend в измененном растворе Tyrode или желаемого буфера экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты могут храниться в растворе модифицированноготирода (таблица 1) в течение нескольких часов при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 перед использованием.
  5. Прояви качество клеток стандартным световым микроскопом при увеличении в 40 и 200 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 30-50% кардиомиоцитов должны быть стержнеобразными, гладкими без мембранных пятен и отображать четкие перекрестные полосы. Только 5-10% жизнеспособных клеток должны показывать спонтанные сокращения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для проверки эффективности изоляции протокол использовался с крысиным миокардом, и полученное в результате этого число жизнеспособных миоцитов сравнивали с числами, полученными в результате изоляции через коронарную перфузию и изоляции от небольших кусков ткани (изоляция куска, Рисунок 2). Изоляция и изоляция от ломтиков тканей выполнялись из тех же сердец. Для изоляции через коронарную перфузию, однако, все сердце было использовано. Коронарная перфузия дала преимущественно стержнеобразные и поперечные полосатые кардиомиоциты. При изоляции от ломтиков миокарда наблюдалась более низкая доля клеток в форме стержня, но общее число все еще было высоким. В отличие от этого, после изоляции от тканей куски, только несколько стержневидных клеток были восстановлены (Рисунок 2A). Цитометрия потока была использована для сравнения результатов количественно. Из-за их относительно больших размеров и перекрестного стримации, кардиомиоциты обычно показывают большие значения как для вперед, так и для бокового рассеяния. Эти свойства были использованы для подсчета стержнеобразных миоцитов с потоком цитометрических клеток анализатор, применяя простую схему gating, что дискриминация стержня формы от гиперподрядных и округлых кардиомиоцитов. (Дополнительная цифра 1). Представитель точка участки изображены в Рисунок 2B. Статистический анализ показал, что количество кардиомиоцитов в воротах СМ1 для изоляции от ломтиков ниже, чем от кусков тканей (41,5 и 11,9 против 7,89 и 3,6%, соответственно; n 3 изоляции; р < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Рисунок 2C). Таким образом, изоляция кардиомиоцитов от ломтиков тканей не достигает урожайности, полученной коронарной перфузией, но приводит к значительно большему количеству родообразных миоцитов, чем изоляция от кусков тканей, обеспечивая достаточное количество клеток для последующих экспериментов. Помимо подсчета клеток, были количественно определены структурные параметры крысиных кардиомиоцитов. Длина клеток, ширина клеток и длина саркомера не отличались в клетках, изолированных перфузией, или от ломтиков тканей (длина 110,0 и 5,4 мкм против 99,4 и 3,2 мкм, р 0,05; ширина 33,9 и 1,9 мкм против. 30,6 - 1,2 мкм, р - 0,05, для n - 19 и n - 21 ячейка, соответственно; длина саркомера - 1,62 х 0,04 мкм против 1,68 и 0,04 мкм, р - 0,28, n - 24 и n 23 соответственно.Дополнительная цифра 2A-C). Использование Fluo-4 загруженных миоцитов подвергается электрической стимуляции поля17 также были оценены функциональные параметры (Дополнительная фигура 2D–F). Среднее время активации (27,5 х 1,5 против 23,6 и 2,5 мс, n 100 против n 31 ячейки; перфузия против ломтика, р 0,05) (Дополнительная фигура 2D) и относительное сокращение (12,2 - 1,1 против 11,3 - 2,5%, n - 42 против n' 7 ячеек, перфузия против ломтика, р - 0,05) (Дополнительная фигура 2F) кардиомиоцитов, которые реагировали на стимуляцию, не сильно отличались между двумя группами. Преходящая амплитуда кальция (максимальная нормализованная Caот 2 до 2 евро, F/F0) (Дополнительная фигура 2E) был слегка увеличен в кардиомиоцитах, изолированных от ломтиков по сравнению с кардиомиоцитами, изолированными перфузией (4,9 х 0,2 против 5,7 и 0,3, n 104 против n 25 клеток, перфузия против ломтика, р < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Дополнительная фигура 2G). Для оценки качества клеток после культивирования был определен процент миоцитов, затухающих в ответ на электрическую стимуляцию поля после 48 ч в клеточной культуре17. Доля ответивших ячеек была уменьшена примерно наполовину в обеих группах (41,9 и 3,6% против 31,5 и 2,3%, перфузия против ломтика, р < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Дополнительная фигура 2H).

Затем протокол был применен к миокарду человека. Количество родообразных и жизнеспособных изолированных желудочковых кардиомиоцитов человека, полученных из ломтиков тканей, сравнивали в паре с числом, полученным из тканевых кусков тех же образцов миокарда(рисунок 3). Мы обнаружили, что изоляция от ломтиков миокарда дала большую долю стержнеобразной формы и лишь небольшую долю округлых кардиомиоцитов(рисунок 3A). Мы подсчитали миоциты в форме стержня из широко полевых изображений и нормализовали их количество по влажному весу тканей, используемых для изоляции. Количественная оценка показала, что изоляция от ломтиков миокарда привела к поразительно большему числу стержневых миоцитов, чем изоляция от тканевых кусков (45,0 и 15,0 против 6,87 и 5,23 клетки/мг, n No 7 изоляций, p lt; 0.05, парный двуххвостый т-тест) (Рисунок 3B). Кроме того, жизнеспособность была оценена с помощью анализажизнеспособности MTT 14, нормализации фотометрического поглощения formazan к общему количеству белка в лизате клетки. Фотометрическая квантификация подтвердила существенно более высокую жизнеспособность миоцитов после изоляции от ломтиков миокарда (4,76 и 0,47 против 1,09 и 0,18 а.е., n 3 изоляции, р-л; 0,05, в паре двуххвостый т-тест) (Рисунок 3C).

В общей сложности метод применялся к образцам миокарда из 30 человеческих сердец со временем транспортировки до 36 ч. Из 23 жизнеспособных клеток 30 образцов были получены для последующих экспериментов (см. также Дополнительная таблица 1). Пример неудачного эксперимента (т.е. lt;100 клеток на блюдо) показан на дополнительном рисунке 3. Здесь большинство клеток не переносят высокий внеклеточный кальций и гиперподряд. Мы оценивали сотрудие в миоцитах из 14 изоляций, и в двух случаях клетки не реагировали на электрическую стимуляцию. Обратите внимание, что техника работала не только с крупными образцами, полученными из взрослых сердец, но и с небольшими биопсиями (всего 40 мг) от детских сердец(дополнительный рисунок 4).

Чтобы продемонстрировать, что человеческие клетки изолированы с описанным протоколом могут быть подвергнуты структурному анализу, они были окрашены альфа-актинин, EC соединения белков L-типа кальция канала (LTCC) и ryanodine рецептор (RyR), а также клеточной мембраны и ядер, в соответствии с методом окрашивания, описанным недавно вкрысиных миоцитов 17 (Рисунок 4). Альфа-актинин окрашивание показало плотный, регулярный z-линии картины и средняя длина саркомера 1,92 и 0,06 мкм в отдыха кардиомиоцитов (n No 4, рисунок 4A). LTCC и RyR показали четкие кластеры и были, как и ожидалось, колокализованы вблизи клеточной мембраны и т-труб(рисунок 4B).

Потенциометрический краситель FluoVolt18 и чувствительный к кальцию краситель Fluo-417 были использованы, чтобы продемонстрировать, что человеческие кардиомиоциты, изолированные описанным протоколом, возбудимы и могут быть использованы для исследований клеточной электрофизиологии или возбуждения-сокращения связи(рисунок 5). Были проанализированы форма и продолжительность действия (AP)(рисунок 5A,B). Значения 50% и 90% AP продолжительность (APD50: 400,6 и 41,1 мс, APD90: 748,9 й 56,6 мс, n й 10 клеток) были в диапазонесообщилидругие желудочковые кардиомиоцитыот отсутствии человеческих сердец 4,6,7,9. Переходные кальция, записанные конфокальной линии сканирования Fluo4 загруженных клеток(рисунок 5C,D) показали ясно upstroke после стимуляции и приемлемого соотношения сигнала к шуму. Преходящая амплитуда кальция (максимальная F/F0)составила 2,9 и 0,5 (n 31 клетка). Сокращение кардиомиоцитов на сокращение можно увидеть на примере отклонения нижней клеточной границы, которая имела среднее значения 4,6 и 0,8% (n No 31 клетки).

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс протокола изоляции от ломтиков сердечной ткани человека. Тканевых блоков или биопсии из человеческого миокарда (вверху слева) встроены в низкоплавильной точки агарозы и 300 мкм толщиной ломтики генерируются с колеблющейся лезвие вибромы (верхняя середина). Ломтики переносятся в культурное блюдо и удаляются из окружающей агарозы (вверху справа). Пищеварение тканей осуществляется при 35 градусах Цельсия и 65 об/мин на нагретой и взволнованной пластине (средняя, слева) и включает в себя: (шаг 4.8) Инкубацию в номинально без кальция растворе, дополненном протеиназой, (шаг 4.10) Переваривание внеклеточной матрицы с коллагеназой, (шаг 5) Диссоциация и освобождение отдельных кардиомиоцитов с помощью миппов и труб. (Шаг 6) Медленное повышение внеклеточной концентрации кальция с 5 мкм до 1,5 мм с интервалом в 5 мин. (шаг 7) Шаг за шагом удаление механического некоупляемого моноксима 2,3-бутанедиона (BDM). Извлекаются родообразные и поперечные полосатые человеческие кардиомиоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Cardiomyocyte дает миокарда ломтик, перфузия, и кусок изоляции. (A) Репрезентативные световые микрографы крысиных кардиомиоцитов, изолированных либо через коронарную перфузию (перфузию), из вибромной ткани (ломтики миокарда), либо из рубленой ткани (куски ткани). (B)Соответствующий репрезентативный поток цитометрии точка участков от кардиомиоцитов изоляции описаны в. В качестве индикаторов детализации и размера сотовой детализации были использованы область бокового рассеяния (SSC-Area) и передняя область рассеяния (FSC-Area), соответственно. Схема заготовки ворот CM1 для кардиомиоцитов указывается черной линией и отображаются соответствующие доли от общего количества в процентах. (C)Средняя стандартная погрешность фракций кардиомиоцитов (CM1), оцениваемых с помощью текучно-цитометрического анализа, описанного в B от n 3 клеточных изоляций в группе. Изоляция от ломтиков миокарда и кусков тканей проводилась из тех же сердец (парный двуххвостый т-тест). Изоляция перфузией проводилась из целых сердец разных животных и сравнивалась с неспаренным двуххвостым т-тестом. 0,05, после многократной коррекции сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение урожайности и жизнеспособности человеческих кардиомиоцитов после изоляции от ломтиков миокарда и кусков рубленой ткани. (A)Репрезентативное изображение кальциеустойчивых желудочковых кардиомиоцитов человека после изоляции от ломтиков тканей. Преобладают родообразные и полосатые кардиомиоциты (черная стрелка), при этом лишь немногие округлые и гиперконтрактированные клетки (белая стрелка). (B) Количественная оценка кальциеустойчивых, стержневидных миоцитов, изолированных параллельно, либо из ломтиков миокарда или тканевых кусков, подсчитанных из широких полевых микрографов и нормализованных до влажного веса входного материала (в миллиграммах) от n No 7 парных изоляций. (C)Количественная оценка жизнеспособности кардиомиоцитов путем фотометрического измерения абсорбации красителя formazan после анализа MTT. Абсорбанс был нормализован до общего количества белка, оцениваемого BCA assay от n No 3 парных изоляций. 0,05, 0,01 л; 0,01 (парный двуххвостый т-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Микроструктурная характеристика человеческих кардиомиоцитов после изоляции. (A) Представитель конфокальных микроскопических изображений после иммуностинирования альфа-актинина (зеленый) и ядерного пятна с 4 ",6-diamidin-2-фенилиндол (DAPI, синий). Длина саркомера составила 1,92 и 0,06 мкм (n No 4 миоцитов), определяемых путем анализа спектра Фурье. (B) Представитель конфокальных микроскопических изображений фиксированного человека желудочковых кардиомиоцитов coimmunostained для L-типа кальция канала (LTCC) и сердечного рецептора райанодина (RyR). Также показана накладка RyR и LTCC (наложение) и окрашивание внеклеточной матрицы агглютинином зародыша пшеницы (WGA, пурпурный). Ядра были окрашены в DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Потенциал действия и внутриклеточный кальций преходящий в желудочковых миоцитах человека. (A) Двухмерное конфокальные изображения изолированного человека кардиомиоцита загружены с потенциметрическим красителем FluoVolt (зеленый, 488 нм возбудивания длины волны). Красная коробка указывает на элемент т-трубной системы, который был измерен с помощью быстрого сканирования линии во время стимуляции электрического поля на 0,5 Гц. (B) Средний и базовый нормализованный FluoVolt флуоресценции (F/F 0 )из пяти последовательныхпотенциалов действия, полученных конфокальной визуализации, как описано в. (C)Линия сканирования изображения изолированных человеческих кардиомиоцитов загружен кальция чувствительных красителя Fluo-4 AM (488 нм возбудительной длины волны) вдоль оси продольных клеток. Интенсивность флуоресценции показана в серых значениях «AU», а синие точки указывают на максимальный рост интенсивности флуоресценции (dF/dtmax)каждого пикселя вдоль отсканированной линии. Скорость выборки составила 529 Гц.(D) Кальций переходный полученный путем усреднения флуоресценции каждого пикселя вдоль отсканированной линии от изображения в C и нормализации до базовых значений до стимуляции (F/F0). Все эксперименты проводились при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Имя Состав в ммоль/л Добавки Ph Необходимый объем в mL
Решение 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 глюкозы, 70 глутамовой кислоты, 20 таурин, 10 бета-гидроксибутират, 30 BDM 2 мг/мл альбумин сыворотки крупного рогатого скота 7.3 с KOH 300
Решение 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 глюкозы, 70 глутаминовой кислоты, 20 таурин, 10 бета-гидроксибутират, 0,005 CaCl2, 30 BDM 10 мг/мл альбумин сыворотки крупного рогатого скота 7.3 с KOH 300
Решение 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 глюкозы, 70 глутамовой кислоты, 20 таурин, 10 бета-гидроксибутират, 1,5 CaCl2 10 мг/мл альбумин сыворотки крупного рогатого скота 7.3 с KOH 300
Модифицированный раствор Tyrode 130 NaCl, 0.42PO4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 глюкозы 2 мг/мл альбумин сыворотки крупного рогатого скота 7.3 с NaOH на 5% CO2 100
Решение для резки 138 NaCl, 0.332PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 глюкозы, 30 BDM 7.3 с NaOH 500

Таблица 1: Буферы и решения. Состав необходимых буферов и решений.

Дополнительная цифра 1: Проверка схемы гатирования кардиомиоцитов (CM1). Точечные участки из цитометрии потока, измеряющие область вперед- и бокового рассеяния (FSC-A, SSC-A), указывающие на размер и гранулированность обнаруженных клеток в контрольном образце (CTRL) от перфузионные крысиные кардиомиоциты и после инкубации кардиомиоцитов из того же препарата в течение 15 мин при 37 градусах в модифицированном растворе Тирода, содержащем 100 м кальция. Высокий внеклеточный кальций вызывает гиперконтракцию и округление родообразных кардиомиоцитов, что приводит к сокращению клеток (87,6% против 6,00%) в определенных воротах (CM1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительный рисунок 2: Кардиомиоцитные характеристики, изолированные перфузией или ломтиками. Длина клеток(A) и ширинаклеток (B) определялись из крысиных кардиомиоцитов, закрепленных непосредственно после изоляции через перфузию или от ломтиков миокарда микроскопией (n No 19 и n 21 клетки, соответственно). Длина саркомера(C) была определена на основе микроскопических изображений после иммуностинирования с помощью альфа-актинина и анализа Фурье (n No 24 и n 23 клетки, соответственно). Среднее время активации(D), максимальный F /F0 (E) и относительное сокращение (F) были оценены от Fluo-4 загруженных кардиомиоцитов, изолированных перфузией или от ломтиков миокарда и реагирующих на электрическую стимуляцию (n No 100/31 миоцитов в D, n No 104/25 миоцитов в E и n 42/7 миоцитов в F). Доля родообразных кардиомиоцитов(G), которые контракт на электрическую стимуляцию, оценивается путем подсчета общего числа стержнеобразных клеток и контрактильные клетки в десяти полях зрения на 200x увеличение в стандартном световом микроскопе была оценена для перфузии и изоляции ломтика (n No 452/276 клеток, соответственно). (H) Анализ, выполненный в G, но после 48 ч культивирования (n 371/329 клеток, соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительный рисунок 3: изоляция кардиомиоцитов человека с низкой урожайностью. Репрезентативное изображение светового микроскопа миоцитов из изоляции с преимущественно гиперподрядными (синими) или округлыми клетками (черными) и лишь немногими стержнеобразными и полосатыми клетками (белыми). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительный рисунок 4: Кардиомиоцит изоляции от детской биопсии сердца. (A) Изображение эндомиокардной биопсии (мокрый вес около 40 мг), полученной во время коррекционной операции по тетралогии Фалло у младенца. (B)Миокарда ломтик из ткани показано в A, встроенные в агарозу. (C)Кардиомиоциты, изолированные от ломтика миокарда, как показано в B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная таблица 1: Данные о пациентах. Указан список образцов, взятых у пациентов, включенных в данное исследование. Образцы были классифицированы в зависимости от типа хирургии, возраста, этиологии заболеваний и времени транспортировки, с соответствующим общим количеством образцов и числом успешных изоляций миоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя изоляция живых кардиомиоцитов была создана более 40 лет назад и до сих пор является необходимым условием для многих экспериментальных подходов в кардиологических исследованиях, она остается сложной техникой с непредсказуемыми исходами. Кардиомиоцитная изоляция через перфузию коронарных артерий с ферментным раствором обычно используется для сердец мелких животных и дает большое количество жизнеспособных клеток. Однако для этого требуется относительно сложная система и экспертиза. Кроме того, большинство образцов тканей человека не подходят для этого метода, из-за их небольшого размера или отсутствия ветвей коронарной артерии, что делает новые методы изоляции человеческих кардиомиоцитов желательными. Описанный здесь протокол основан на атрауматическом поколении тонких ломтиков сердечной ткани, которые затем подвергаются энзиматическому пищеварению. Он может быть применен к образцам миокарда из сердца животных и миокарда человека, таких как апические ядра из лево-желудочковой имплантации вспомогательных устройств, биопсии эндомиокарда от перегородки миэктомии, или эксплантированных сердец (см. Дополнительнаятаблица 1 ), и надежно производит достаточное количество жизнеспособных, кальциеустойчивых кардиомиоцитов,которые могут быть использованы дляпоследующих экспериментов, таких как кардиомиоциты.

Основной причиной более высоких урожаев миоцитов из виброма сократить ткани ломтиками, чем из фарша куски ткани может быть более низкая степень повреждения миоцитов во время нарезки. Когда коронарная перфузия невозможна, нарезка или заминка образца ткани необходима для увеличения контактной поверхности для переваривания ферментов. Размеры ломтика приблизительно 8 мм x 8 мм x 0,3 мм позволяют получить хороший доступ к ферментам из-за относительно большого соотношения поверхности к объему (7мм -1). С помощью ножниц аналогичное соотношение поверхности к объему (6 мм-1) может бытьдостигнуто путем заминки образцов на мелкие кусочки примерно 1 мм х 1 мм х 1 мм. Хотя повреждение миоцитов в ломтиках и фарш куски до энзиматической пищеварения не было количественно, нарезка на виброме, вероятно, вызывает значительно меньше вреда, поскольку она позволяет нежный резки в направлении волокна. В самом деле, было подсчитано, что в виброме сократить ломтиками менее 5% миоцитов повреждены19. Результаты показывают, что человеческие кардиомиоциты могут быть изолированы очень эффективно с протоколом при условии, с гораздо более высокой долей жизнеспособных клеток по сравнению с тканевыми кусками. Это в соответствии с протоколом, который использовал ломтики из предсердийткани 20. Наш метод дает до 200 кальциеустойчивых желудочковых миоцитов на миллиграмм ткани и обеспечивает возможность хранения или транспортировки сердечной ткани до 36 ч до изоляции. Это делает протокол применимым для лабораторий без кардиохирургии на месте и тем самым расширяет возможности для сотрудничества.

Критическими шагами в протоколе являются правильная обработка миокарда ломтиками на виброме и их пищеварении, а также заключительные шаги реинтродукции кальция и вымывания BDM. В отличие от другихметодов 19,21, сердечная ткань встроена в агарозу с низкой температурой плавления, чтобы избежать движения во времяпроцедуры нарезки 14,15. Это было необходимо для стабилизации блока ткани и для генерации однородных ломтиков. При встраивании ткани, агароза все еще должна быть жидкой, но температура не должна превышать 37-38 градусов по Цельсию, чтобы избежать повреждения клеток гипертермией. И наоборот, если агароза слишком холодная (Злт;35 градусов по Цельсию), она плохо связывается с блоком тканей и может сломаться во время нарезки. Для проверки жизнеспособности миоцитов после обработки вибромы предлагается простой анализ МТТ, который позволяет быстро оценить жизнеспособность клеток с помощью световой микроскопии, а также для количественной оценки спомощью фотометрического анализа 14,22. Повреждение кардиомиоцитов может также произойти во время реинтродукции внеклеточного кальция после периода инкубации врастворе 23,,24 без кальция. Это явление парадокс кальция в изолированных клетках может быть смягчено медленным, пошаговое повышение уровня кальция, чтобы кардиомиоциты адаптироваться. Этот шаг следует проводить осторожно во время непрерывного возбуждения при 35 градусов по Цельсию и с интервалом в 5 минут. Небольшое переохлаждение (21 градус по Цельсию) повышает толерантность к кальцию крыс кардиомиоцитов во время реинтродукции, которая в соответствии с предыдущимисообщениями 25. Тем не менее, человеческие кардиомиоциты не показывают серьезных различий в толерантности к кальцию при 35 градусов по Цельсию или 21 градусов по Цельсию. Использование BDM во время резки, пищеварения и реинтродукции кальция предотвращает сокращение миоцитов и клеточных затрат энергии, а также гиперконтракции и, следовательно, защитные. Тем не менее, для последующих экспериментов оценки сердечной контрактности или возбуждения-сокращения связи, BDM необходимо удалить26. Постепенное вымывание было применено, чтобы свести к минимуму спонтанные гиперконтракции. BDM может быть опущен, но это заметно увеличит количество гиперподрядных миоцитов, как это наблюдалось в предыдущих экспериментах и исследованиях6.

Описанный протокол использует раствор, который содержит высокий калий и только следы натрия для пищеварения. Это решение дало самые высокие урожаи стержнеобразных, поперечных кардиомиоцитов. Однако для энзиматического пищеварения требуется более высокая концентрация коллагеназы (4 мг/мл) по сравнению с пищеварением в нормальном растворе тирода (1,5 мг/мл). Высокий внеклеточный натрий может привести к внутриклеточной перегрузке натрия, усугубляя негативные последствия парадокса кальция, тем самым снижая урожайностьклеток 27. Поэтому предлагается использовать растворы с высоким содержанием калия и низким содержанием натрия. Высокая внеклеточная концентрация магния часто используется в кардиомиоцитовизоляции протоколов 3,28, и было показано, уменьшить ишемии-реперфузиитравмы 29,30 и улучшить сердечную функцию после длительных периодов холодной ишемии31. Поэтому применяемый здесь раствор также содержит высокую концентрацию магния (10 мМ). Тем не менее, было показано, что возбудимость, сила сжатия и скорость проводимости могут быть уменьшены высокими концентрациямимагния 32. Хотя эти эффекты были показаны обратимыми, воздействие на изолированные кардиомиоциты не может быть исключено. Таким образом, использование магния при физиологических концентрациях (1-2 мММ) может привести к снижению общей урожайности клеток, но повысить возбудимость.

Оптимальное время пищеварения довольно изменчиво, так как количество внеклеточной матрицы или фиброза может значительно варьироваться в организме человека, терпя неудачу миокарда. Если ткань по-прежнему прочно связаны во время диссоциации, только с несколькими жизнеспособными миоцитов освобождены, увеличивая время пищеварения в шагах 5 мин и регулярно проверки бесплатно миоцитов и текстуры ломтиков рекомендуется. Если ткань остается непереваренной после длительных периодов времени (45 мин), увеличение концентрации коллагеназы в шагах 1 мг/мл или тестирование другой партии ферментарекомендуется 16. Соответствующие значения, представленные в этой работе, могут служить грунтом для надежной изоляции кардиомиоцитов, но условия для оптимальной урожайности и жизнеспособности могут быть уточнены в каждой лаборатории, учитывая большую изменчивость ферментной деятельности и тканевых конституций. Преимущество метода заключается в том, что из-за небольшого количества необходимых тканей и простого рабочего процесса небольшими партиями, несколько тестов могут быть проведены параллельно. Таким образом, оптимальный протокол может быть достигнут быстро.

Поколение высококачественных ломтиков миокарда требует высокоточного виброма. Потребность в высокоточном срезе ткани или виброме является возможным недостатком метода, потому что он не легко доступен в каждой лаборатории. Устройство, используемое для этого исследования описывается более подробно в другомместе 14,15. Различные устройства были успешно использованы для генерации ломтиков миокарда другимигруппами 33,,34,,35. Следовательно, если настройки прогрессирующей скорости, амплитуды лезвия и частоты колебаний могут быть выполнены и горизонтальная ориентация лезвия с z-отклонением ниже 0,1 мкм доступна, успешное нарезка и изоляция должны быть осуществимы с другими вибромами. Кроме того, нарезка тканей является сложной и значительно продлевает продолжительность протокола (примерно 1-2 ч). Использование BDM в качестве механического развязывающего агента имеет защитные эффекты за счет снижения воздействия клеточной энергии, ишемической травмы и гиперконтракции26,36,37. Хотя отрицательный инотропный эффект BDM было показано, что быстро обратимым послевымывания 38,39, не ясно, если BDM может иметь неизвестные последствия для функции кардиомиоцитов40. Это исследование показывает, что клетки могут быть изолированы с высокой урожайностью после хранения тканей раз до 36 часов, и что человеческие кардиомиоциты могут быть выучны в течение трех дней после изоляции с помощьюэтого метода 17. Мы не заметили функциональных или структурных различий между миоцитами с коротким и длинным временем хранения. Однако эта оценка не оценивалась систематически. С другой стороны, для целых кроличьих сердец было показано, что функциональные различия между свежими сердцами и сердцами, подверженными воздействию холодной ишемии в внеклеточном растворе, содержащем 30мМ БДМ, были незначительными 31,и то же самое может быть верно и в данном случае.

Представленный протокол обеспечивает прочную основу для всех видов экспериментов с изолированными желудочковыми кардиомиоцитами и может быть особенно ценным для исследований образцов миокарда человека. С некоторыми приспособлениями, изоляция других сердечных клеток, таких как фибробласты или эндотелиальные клетки также кажется возможным41. Поскольку для этого требуется лишь небольшое количество тканей, которые могут быть отправлены в растворе холодного хранения из других лабораторий, применение протокола может уменьшить количество принесенных в жертву лабораторных животных. В самом деле, протокол был успешно применен к кролика и свиной сердечной ткани. Кроме того, по мере того как эксперименты с долгосрочными культивируемыми ломтикамимиокарда увеличивают 21,33,42 ипостоянн улучшены для того чтобыобеспечить оптимальные условия культуры 15,,43,,44, метод можно охотно придать после культивирования ломтика. Одноклеточная изоляция от культивируемого миокарда может, таким образом, помочь охарактеризовать изменения в кардиомиоцитах после фармакологических или физических вмешательств в пробирке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Андреаса Диндорфера из Вальтер-Брендель-Центр экспериментальной медицины, LMU Мюнхен, за помощь в нарезке протокола. За предоставление образцов миокардной ткани мы хотели бы поблагодарить Газали Минабари и Кристиана Хейма из кафедры кардиохирургии, университетской больницы Эрланген, Хендрика Милтинга из Института Эриха и Ханны Клессманн, Рур-Университета Бохума и Муханнада Алкассара из кафедры детской кардиологии Университетской больницы Эрлангена. За поддержку цитометрии потока мы хотели бы поблагодарить Симона Вёлькла и коллег из центра трансляционных исследований (TRC), Университетской больницы Эрлангена. Мы также хотели бы поблагодарить Лоренца МакКарго и Селин Грёнингер из Института клеточной и молекулярной физиологии Эрлангена за отличную техническую поддержку.

Эта работа была поддержана JK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований), Междисциплинарный центр клинических исследований (ИЗКФ) в университетской больнице Университета Эрланген-Нюрнберга, и Universit'tsbund Эрланген-Нюрнберг.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Tags

Биология выпуск 159 человеческая сердечная недостаточность ломтики миокарда кардиомиоцитная изоляция вибром контрактильные миоциты кальциевая визуализация сердечное возбуждение-сокращение связи
Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter