Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

In questo video, vi presentiamo un completo unico esperimento di tracciamento di particelle, utilizzando quantum-dots rivolti ad un recettore di membrana specifico. L'obiettivo principale di questo esperimento consiste nel discriminare differenti tipi di comportamenti diffusione molecolare misurata nella membrana plasmatica di cellule vive. Infatti, i movimenti molecolari che derivano a livello della membrana in genere può discostarsi dalla diffusione browniano essendo linearmente diretto o confinata all'interno nanodomains ^26-29, per esempio. Il nostro obiettivo è contemporaneamente in seguito come molti recettori tecnicamente possibile, di fornire un'istantanea della varietà risultante nelle dinamiche che si verificano all'interno della membrana di una cellula dal vivo. Questo è infine previsto per consentire decifrare dei meccanismi che regolano segnalazione cellulare recettore di superficie.

1. Coltura cellulare

1. Preparare il campione cellulare: utilizzare aderenti COS-7 cellule che esprimono endogenamente l'epidermal growth factor receptor (EGFR) ^30. Quandolavorare con le cellule vive senza antibiotici assicurarsi di non avere latente sub-contaminazione rilevabile mediante appropriate tecniche sterili in qualsiasi momento durante la preparazione.
2. Crescere le cellule in mezzo completo (DMEM con 10% siero di vitello, glutammina 1%, 1% HEPES e sodio piruvato 1%, vedi tabella di reagenti specifici indicati), a 37 ° C con il 7% di CO _2, avendo cura di disporre in sub-confluenti, la crescita esponenziale prima di diffondersi in Lab-Tek.
3. Il giorno prima dell'esperimento, diffondere 5000 cellule / pozzetto a 8-ben camere (Lab-Tek) e incubare durante la notte. Contare le cellule assicura una densità costante di cella, quindi un rapporto riproducibile dei quantum-punti per cella.

2. Cella Labeling

Preparare quantum-dots con un rivestimento specifico. Quantum-dots sono nanoparticelle fluorescenti composte da semiconduttori. Queste nanoparticelle presentano un elevato interesse perché sono molto luminosi e fotostabili rispetto alla classicasonde fluorescenti ^31,32, che permette raggiungimento di un opportuno segnale di rumore (SNR) per l'imaging singola molecola.

1. Prima l'esperimento, produrre frammenti Fab contro EGFR dalla linea cellulare di ibridoma (mAb 108, ATCC HB-9764), mediante digestione con papaina come descritto in precedenza ^21.
2. Fab coniugato con biotina, come da istruzioni del produttore (EZ-link solfo-NHS-LC-biotinylation Kit; Thermo Scientific, Fig. 1A.).
3. Utilizzare quantum-dots funzionalizzati con streptavidina (Invitrogen) e che emette a 605 nm (lunghezza d'onda di emissione ottimale per la brillantezza, l'individuazione e separazione dal cellulare autofluorescenza).
4. Preparare la soluzione di etichettatura in mezzo completo (vedi tabella di reagenti specifici), per saturare i streptavidins presenti intorno alle quantistica per punti, così come per prevenire l'aggregazione e legame non specifico per le cellule e il vetrino.
5. Preparare due soluzioni intermedie:uno con quantum-dots-streptavidina e un altro con Fab biotinilato, ciascuno a 20 nm.
6. Mescolare un volume uguale di queste due soluzioni: mescolare i quantum-dots con Fab in rapporto 1:1 per ottenere una concentrazione finale di lavoro di nM Fab 10: quantum-dots complessa. Utilizzo di un rapporto equimolare favorisce la formazione di complessi mono-funzionalizzati composti da uno quantum dot-e un frammento Fab biotinilato. Ciò favorisce l'etichettatura monovalente, limitando le osservazioni artefatto dovuto al recettore cross-linking ^33,34.
7. Incubare per 15 minuti a 25 ° C, usando un agitatore a 1200 giri al minuto per prevenire l'aggregazione. La miscela è quindi pronto per l'uso in cellule viventi.
8. Incubare le cellule in 100 pl di miscela per 5 minuti a 37 ° C con il 7% CO _2.
9. Lavare le cellule con non-autofluorescente mezzo di imaging (tampone HBSS, 1% HEPES, vedere tabella di reagenti specifici) preriscaldata a 37 ° C.
10. Rimuovere con cura l'eccesso di etichette per impedire l'necessario rovinare il SNR da non legato, fuori fuoco quantum-dots, ampiamente da lavare ogni pozzetto con una media di imaging, di solito 5 volte a temperatura ambiente, con almeno 5 minuti di ritardo prima che l'ultimo lavaggio.

3. Setup Optical

Il video-microscopia installazione si compone di quattro parti principali:

1. Un microscopio invertito con un cubo specifico fluorescenza (FF01-457/50 eccitazione, FF495-DI02 dicroico e FF01-617/73 filtri di emissione, Semrock) e un'apertura numerico ad elevata (1.3 o 1.49) ad immersione in olio obiettivo 100x.
2. Una lampada a mercurio da 100 W (accoppiato al microscopio attraverso una fibra ottica, evitando interferenze con termoregolazione).
3. Una sensibilità di 512 x 512 pixel di altezza EMCCD fotocamera per ottenere una sufficiente SNR.
4. Un incubatore di mantenere i campioni biologici a 37 ° C durante l'esperimento.

4. Acquisizione

1. Selezionare le celle isolate e ben diffusa. Questofavorisce l'estensione di Nizza, lamellipodia piatto, più adatto a cercare il movimento planare di molecole di membrana.
2. Valutare lo stato fisiologico cellulare, per il suo aspetto, sia in luce trasmessa e in fluorescenza: traffico vescicolare intenso, l'assenza di segni necrotiche o apoptotiche, autofluorescenza bassa e medio-forte quantum-dot etichettatura (di solito fino a 1.000 quantum-dots per cella, vedere Fig. 1B, C).
3. Selezionare un alta densità di etichettatura, che è critica per monitorare simultaneamente i recettori quante più possibile. Questo è effettivamente limitato sia dalla fisiologica (espressione di superficie, accessibilità epitopo, movimento laterale) e parametri algoritmici (senza sovrapposizioni point-spread funzioni (PSF), anche tenendo conto sfocatura dovuta al movimento, per consentire una corretta rilevazione e riconnessione).
4. Per ogni cella, prima acquisire un'immagine campo campo chiaro (preferibilmente utilizzando DIC, se disponibile) che consentono di verificare ulteriormente l'aspetto delle cellulee limiti spaziali della lamellipodia.
5. Salva questa immagine utilizzando lo stesso nome come il video-stack (come ad esempio cell1.tif & cell1.stk per esempio), in una sotto-cartella denominata DIC, dal momento che, con queste convenzioni, l'algoritmo può automaticamente ritrovare l'immagine corrispondente per ogni pila.
6. Acquisire video da 1 a 3 per cella, in continuo, tipicamente a 36 ms rate, il più rapido tasso ottenibile in full frame con questa fotocamera. Tuttavia si può acquisire a frequenze più elevate, fino a 1-ms frequenza, utilizzando CCD dedicato con sensibilità e / o meno pixel. Il frame-trasferimento di tecnologia fornisce ritardo trascurabile tra i fotogrammi.
7. Valorizzazione moltiplicano Electron dovrebbe sempre essere impostato al massimo (appena al di sotto di saturazione, se del caso) per consentire di raggiungere sensibilità unica molecola, con una sufficiente SNR, almeno superiore a 20 dB (per un efficace rilevamento di picco ^1), tipicamente intorno 25-30 dB.
8. Tipicamente acquisire 300 fotogrammi al video, il peccatotraiettorie ce sono ricostruiti oltre ~ 100 frames in media, per lo più limitate da lunghi eventi lampeggianti. Video frequenza e la lunghezza può essere adattata per una data misura, che potrebbe richiedere più tracce per esempio.

5. Analisi MTT

1. Selezionare il percorso della directory contenente i file video per valutare un dataset dato con Matlab o Octave.
2. Per avviare l'analisi completamente automatizzato ^1,35, digitare il comando detect_reconnex23 in Octave, o MTT23i in Matlab. Questo programma sta per "versione 2.3, con interfaccia utente" ed è disponibile per il download, insieme con la precedente versione 2.2. Si prima visualizza una interfaccia grafica che elenca tutti i parametri utilizzati, come mostrato in fig. 2.

6. Risultati rappresentativi

MTT analizza automaticamente ogni video recorder, per fornire le tracce degli obiettivi individuati e stimati, integrati da ulteriorevestigations, come il rilevamento confinamento. Questo permette in ultima analisi, tracce di mappatura sulle immagini delle cellule (Fig. 1C e 3).

Descrizione MTT

L'analisi MTT nucleo viene eseguita su ogni frame, invocando 3 compiti principali (Fig. 3):

1. Rilevazione della presenza o assenza di un bersaglio (quantum dot-), scorrevole entro una sub-regione successivamente centrata attorno ad ogni pixel, dove sono confrontati due ipotesi: presenza sia di un segnale, con la PSF modellizzato come una bi-dimensionale gaussiana picco , o solo il rumore, con una soglia di allarme basso assicurando abbastanza falso, con meno di un riconoscimento spurio per fotogramma. Questo porta ad una mappa di probabilità di rivelazione. Ogni massimo locale viene considerato come un bersaglio putativo, assicurando che il suo livello di probabilità è superiore ad un valore minimo, impostato in base alla probabilità di falso allarme desiderata (PFA). Tale limite è fissato abbastanza basso di discriminare in modo efficiente SIGNalles dal rumore, evitando nel migliore dei rilevamenti spurie (PFA di 10 ^-6 per impostazione predefinita, per assicurare meno di un errore in 512 x 512 pixel le immagini), pur consentendo una probabilità sufficientemente elevata di rilevazione, raggiungendo il predetto teoricamente ^uno ottimale. Si noti che l'esigenza di utilizzare un sub-regione implica che i bordi dell'immagine (3 pixel, per una finestra predefinita di 7 x 7 pixel) non può essere valutato.
2. Stima, per ciascun bersaglio rilevato, dei parametri rilevanti, come sub-pixel posizione e l'intensità di segnale. Per ogni obiettivo individuato, uno dei minimi quadrati di Gauss-Newton fit è accanto eseguita per stimare la posizione, la larghezza e l'altezza del rilevato gaussiana. Questo fornisce in particolare la sub-pixel posizione del colorante (10 a 20 nm precisione per valori tipici SNR e coloranti immobili o lentamente diffusore, aumentando fino a circa 100 nm per coloranti diffondenti a 0,1 um ² / s).
3. Riconnessione dei nuovi obiettivi con latracce già costruito nei fotogrammi precedenti. L'insieme di nuovi bersagli è abbinato con la serie di tracce precedenti. Per questo scopo, al fine di assegnare ciascun bersaglio a una traccia, se possibile, tutte le informazioni disponibili statistiche ottenuto dalla fase di rilevamento viene utilizzato, non solo la posizione, ma anche l'intensità, larghezza, lampeggiante e statistiche associate. Di conseguenza, gli obiettivi non sono solo assegnate al più vicino traccia: in caso di tracce che attraversano, intensità, velocità, larghezza e lampeggianti saranno prese in considerazione. Questo fornisce il punteggio riconnessione statisticamente ottimale. Questa strategia evita, quando possibile, di polarizzazione la riconnessione verso i vicini più prossimi.

Picchi rilevati a posteriori può essere respinta se la loro stima o la riconnessione non riesce. Un test speciale gestisce l'individuazione di nuovi picchi, che avrebbe avviato nuove tracce. Questo test utilizza un più spinto PFA (10 ^-7), poiché riconnessione un picco di una traccia può essere interpretato come un de facto o convalida f la sua rilevanza (questo criterio essendo per definizione non si applica per i nuovi picchi).

Traiettoria Analisi

Possibile confinamento transitoria è prossima valutato da una funzione inversamente proporzionale alla diffusione locale ^24-29. L'applicazione di una soglia permette di definire confinato o meno episodi. Iterando questi su tutte le tracce, si può mappare membrana dinamica, in termini di confinamento transitoria / rallentare eventi. Questo può essere alternativamente rappresentato utilizzando il binario o valori discreti di questo indice confinamento.

Per impostazione predefinita, esegue automaticamente MTT tali compiti, risparmiando 8 parametri di picco in un file di testo: numero di telaio, i e j posizione, intensità del segnale, il raggio, offset e lampeggia, per ogni fotogramma video (gruppo di 7 righe) e trace (colonna) . Questi parametri di output possono essere ricaricati in Matlab o Octave usando lo script fread_data_spt per ulteriori analisi delle tracce cioè o intensità di segnale, come esemplificato nella "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> script MTT_example in appendice.

Ulteriori analisi portare a mappare le tracce su ciascuna cella (Fig. 1C e 3) e di fornire l'istogramma della distribuzione dei parametri rilevanti (come intensità di punta, SNR o valori di diffusione locali). Per ogni file, media e deviazione standard di ogni parametro vengono salvate in un file di testo, insieme con l'immagine degli istogrammi. Distribuzioni logaritmiche, come per spostamenti quadrati r ^2, portare a media geometrica. Il coefficiente di diffusione D è calcolato da un fit lineare nel corso dei primi cinque punti della curva MSD. Questi valori forniscono una panoramica di un esperimento che coinvolge per esempio cinetica di reazioni cellulari o trattamenti farmaceutici / enzimatica che riguardano l'organizzazione della membrana. Dal momento che MTT è un codice open-source, questo aspetto può essere facilmente adattato a qualsiasi indagine dedicata.

599fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/>
Figura 1. Monitoraggio recettori di membrana dinamica di MTT. (A) componenti di membrana, quali il EGFR, sono contrassegnati con i punti quantici accoppiati a frammenti Fab biotinilati (disegno schematico con scala approssimativamente corretta di ogni molecola). (B) Tipica immagine fluorescente acquisito da un live cellule COS-7, con 36 ms tempo di esposizione, raffiguranti diffrazione limitata picchi corrispondenti al recettore singolarmente etichettati. (C) Output dell'analisi MTT mostra le traiettorie ricostituiti dei recettori ricoperti sull'immagine brightfield della cella.

Figura 2. Parametri di ingresso MTT. Esecuzione MTT23i apre una interfaccia utente grafica che elenca tutti i parametri di input, i nomi ei valori di default, come descritto nella nostra precedente pubblicazione ^1. Nei parametri dell'algoritmo, spazio e tempo (Windows Search, raggio di picco, la massima diffusione e lampeggiante) sono adimensionali in unità standard, pixel e cornici. Calibrazioni può essere applicato a posteriori per convertire i risultati di uscita. I valori di default, corrispondente ad un 512BFT Cascade con ingrandimento 100x, sono pixel size: 156 nm / pxl e il ritardo dei fotogrammi: 36 ms / frame.

Gli investigatori dovrebbero ottimizzare alcuni parametri critici, come il massimo coefficiente di diffusione previsto ("Diff max") e massima scomparsa lampeggiante ("T _off"). Questi due limiti di spazio e tempo sono quasi gli unici che devono essere riesaminate in una data condizione sperimentale, gli altri vengono impostati su valori predefiniti robusti. Ad esempio, il numero di falsi allarmi è direttamente impostato per assicurare meno di un errore per milione di pixel, quindi, meno di uno per fotogramma, che è soddisfacente in molti casi. Tutti i parametri vengono salvati in un file di testo nella cartella di output, consentendo agli utenti di verificare a posteriori che le impostazioni sono state utilizzate per l'analisi.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/>
Figura 3. Grandi passi dell'analisi MTT. Partire da una pila sperimentale di immagini di fluorescenza, picchi vengono sequenzialmente e rilevate automaticamente, stimato mediante un accoppiamento gaussiana e ricollegato più fotogrammi (prima gamma di operazioni, parte superiore del diagramma). Tracce può essere ulteriormente analizzati per confinamento putativo, per esempio, portando in definitiva a una mappa dinamica di descrittori pertinenti (seconda gamma di operazioni, parte inferiore).

Figura 4. Valenza etichettatura non ha alcun impatto MTT. Per valutare la possibile distorsione introdotta da artefatti etichettatura polivalente, l'analisi MTT è stata effettuata per tenere traccia EGFR endogena codificate usando 2 diversi regimi, per generare e analizzare mappe di traiettorie. (A) recettori sono stati etichettati con biotinilato Fab e quantum-dots605-streptavidina, come descritto nel protocollo.In questo caso, il multi-valenza dei quantum-streptavidins punti e può provocare accoppiamento diversi recettori di un singolo colorante. (B) recettori sono stati etichettati con Fab direttamente accoppiato ad un colorante organico, Atto647N. In questo caso, un Fab, un recettore di conseguenza, possono essere accoppiati a più di un colorante. (C) Media quadrato spostamento (MSD) curva è stata calcolata per tutte le tracce per ogni cella, marcato sia con quantum-dot o coloranti ATTO (grafici a destra ea sinistra, rispettivamente). Coefficienti di diffusione sono stati calcolati dal fit lineare nel corso dei cinque primi punti della MSD (linea rossa tratteggiata). Ogni schema di etichettatura ha portato alla diffusione dei valori simili (grafico centrale). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 celle), Atto: Atto647N (n = 7 cellule), NS: non significativo (Student t-test valore di p> 0,05).

In una singola particella di monitoraggio, oltre agli aspetti cellulari e microscopia, l'analisi rappresenta una parte sostanziale del lavoro. Questo risolve l'algoritmo utilizzato per eseguire le tre compiti principali: rilevazione, stima e ricollegando i picchi su ogni frame. Ma l'aspetto conseguente di questo lavoro risiede nell'elaborazione lo stesso algoritmo, che potrebbe essere necessario essere adattato per qualsiasi nuova inchiesta dedicata, essenzialmente per gli ultimi, i passaggi aggiuntivi (come ad esempio decifrare modalità di movimento, interazioni o stechiometria).

Tuttavia, una volta che l'algoritmo è completamente sviluppato, l'esecuzione è semplice, soprattutto perché abbiamo prestato attenzione a mantenere il numero di parametri di input al minimo (Fig. 3). Questo rende MTT molto robusta e facile da implementare. Nell'elaborare MTT, si è cercato di riconsiderare completamente le opzioni di analisi utilizzati per ogni attività. Abbiamo voluto ottimizzare il processo lungo due assi impegnativi:

1. Trattare with densità elevate di etichettatura fornisce dettagliate informazioni spaziali in termini di prelievo delle cellule di superficie. Idealmente, si tentasse di seguire una popolazione quasi completo molecolare simultaneamente, al fine di ottenere una osservazione globale. Tuttavia, tale etichettatura esaustiva porterebbe ad un'immagine simile a quella classicamente ottenuta mediante immunofluorescenza, senza singola molecola risoluzione, poiché tutte le etichette fortemente sovrappongono a causa di diffrazione. Per il numero tipico molecolare (cioè ~ 10 ⁵ recettori di cella ³⁰⁾ e le dimensioni delle cellule (vale a dire circa 30 micron), se si assume una distribuzione omogenea, la media inter-molecola di una distanza di circa 100 nm. Diffusion durante l'acquisizione contribuisce anche a diffondere la PSF ad una simile misura: tipicamente ~ 100 nm per il moto browniano a 0,1 micron ² / s durante 30 ms. Degno di nota, questa diffusione è isotropo, in media, e quindi genera ancora una gaussiana-like PSF. Quindi fino al 10% della popolazione può essere teoricamente rilevare, poiché ciò lead ad una distanza media di ~ 300 nm, compatibili con i limiti di diffrazione e di movimento. Tuttavia, questo deve essere modulata tenendo conto di disomogeneità nella distribuzione spaziale, etichettatura limitazioni (ad esempio vincoli sterici, accessibilità epitopo, ecc), in aumento e anche i conflitti irrisolvibili a causa di traiettorie che attraversano e l'efficienza di rilevamento generale. Sperimentalmente, potremmo raggiungere e monitorare con precisione una frazione consistente della popolazione complessiva, con densità di ~ 1000 etichette in un campo di vista della larghezza di 80 micron. Ciò risulta limite superiore da un compromesso tra l'esigenza di rilevamenti individuali e l'obiettivo di una misurazione esaustiva spaziale (vedi fig. 1C apprezzare il campionamento spaziale della superficie cellulare).
2. Gestire il più debole possibile SNR permette l'imaging sia a bassa illuminazione, che è benefico per la vitalità delle cellule, e / o ad alta velocità, che fornisce una migliore informazione temporale. Tuttavia, ciò implica inferiori segnaliper immagine, a causa della minore numero di fotoni raccolti. Si noti che il più breve tempo ottenibile da telecamere EMCCD (1 ms) sembra corrispondere a più basso SNR accettabile (20 dB) per l'eliminazione e stima di MTT.

Etichettare valenza è un tema ricorrente negli studi di singola molecola. Infatti, misura diretta del colorante / bersaglio rapporto è molto difficile ^34. Tuttavia, un modo alternativo per indagare il bias putativo introdotta da artefatti etichettatura multivalente consiste nel confrontare le misure sia con quantum-dot tags (con obiettivi diversi per putativamente colorante, inducendo reticolazione artefatti) o organici tag colorante (con, al contrario, coloranti vari putativamente per bersaglio, polarizzazione intensità solo segnale e candeggio caratteristiche). Noi e gli altri ^6,36,37 hanno osservato un comportamento analogo quando si usano quantum-dots o coloranti organici atto647N nel nostro caso, fig. 4), in termini di diffusione e di transizione tra il modes di movimento. Variazione nei valori di diffusione tra le due condizioni è inferiore alla cellula-cellula disparità (Fig. 4C). Ciò dimostra che valenza etichettatura, anche se non strettamente monovalente, non influenzano significativamente i risultati SPT.

Confinamento e le interazioni molecolari

Parto transitoria o stabile può essere interpretata come la firma di affinità preferenziale o interazione ^24-29. Biomembrane sono infatti fortemente disomogeneo, con assemblee locali dettate da caratteristiche strutturali quali idrofobicità, dimensioni transmembrana e la tensione interfacciale. Queste forze motrici portare a rimodellamento spazio-temporale dei gruppi funzionali con ruoli critici per la segnalazione vale a dire, l'adesione o il traffico. Mappatura e quantificazione di tali eventi dovrebbe fornire una chiave per decifrare come una cellula integra stimoli continuamente presentati. In effetti, per una cella, esibendo un adeguato adattamento attraverso una risposta precisa requires messa a punto delle interazioni tra i partner di segnalazione e il loro ambiente. Recettori di membrana possono interagire sia con i recinti del sub-membrana del citoscheletro, strutture a membrana come buche endocitiche o aderenze focali, o anche partner proteici / lipidico, coinvolte nella segnalazione domini per esempio. Nella nostra rappresentazione, tali eventi possono essere studiati attraverso la forza del parto e le sue variazioni nel tempo e nello spazio. Questo rafforza ulteriormente l'importanza di lavorare al più alto ottenibile risoluzione spazio-temporale, tenendo presente i vincoli associati a tempi brevi e ad alta densità, come discusso in precedenza.

Tecniche complementari

Si tratta di una buona pratica per confrontare tali misure dinamiche con altri approcci. Per esempio altre tecniche di microscopia dinamica, come FRAP e FCS, la sensibilità e la risoluzione complementare ^4,38,39. FRAP fornisce una misurazione insieme di diffusione molecolare, mentre FCS s può raggiungereingle-molecola sensibilità, con una risoluzione temporale molto buona. Tuttavia, entrambi i metodi sono intrinsecamente limitato a una misura locale (tipicamente all'interno di un punto confocale). Questo ci ha motivato a prendere vantaggio e spingere i limiti le possibilità spaziali della SPT: indagando su un ampio campo di vista, fino a comprendere una cella tutta in una volta, insieme con una precisione a livello locale rilevante spazio-temporale.

Ulteriori sviluppi e Investigazioni

Secondo la gamma di questioni biologiche che possono essere trattati con una singola molecola misurazioni, MTT può essere esteso lungo varie direzioni, ad ogni livello: il rilevamento, la stima, la riconnessione e ulteriori analisi. Ad esempio, si può considerare che fare con più di una popolazione molecolare, chiamando per il rilevamento multicolor - come può essere eseguita utilizzando schemi ottici dedicati o analitico. Stima possono includere nuovi descrittori rilevanti, come ogni altra informazione spettrale o polarizzazione, o assializ posizione, per estendere l'analisi in 3D ^40.

Per riconnessione, le ipotesi browniani e lampeggiante può essere completamente riconsiderata per un problema specifico. È interessante notare che una singola molecola misure sono state estese negli ultimi dieci anni al cosiddetto regime nanoscopica ^17,22,23. Sebbene MTT affronta direttamente singola molecola di localizzazione, è di importanza cruciale per considerare il caso di un campione fisso, che fornisce una soluzione sicura per una localizzazione esaustiva di una popolazione molecolare. Tuttavia, in tal caso, il presupposto browniano non è più valida. La sua sostituzione con una misura accurata gestione nanoscopica, limitato solo dalla SNR, è fondamentale per raggiungere la migliore risoluzione nanometrica.

Lungo tali sviluppi, sulla base sia, multicolor 3D e / o misure esaustive, il lavoro futuro si prevede di fornire una visione completa del molecolari dati statici e dinamici. Ciò avrà un diretto relevANCE per studi di biologia cellulare, come decifrare le modalità sottili che regolano la segnalazione extra e intracellulare.

Scaricare MTT

Il codice sorgente di MTT è disponibile come software open-source per la ricerca accademica. Può essere scaricato dalla nostra pagina web, a ciml.univ-mrs.fr , navigando alla pagina del nostro team, ha Marguet & Lab, che fornisce un collegamento per la descrizione del software e download. Si prega di notare che vi chiediamo il vostro nome e istituzione solo per informazioni, per esempio in caso di ulteriore collaborazione o per informarvi su una nuova versione o un aggiornamento.