Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Protein-Protein Interaktionen ich n-vitro-

Traditionell sind die Kristallographie und Kernspinresonanz-Experimenten mit Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) kombiniert die Technologien entschieden, genau zu beschreiben, die dreidimensionale Architektur der Proteine und ihre Funktion durch Ableiten hinterfragen ihre hochauflösende strukturelle Details. Proteine, jedoch sind keine statischen Strukturen und können eine Vielzahl von Konformationsänderungen und Schwingungen in Zeit und Raum zu unterziehen. Deshalb ist die strukturelle Informationen aus kristallographischen oder CryoEM Daten müssen mit anderen Techniken (z. B. Molekulardynamik-Simulationen und Einzelmolekül-Techniken) ergänzt werden: die Funktion eines Proteins ist im Zusammenhang mit seiner Konformationsänderungen Änderungen und Interaktionen und diese Information ist nicht vorhanden in einer statischen Struktur. Um intramolekularer Dynamik untersuchen, sind Techniken, basierend auf einzelnen Moleküls Forster Resonanz Energietransfer (SmFRET) sehr effektiv¹. Diese Ansätze sind verschiedene Subpopulationen von Molekülen in komplexen Medien beurteilen können. Dies ist sehr wichtig, da diese Änderungen schnelle sind und während der Erfassung der Daten (d. h. Nanosekunde, zweite Reihe treten).

Zwei Hauptansätze werden häufig eingesetzt, um zu erkennen und diese Änderungen zu quantifizieren: Proteine in Lösung und Oberfläche-Immobilisierung. Für den Nachweis der Inter molekularen Wechselwirkungen und insbesondere den Prozess der Dimerisierung von Liganden induzierte, ist SmFRET nicht immer das beste Werkzeug. In der Tat Bund richtet sich nicht nur auf der Strecke (≈10 nm), sondern auch auf die Ausrichtung der beiden Dipole (Donor und Akzeptor, χ²) und die Überlappung der Spender-Emission mit den Akzeptor Absorptionsspektren², aber vielleicht diese letzte Bedingung ist weniger vorausgesetzt, dass der Experimentator kann wählte wichtig, das richtige Paar Bund. Ein besonderer Nachteil von SmFRET zum Sondieren Homo-Dimerisierung stammt aus der Kennzeichnung des Proteins des Interesses: für Hetero SmFRET Dimerisierung kann nur festgestellt, bis zu 50 % (d.h., Hetero-FRET werden nur Donor-Akzeptor zu erkennen und Akzeptor-Spender Homo-Dimere aber nicht Spender Spender oder Akzeptor-Akzeptor, die die anderen 50 % von der Dimere). Die Verwendung von Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) und Derivaten (FCC, etc.³), Protein Verbreitung Konstanten und verbindliche Konstanten in Vitro zu ermitteln ist eine weitere Alternative. Diese Ansätze sind nicht in der Lage, vollständig Homo-Dimerisierung entweder zu quantifizieren, wie FCS 1 Maßnahmen Konzentration und Diffusion, und den Radius und die Verbreitung Koeffizienten eines diffundierende Teilchen sind sehr schlecht das Molekulargewicht abhängig; zum Beispiel wird ein 10-divisibel Anstieg des Molekulargewichtes nur eine 2.15 Falte Änderung in der Verbreitung Koeffizient⁴verbunden. Bei zweifarbigen FCS oder FCC werden nur 50 % der Homo-Dimere aus dem gleichen Grund wie oben gesehen. Praktische und quantitative Ansätze, Homo-Dimerisierung in Vitro und in Vivo zu erkennen sind Homo-Bund⁵ und der Anzahl und der Helligkeit (N & B)⁶. Angesichts der Tatsache, dass Homo-FRET erfordert spezielle Instrumente Erholung von der Anisotropie-Wert (z. B. optische Elemente/Analyzer, die parallele und senkrechte Polarisation wiederherzustellen), N & B präsentiert hier als eine günstige Methode, um erkennen Sie Protein Homo-Dimerisierung und Aggregation. Es kann sein, beschäftigt, sowohl in Vitro und in Vivo eine kommerzielle Einrichtung.

Anzahl und Helligkeit

N & B wurde erst kürzlich überarbeitete⁷. Dieser Beitrag konzentriert sich auf die Anwendung der Technik in lebenden Zellen. Es lohnt sich, reproduzieren die mathematische Formalismus hier als diese Gleichungen auf die Daten angewendet werden gesammelt in Vitro. Erstens ist es notwendig, einige Begriffe und mathematische Mengen zu definieren:

• Eine Entität ist eine Reihe von Molekülen, die miteinander verbunden sind.
• Die Helligkeit ε einer Entität ist die Anzahl der Photonen, die es pro Zeiteinheit (pro Frame) aussendet.
• n ist die Anzahl der Elemente vorhanden.
• Für eines bestimmten Pixels im Laufe einer Bilderserie ist < i > seine mittlere Intensität und σ² die Varianz in ihrer Intensität.

Dann, mit Photon counting Detektoren und vorausgesetzt, mobile Einheiten und keinen Hintergrund,

Dabei ist N die scheinbare Zahl und B ist die scheinbare Helligkeit. Dies führt zu

Dalal Et al. ⁸ zeigte, dass mit analogem Equipment, man drei Korrektur Begriffe braucht: S-Faktor, der Hintergrund- Offsetund die Auslesen Lärm σ₀². Dann wieder vorausgesetzt, mobile Einheiten,

Geben

Beachten Sie, dass die obige Gleichung für unterscheidet, die in Dalal Et Al. ⁸ und einer nachträglichen Prüfung. ⁷ in Dalal Et Al. S im Nenner wurde durch einen Tippfehler verzichtet und dieser Fehler wurde bei der Überprüfung reproduziert. Die obigen Gleichung ist die richtige. Anweisungen für die Messung von S, Offset und σ₀² - zusammen mit einer Erläuterung ihrer Bedeutung - sind gegeben durch Dalal Et Al. ⁸

Die Helligkeit ε ist proportional zu den Oligomeren Zustand der diffundierende Entitäten: ε werden zweimal für Dimere so groß, wie es für Monomere, dreimal so groß für Trimere ist, wie es für Monomere, für Hexamers doppelt so groß ist wie für Trimere und so weiter. Auf diese Weise messen die Helligkeit ε kann man jede Art von Multimerization quantifizieren.

Gibt es eine Mischung aus Oligomeren Staaten vorhanden, ist Anzahl und Helligkeit nicht in der Lage erholt die Oligomeren Einzelstaaten vorhanden. Dies ist eine Einschränkung der Technik.

Detrend-Algorithmus und Nandb software

Die Bedeutung der Korrektur für Immunofluoreszenz wurde betont zuvor⁹. Immunofluoreszenz tritt unweigerlich während der Lichtmikroskopie Experimente im Zeitraffer-Modus; sowohl in lebenden Zellen und in Vitro. Viele Ansätze wurden in der Literatur zu korrigieren zum Bleichen⁷beschrieben. Die exponentielle filternde Technik mit automatischer Wahl der detrending Parameter T ist die derzeit besten. Es ist kostenlos, open Source Software Nandb⁹integriert. In der Tat kann Software, die die Benutzer manuell wählen ihre detrending Parameter erfordert zu falschen Ergebnissen führen, da diese Parameter Wahl wahrscheinlich willkürlich und falsch sind. Der Automatische Algorithmus prüft die Daten und bestimmt den entsprechenden Parameter, ohne die Notwendigkeit der Benutzer eingreifen⁹. Auch mit die beste Wahl von glättende Parameter detrending hat seine Grenzen und funktioniert auch nur mit Immunofluoreszenz Prozentsätze niedriger als 25 %, wie abgebildet, mit Simulationen⁹. Interessant ist, wenn Sie die automatische detrending Routine zu verwenden, die Genauigkeit ist so, dass man mit geringer Helligkeitswerten arbeiten kann (sogar B < 1.01), und somit geringe Intensitäten, und immer noch präzise genug, um Homo-Dimerisierung zu quantifizieren.

Immunofluoreszenz verursacht auch ein weiteres Problem: die Anwesenheit von Photobleached Fluorophore in einem komplexen Multimer. Dies macht z. B. ein Trimer erscheinen wie ein Dimer, wenn eines der drei Geräte in das Trimer nicht fluoreszierenden ist. Hur und Mueller¹⁰ zeigte, wie man dies zu korrigieren und diese Korrektur wurde auch in einer nachträglichen Prüfung⁷hervorgehoben. Die Nandb-Software enthält diese Korrektur-⁹.

Die FKBP12 F36V System

FKBP12F36V ist ein Protein, das natürlich nicht oligomerize aber bekannt ist, auf den Zusatz von AP20187 Medikamenten (umgangssprachlich bekannt als die BB dimerizing Liganden)^11,12Dimere. Dies macht es ein idealer Prüfstein für Anzahl und Helligkeit: mit beschrifteten FKBP12F36V, eine Verdoppelung der Oligomere Zustand nach Zugabe von BB beobachtet werden sollte.

(1) FKBP12 F36V - mVenus Reinigung

1. Transformieren Sie (DE3) pLysS Zellen mit pET22b Vektor, monomerized menschlichen FKBP12F36V¹² und N-terminale His6 und mVenus-Tags (Vektor auf Anfrage erhältlich) enthält. Platte Zellen auf LB-Agar mit 50 µg/mL Ampicillin und 34 µg/mL Chloramphenicol ergänzt.
2. Transformierte Kolonien in 100 mL LB Starterkultur und wachsen für 16-20 Stunden bei 37 ° C mit schütteln.
3. Verdünnen Sie dichten Starterkultur (OD600 > (1) 1: 100 in LB-Medium (2 x 500 mL Chargen) und wachsen für 2-3 Stunden zu OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 u/min).
4. Cool Kulturen auf Eis. Mit 250 µM IPTG induzieren und 16-20 Stunden bei 21 ° C, 200 u/min zu wachsen.
5. Ernten Sie Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 20 Minuten.
6. Aufschwemmen Sie Pellet in 40 mL IMAC Puffer ein (20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol) mit EDTA-freie Protease-Inhibitoren (1 Tablette pro Zelle Pellet) ergänzt.
7. Beschallen Zellen (500 Watt, 20 kHz, 40 % Amplitude, 9 s auf, 11 s aus für 15 min) auf Eis und Ernte lösliche Material durch Zentrifugation bei 20.000 x g.
8. Transfer lösliche lysate zu einem konischen Kolben und 2 mL Harz (siehe Tabelle der Materialien). 1 Stunde mit 105 u/min inkubieren
   Hinweis: Nickel Sepharose kann auch für diesen Schritt IMAC verwendet werden.
9. Ernten Sie Harz zu und waschen Sie mit 250 mL IMAC Puffer A, gefolgt von 500 mL IMAC Puffer B (20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol).
   Hinweis: Erhöhen Sie um 50 mM Imidazol wenn Nickel Sepharose Harz verwenden.
10. Eluieren Sie His6-markierte Protein mit IMAC Puffer C (20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol).
11. Spritzen auf eine Größe Ausgrenzung Spalte (siehe Tabelle der Materialien) in 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT equilibriert. FKBP12F36V hat seinen Höhepunkt Elution bei 87,71 mL auf die Spalte, die wir verwendet.
12. Reinheit über SDS-PAGE und Pool zu beurteilen und bei Bedarf konzentrieren.

2. Vorbereitung der Multiwell Plate Array

1. Auftauen der gereinigten FKBP12F36V (oder mit der Bezeichnung Protein des Interesses) von-80 ° C.
2. Bereiten Sie eine Lösung von 100 nM gereinigt FKBP12F36V (mittlere, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DVB-t). Beschallen Sie und Zentrifugieren Sie (schnelle Runde von 13.000 u/min), um die Bildung von Aggregaten zu verhindern.
3. Pipette 100-200 µL in eine Kammer 8 gut Beobachtung mit einem Glasboden.
4. Hinzu kommt die BB Dimerizer Endkonzentrationen von 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 und 500 nM^12,13.
5. Als Referenz, bereiten Sie eine Lösung von 100 nM mVenus allein zur Aggregation und Niederschlag Auswirkungen zu bewerten und einen Helligkeitswert für das Monomer mit den gleichen Einstellungen Erwerb zu erholen.

3. Kalibrierung-freie konfokale Erwerb

1. Starten Sie die konfokale System (Abbildung 1). Kein Licht Mikroskop konfokale Abtastsystem ausgestattet mit digitaler Detektoren oder gut charakterisierten analogen Detektoren⁸, und in der Lage zu halten eine Konstante Verweilzeit für jedes Pixel erworben würde funktionieren.
2. Legen Sie den Strahlengang Erregung:
   1. Schalten Sie das 514 nm Laser und setzen es bei 20-100 nW Strom am Ausgang des Ziels (für FKBP12F36V-mVenus).
   2. Wählen Sie das 63X1.4NA Ziel oder ein Halsband Korrektur Wasser eintauchen Ziel für FCS entwickelt.
   3. Schalten Sie ein HyD, APD oder kalibrierten PMT-Detektor. Detektoren in der Lage, Photon counting sind vorzuziehen, da in diesem Fall, Berechnung von S, Offset und σ₀-² sind nicht erforderlich.
   4. Wählen Sie die Emissions-Fenster von 520-560 nm
   5. 1 luftig Einheit für die entsprechende Emission ~ 545 nm die Lochblende festgesetzt.
   6. Stellen Sie den Erwerb Modus mit 16 x 16 Pixel
   7. Die Pixel wohnen Zeit t_wohnen so eingestellt, dass es t_Rahmen erfüllt >> T_D >> t_wohnen, wo _D die Verweilzeit des diffundierende Protein- und t ist _Rahmen ist die Frame-Rate. Das entsprach Einstellen der Haltezeit ~ 13 µs.
      Hinweis: Einige kommerzielle Hersteller hatte Scanner, die nicht die Verweildauer pro Pixel konstant hielten. Diese Konstanz ist entscheidend für die Methode funktioniert.
   8. Legen Sie die Pixelgröße bei ~ 120 nm.
   9. Wählen Sie den Xyt -Übernahme-Modus und wählen Sie die Anzahl der Frames pro Akquisition und gut (zum Beispiel 5.000) erworben werden.
   10. Wenn das System mit hohem Durchsatz-Modus ausgestattet ist, stellen Sie die Koordinaten jedes gut und die Zahl der Übernahmen pro Bohrloch um den Prozess zu automatisieren.
       Hinweis: Achten Sie, die Anwesenheit von einem Wasserspender für Wenn ein Eintauchen-Ziel verwenden.
   11. Wenn das System ist ausgestattet mit eine Perfusion System laden die BB-Lösung und Programmieren der Perfusion beginnen rechts-nach 5000^th Rahmen um die Kinetik der Dimerisierung beim Erwerb von z. B. 10.000 Bilder zu bewerten.
3. Einen Tropfen Öl in das Öl eintauchen Objektiv / Wasser wenn ein Halsband Korrektur Wasser eintauchen Ziel für FCS entwickelt.
4. Montieren Sie die 8 gut Beobachtung Kammer in die Stufe.
5. Wählen Sie den richtigen Brunnen und konzentrieren Sie sich auf die Lösung.
   Hinweis: Wichtig: vermeiden Sie mit Schwerpunkt in der Nähe der unteren Glas, Reflexion und Streuung zu vermeiden. Wenn tiefer Konzentration in der Lösung, trennen Sie die Option automatische Fokus.
6. Starten Sie den Erwerb und speichern Sie die resultierenden Stapel Bilder im TIFF-Format zu.

4. detrend und Helligkeit Analyse mit der R-Paket-Nandb

1. Als eine Vorverarbeitung Qualitätsprüfung verwenden Sie ImageJ¹⁴ werfen einen Blick auf die Bilder und die Intensität Profil wiederherstellen wie in Abbildung 2einegezeigt. Dies ist nützlich, um festzustellen, ob zuviel Immunofluoreszenz aufgetreten ist. Wenn es zu viel bleichen gibt, eignet sich die Daten nicht für weitere Analysen.
   Hinweis: ImageJ kann auch Bilder in TIFF aus kommerziellen Formaten konvertieren nützlich sein. Die nachfolgend beschriebene Nandb-Software funktioniert nur mit TIFF-Dateien.
2. Downloaden Sie und installieren Sie R und RStudio^15,16. Es empfiehlt sich, downloaden und installieren Sie R zuerst, dann RStudio.
   Hinweis: Was folgt, ist eine Beschreibung, wie das Nandb R-Paket verwenden. R Sprachkenntnisse ist nicht erforderlich, verwenden Sie Nandb, aber es Leben einfacher machen wird.
3. Installieren Sie das Nandb-Paket.
   1. Öffnen Sie RStudio und geben Sie in der Konsole, install.packages("nandb") und warten Sie die Installation.
4. Lernen Sie Nandb kennen
   1. Überprüfen Sie die manuelle¹⁷.
   2. Überprüfen Sie die integrierte RStudio-Hilfe für verschiedene Funktionen. Die wahrscheinlichste Funktion verwendet werden wird, mit brightness() werden. Anzeigen die Hilfe-Datei für diese Funktion durch Eingabe? Brightness() an der Konsole.
5. Helligkeit zu berechnen
   1. Also muss man eine Image-Datei auf dem Desktop mit dem Namen img001.tif (Beachten Sie, dass "Nandb" nur mit TIFF-Dateien funktioniert). Man kann die Helligkeit des Bildes berechnen:
      b <-Helligkeit ("~/Desktop/img001.tif", Tau = "auto")
      1. Dies weist die Helligkeit des Bildes an die Variable b in R. Das Tau = "Auto" wird sichergestellt, dass das Bild korrekt vor Helligkeit Berechnung trendbereinigte ist. Die häufigste, was hier zu tun ist, berechnen Sie den Mittelwert oder mittlere Helligkeit des Bildes. Dies kann man durch Eingabe von mean(b) oder median(b). Man kann auch die Helligkeit Bild auf dem desktop mit schreiben.
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Sagen Sie, man hat Ordner voller Bilder Images_folder auf dem Desktop und muss man die Helligkeiten dieser Bilder zu berechnen und die Helligkeit Bilder als TIFF-Dateien zu schreiben. Dann sehen? brightness_folder(). Diese Funktion verarbeitet einen ganzen Ordner auf einmal:
      Brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", Tau = "auto")
      Dies ist besonders gut für diejenigen, die eine Software, die sie zu R bevorzugen, da aller Dateien in einem einzigen Befehl verarbeitet werden, und dann man weiter mit der Ausgabe Helligkeit TIFF-Bilder in ihrer gewählten Software arbeiten gehen kann, sei es ImageJ¹⁴ , Python oder etwas anderes.

Detrending und Monomeren Helligkeit

Sobald die Daten erhalten hat, kann man die Helligkeit Berechnungen durch, um festzustellen, die Oligomeren Zustand des Proteins des Interesses in der Lösung starten. Auch wenn die Wirkung der Bleiche in Lösung möglicherweise nicht so drastisch wie es sein kann, in Vivo, die Intensität-Ablaufverfolgung wird wahrscheinlich noch nicht stationäre bedeuten, möglicherweise aufgrund photophysikalischen Effekte im Zusammenhang mit dem Fluorophor,¹⁸ aber die Gründe dafür sind nicht vollständig geklärt. Dies wirkt sich bei der Berechnung der Helligkeit; beim Versuch, Monomer-Dimer Übergänge zu bestimmen, ist dieser Aspekt wichtig. Durch die Anwendung des Automatisches Algorithmus, um die Daten in Abbildung 2einedetrend, die Intensität-Ablaufverfolgung ist richtig korrigiert, bietet einen genaueren Wert für die Helligkeit des FKBP12F36V-mVenus in Lösung. Vor Zugabe der BB, ohne detrending, B = 1.026, während nach detrending, B = 1.005 (Abbildung 2b).

Bestimmung der FKBP12 F36V -mVenus Monomer-Dimer Übergänge in-vitro-

Im Abschnitt Protokoll angegebenen 20.000 Bildsequenzen des gereinigten FKBP12F36V - mVenus in 100 nM-Lösung als erworben wurden. Nach 10.000 Bilder erworben wurden, wurde das Homodimerizer Medikament BB beim Erwerb zur Projektmappe hinzugefügt. Jeder aufeinanderfolgende Reihe von 5.000 Frames analysiert wurde (Abbildung 3). Die mittlere Helligkeit 5 Minuten nach BB Zusatz B = 1,010, die eine 2-fache Erhöhung zeigt eine FKBP12F36V Dimer ist. Die Kinetik des Prozesses zeigt Abbildung 3b; die Verzögerung zwischen BB Ergänzung zu FKBP12F36V Dimerisierung voll betrug ca. 2 Minuten.

Identifikation von proteinaggregaten

Eine Reihe von proteinaggregaten wurden sowohl in einer begrenzten Anzahl von Frames, als auch in der Intensität-Ablaufverfolgung (Abbildung 4) erkannt. Diese Aggregate kommen natürlicherweise in Lösung, bei der Arbeit mit Proteinen und durch beschallen und/oder Erhöhung der Protein-Verdünnung beseitigt werden können. Man muss jedoch in einigen biologischen Problemen Übergänge zwischen Monomeren und große Aggregate zu erkennen. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel, wo ein FKBP12F36V Protein Aggregat verbreitet durch die Beobachtung Lautstärke (Bilder 16 x 16); für unsere bisherigen Berechnungen, die diese Daten verworfen wurden, ist jedoch ein Beispiel in Abbildung 4 dargestellt, denen zufolge diese Aggregate können erkannt werden und mit den gleichen Einstellungen und Ansatz charakterisiert. Auf den ersten Blick, wenn die 5000 Bilder auswerten, kann man die durchschnittliche Helligkeit zu erholen, FKBP12F36V-mVenus mit BB behandelt (B = 1,010). Das rohe Helligkeit Bild anzeigen, sieht man deutlich, allerdings eine Region of Interest von ungefähr 8 Pixel mit einem hohen Wert von B ≈ 1.080. Diese Region von Interesse fällt mit ein paar Frames bei t = 34-37 s, wo eine FKBP12F36V Aggregat in der Beobachtung der Umgebung verbreitet. Das Aggregat bleiben nicht in der Beobachtung Volumen für lange genug, um seine Größe genau zu bestimmen.

Abbildung 1 . Anwendung von N & B Protein Monomer-Dimer Übergänge in Lösung zu erkennen. (a) vereinfachte Strahlengang von einem Laser-scanning-Mikroskop (LSM) mit einer Laserquelle ausgestattet (am 514 nm bei mVenus mit der Bezeichnung Proteine) objektiver Eintauchen (in unserem Fall ein 63X1.4NA Öl) (blaue Pfeile) gerichtete beleuchten eine 100 nM-Lösung von FKBP12F36V-mVenus-Lösung. Die Emission Fluoreszenz (grüne Pfeile) durchläuft einen dichroitischen Spiegel richtet sich an ein Bandpassfilter, der das Emissions-Licht reinigt, und einer Lochkamera auf 1 luftig Einheit befindet sich direkt vor einen Punkt digitalen Detektor in der Lage, Photon counting. (b) ein konfokale Volumen der Beleuchtung wird durch 16 x 16 Pixel beleuchten einzelne FKBP12F36V-mVenus-Moleküle, die betreten und verlassen das Gaußsche Form konfokale Volumen produziert eine Reihe von Fluoreszenz intensitätsschwankungen gescannt. (c) Bild-Serie im Laufe der Zeit erworben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Automatische detrending wird benötigt, um eine Bevölkerung von Monomeren in Lösung genau zu messen. (a) ein Stapel von 5000 16 x 16 Pixel großen Bildern erworben wurde, wie im Protokoll Abschnitt beschrieben. Die Intensität des ersten Frames ist zusammen mit der durchschnittlichen Zeitaufgelösten Intensität Profil gezeigt, die lange Amtszeit Schwankungen zeigt, die zu bleichen und andere Lösungsmittel und/oder Photophysic Wirkungen in Zusammenhang stehen könnten. Unabhängig von der Ursache für diese langfristige Schwankungen sie Einfluss auf die Helligkeit Berechnungen und daher erfordern detrending. Ohne automatische detrend, erhält man B = 1.026, während nach automatischen detrending, B = 1.005. Auch die Helligkeit ohne (Platten Links, zweite Reihe) und mit (Paneele rechts, zweite Reihe) glatt Filterung wird angezeigt. (b) die gleichen Daten in dargestellt (a) war trendbereinigte und die Ergebnisse in Bezug auf Intensität und Helligkeit dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . In-vitro-N & B ist in der Lage, den Übergang zwischen FKBP12F36V Monomere und Dimere in Echtzeit zu lösen. Die Zugabe des Medikaments Dimerizer BB führte zu einem zweifachen Anstieg in wahre Helligkeit direkt nach 2 min (von 0,005 zu wahren Molekulare Helligkeit 0,010). (a) die Intensität des ersten Frames wird zusammen mit der mittleren Intensität Profil des trendbereinigte Bildes angezeigt. Die Helligkeit ohne (Platten Links, zweite Reihe) und mit (Paneele rechts, zweite Reihe) glatt Filterung wird angezeigt. (b) bedeuten Helligkeit aufgetragen (alle 5000 frames) mit der wahren Molekulare Helligkeit ε. Die Dimerisierung erfolgt in 2 Minuten nach BB Zugabe (t = 1 min) bei t = 4 min. Die angepasste Kurve ist eine sigmoidale Funktion die Tendenz zur Dimerisierung nach Zugabe des Medikaments Dimerizer (BB) zu betonen. Fehlerbalken darzustellen der Standardfehler von der Helligkeitsverteilung zu jedem Zeitpunkt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . In-vitro-N & B, um die Größe von proteinaggregaten in Lösung zu beheben. (a) Zeitaufgelösten Intensität trendbereinigte Spur für den Erwerb von FKBP12F36V-mVenus sind zusammen mit Helligkeit Bildern gezeigt (zweite Zeile). (b) die Zeitaufgelöste trendbereinigte Intensität-Ablaufverfolgung zeigt ein Maximum an Intensität, die mit einem roten gepunkteten Kreis hervorgehoben ist (oben links). Der erste Frame der Intensität, die diesem bestimmten Zeitpunkt entspricht (t = 34 Sekunden) wird angezeigt und ein roter Pfeil zeigt eine FKBP12F36V-mVenus-Aggregat Beleuchtung betreten. Ein genauer Blick in das geglättete Helligkeit-Bild zeigt eine Region von Interesse, die hohe Oligomere Staaten enthält und der Rest des Bildes enthält eine Mischung aus Monomeren und dimeren mit einem Durchschnitt von B = 1,008. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

N & B ist eine Technik, um Multimerization mit kommerziellen Licht Scannen konfokale Mikroskopen ausgestattet mit digitaler Detektoren erkennen. Dieser Ansatz ist sehr attraktiv im Vergleich zu single Point FCS, FCC und SmFRET weil es kostenlose Kalibrierung und die Berechnung der Helligkeit ist unkompliziert und Konzentration unabhängigen⁶. Es ist von großer Bedeutung, jedoch für Bleichen und langfristige intensitätsschwankungen zu korrigieren, bevor Sie Helligkeit Berechnungen⁹durchführen; ein leichter Anstieg der Helligkeit durch Bleichen und andere Artefakte könnte als eine Zustandsänderung Oligomere fehlinterpretiert werden, (wie in Abbildung 2einegesehen) Wenn detrending vernachlässigt oder nicht falsch durchgeführt. Die Verwendung des automatischen detrend Algorithmus ermöglicht eine genaue Helligkeit Berechnungen.

Es ist wichtig, einige Regeln zu folgen, wenn die Bilder zu erwerben. Erstens sollte die Verweildauer der Moleküle in die konfokale Volumen, und damit ihre ständige Verbreitung bekannt sein, um die richtigen Parameter des Systems der konfokalen festgelegt; wohnen Sie die Verweilzeit der beschrifteten Moleküle muss zwischen den Pixel wohnen Zeit und die Frame-Zeit-⁷. Die Wahl der richtigen Fluorophor ist entscheidend. Eine helle und stabile Fluorophor ist notwendig für gutes Signal, Rauschen und minimale Immunofluoreszenz. Laserleistung sollte zu bleichen relativ niedrig sein. Photon-Grafen von 1 oder 2 pro Pixel sind ausreichend. Halten zählt niedrig ist auch entscheidend für Detektor-Pile-Up zu vermeiden. Die Technik meistert mit niedrigen Photon Budgets besser als es mit bleichen umgeht. In diesem Protokoll ist mVenus beschäftigt; Das ist eine relativ helle Fluorophor, vergleichbar mit eGFP¹⁹. Eine Alternative ist die Verwendung von Nanoboosters, die selektiv ein fluoreszierendes Protein abzielen; Diese können wesentlich heller als herkömmliche Fluorophore²⁰sein.

In Bezug auf Hardware digitale Photon counting Detektoren erleichtern die Quantifizierung, aber N & B ist mit analogen Detektoren möglich, sofern man einige Aufnahmeparameter erholt hat. ⁸

Obwohl andere Ansätze wie Anisotropie Homo-Dimerisierung, mit dem Aufkommen der neuen Software, Analyse, vereinfachen erkennen kann, steht N & B allein als zugänglich Ansatz zur Erkennung und Quantifizierung von Protein-Interaktionen und Oligomerisierung, beide in vitro und in lebenden Zellen.