Kartläggning molekylär diffusion i plasmamembranet med Multiple-Target Tracing (MTT)

I den här filmen presenterar vi en fullständig enda experiment partikel spårning med hjälp av Quantum-punkter riktade till en specifik membranreceptor. Det främsta syftet med detta experiment består i diskriminerande olika typer av molekylär diffusion beteenden mäts i plasmamembranet av levande celler. I själva verket kan molekylära rörelser som uppstår på membranet avviker normalt från Brownsk diffusion genom att linjärt riktade eller begränsade inom nanodomains ^26-29, till exempel. Vi strävar efter att samtidigt efter så många receptorer som är tekniskt möjligt att ge en ögonblicksbild av sorten som uppkommer i dynamiken som uppstår i membranet i en levande cell. Detta är den yttersta förväntas möjliggöra dekryptering av de mekanismer som reglerar cell-signalering ytreceptor.

1. Cellodling

1. Förbered cellprov: Använd fastsittande COS-7 celler som endogent uttrycker epidermal tillväxtfaktor (EGFR) ^30. Närarbetar med levande celler utan antibiotika se till att ha någon latent sub-detekterbara förorening genom användning av lämpliga sterila tekniker vid alla tidpunkter under beredningen.
2. Odla cellerna i komplett medium (DMEM med 10% kalvserum, 1% glutamin, 1% HEPES och 1% natriumpyruvat, se tabell av specifika reagens nedan), vid 37 ° C med _7% CO2, varvid man ha dem i subkonfluent, exponentiell tillväxt innan de sprider dem i Lab-Tek.
3. På dagen före experimentet, sprids 5000 celler / brunn i 8-brunn kamrarna (Lab-Tek) och inkubera över natten. Räkna celler ger en konstant celldensitet därmed en reproducerbar förhållande kvant-punkter per cell.

2. Cellmärkning

Framställ kvant-punkter med en specifik beläggning. Quantum-prickar är fluorescerande nanopartiklar bestående av halvledare. Dessa nanopartiklar är av stort intresse eftersom de är mycket ljusa och fotostabil jämfört med klassiskafluorescerande prober ^31,32, vilket gör uppnå en lämplig signal-till-brus-förhållande (SNR) för enda molekyl avbildning.

1. Före experimentet producera Fab-fragment mot EGFR från hybridomcellinjen (mAb 108, ATCC HB-9764), genom klyvning med papain som tidigare beskrivits ^21.
2. Konjugat Fab med biotin, enligt tillverkarens anvisningar (EZ-link sulfo-NHS-LC-biotinyleringskit, Thermo Scientific, figur 1A.).
3. Använd quantum-prickar funktionaliserats med streptavidin (Invitrogen) och avger vid 605 nm (optimal emissionsvåglängd för briljans, detektion och separation från cellulär autofluorescens).
4. Framställa märkningslösningen i komplett medium (se tabell av specifika reagens), för att mätta de streptavidins som finns omkring de kvant-punkter, såväl som att förhindra aggregering och icke-specifik bindning till cellerna och att täckglaset.
5. Framställa två mellanliggande lösningar:en med kvant-punkter-streptavidin och ett annat med biotinylerad Fab, vardera vid 20 nM.
6. Blanda en lika stor volym av dessa två lösningar: blanda kvant-punkter med Fab i förhållandet 1:1 för erhållande av en slutlig arbetskoncentration av 10 nM Fab: kvant-punkter komplex. Användning av en ekvimolär förhållande gynnar bildningen av mono-funktionaliserade komplex bestående av en kvant-punkt och ett biotinylerat Fab-fragment. Detta gynnar monovalent märkning, vilket begränsar artefaktens observationer på grund av receptor tvärbindning ^33,34.
7. Inkubera i 15 minuter vid 25 ° C, med användning av en skakapparat vid 1200 varv per minut för att förhindra aggregation. Blandningen är sedan färdig att använda på levande celler.
8. Inkubera cellerna i 100 | il av blandningen under 5 minuter vid 37 ° C med _7% CO2.
9. Tvätta cellerna med icke-autofluorescerande bildgivande medium (HBSS-buffert, 1% HEPES, se tabell av specifika reagens) förvärmts vid 37 ° C.
10. Ta försiktigt bort överskottet av etiketter för att förhindra unnödvändigt att förstöra SNR genom att obundna, ofokuserad quantum-punkter, med omfattande tvättning av varje brunn med bildalstringsmediumet, vanligen 5 gånger vid rumstemperatur, med minst 5 minuters fördröjning innan den sista tvättningen.

3. Optiska inställningar

Video-mikroskopi inställning består av fyra huvuddelar:

1. Ett inverterat mikroskop med en specifik fluorescens kub (FF01-457/50 excitering, FF495-Di02 dikroisk och FF01-617/73 emissionsfilter, Semrock) och en hög numerisk apertur (1,3 eller 1,49) oljeimmersionsobjektiv 100x mål.
2. En 100 W kvicksilverlampa (kopplad till mikroskopet genom en optisk fiber, undvika att störa värmereglering).
3. En 512 X 512 pixlar stor känslighet EMCCD kamera för att uppnå en tillräcklig SNR.
4. En inkubator för att hålla biologiska prover vid 37 ° C under försöket.

4. Förvärv

1. Välj isolerade och väl spridda celler. Dettagynnar utvidgning av fina, platta lamellipodia, bäst anpassad för att leta efter plana rörelse membran molekyler.
2. Utvärdera den cellulära fysiologiska status genom sitt utseende både i ljus och i fluorescens: intensiv SVD trafik, avsaknad av nekrotisk eller apoptotiska tecken, låg autofluorescens, och genomsnittlig stark quantum-dot märkning (vanligtvis upp till 1.000 kvant-dots per cell, se Fig. 1B. C).
3. Välj en hög märkning densitet, som är avgörande för att samtidigt övervaka så många receptorer som möjligt. Detta är faktiskt begränsad både fysiologiska (yta uttryck, epitop tillgänglighet, rörelse i sidled) och algoritmiska parametrar (icke-överlappande point-spread-funktioner (PSF), även med hänsyn tagen oskärpa på grund av rörelse, för att möjliggöra korrekt upptäckt och återanslutning).
4. För varje cell, först förvärvar en brightfield fält bild (företrädesvis med DIC, om sådan finns) som ytterligare kan tillåta kontroll av cellen aspektenoch rumsliga gränser lamellipodia.
5. Spara bilden med samma namn som video-stacken (som cell1.tif & cell1.stk till exempel), i en sub-mapp som heter DIC, eftersom dessa konventioner, kan algoritmen hitta automatiskt tillbaka det matchande bilden för varje stapel.
6. Skaffa 1 till 3 videor per cell, kontinuerligt, vanligtvis på 36-ms takt, den snabbaste hastigheten uppnås i full frame med denna kamera. Men man kan få vid högre frekvenser, upp till 1-ms takt, med hjälp av speciell CCD med ökad känslighet och / eller mindre pixlar. Ramen-överföring teknik ger försumbar fördröjning mellan ramar.
7. Electron multiplicera förstärkning bör alltid vara maximum (strax under mättnad, om det är relevant) för att nå enda molekyl känslighet med tillräcklig SNR, åtminstone över 20 dB (för effektiv toppdetektering ^1), vanligtvis ca 25-30 dB.
8. Vanligtvis förvärvar 300 bilder per video, syndce banor rekonstrueras under ~ 100 ramar i genomsnitt, främst begränsas av långa blinkande händelser. Video frekvens och längd kan anpassas för en viss åtgärd, vilket kan kräva längre spår till exempel.

5. MTT analys

1. Markera sökvägen till den katalog som innehåller de videofiler för att utvärdera en viss datamängd med Matlab eller Octave.
2. För att starta helt automatisera analysen ^1,35, skriv kommandot detect_reconnex23 i Octave eller MTT23i i Matlab. Detta program står för "version 2,3, med användargränssnitt" och är tillgänglig för nedladdning, tillsammans med den tidigare versionen 2,2. Den visar först en grafiskt gränssnitt som listar alla de använda parametrarna, såsom visas i fig.. 2.

6. Representativa resultat

MTT analyserar automatiskt varje inspelare video, för att leverera spår av upptäckta och uppskattade mål, kompletterade med ytterligarevestigations, såsom inneslutning detektering. Detta tillåter slutligen kartläggning spår över cellbilder (Fig. 1c och 3).

MTT Beskrivning

Kärnan MTT Analysen utförs över varje bildruta, åberopar 3 huvuduppgifter (Fig. 3):

1. Detektering av närvaro eller frånvaro av ett mål (quantum-dot), inom ett glidande sub-region successivt centrerat runt varje pixel, där två hypoteser jämförs: närvaron antingen av en signal, med PSF Modell för en tvådimensionell normalfördelning topp , eller bara brus, med en tröskel att försäkra tillräckligt lågt falskt alarm, med mindre än en falsk detektion per ram. Detta leder till en karta över detekteringssannolikhet. Varje lokalt maximum betraktas som en förmodad mål, vilket säkerställer att dess sannolikhet är högre än ett minimivärde, som enligt den önskade Sannolikhet för falskt larm (PFA). Denna gräns är satt tillräckligt lågt för att effektivt diskriminera SIGnaler från buller, undvika på bästa felaktiga identifieringar (PFA för 10 ^-6 som standard, för att försäkra mindre än en fel 512 x 512 pixel bilder), och samtidigt tillåta en tillräckligt hög sannolikhet för upptäckt, att nå den teoretiskt förväntade optimala ^1. Observera att kravet att använda en sub-region innebär att bilden gränserna (3 pixlar, för en standard fönster 7 x 7 pixlar) inte kan utvärderas.
2. Uppskattning, för varje detekterad mål av relevanta parametrar, såsom sub-pixel position och signalstyrka. För varje upptäckt målet är en minsta-kvadrat Gauss-Newton fit bredvid utförs för att uppskatta läget, bredd och höjd av den detekterade Gaussian. Detta ger särskilt sub-pixel position färgen (10 till 20 nm noggrannhet för typiska SNR värden och orörliga eller långsamt sprida färgämnen, ökar upp till ca 100 nm för färgämnen sprida på 0.1 m ² / s).
3. Återkoppling av de nya målen medspår byggs redan över de tidigare ramarna. Uppsättningen av nya mål matchas med uppsättningen av tidigare spår. För detta ändamål, i syfte att tilldela varje mål till ett spår, om möjligt, all tillgänglig statistisk information från detektionssteget används inte bara läget, utan även intensitet, bredd, blinkande och tillhörande statistik. Därför är målen inte bara hänföras till det närmaste spår: i händelse av korsande spår, intensitet, hastighet, bredd och blinkande kommer att beaktas. Detta ger den statistiskt optimala återkopplingen poäng. Denna strategi undviker, om möjligt, förspänner återanslutning mot närmaste grannar.

Upptäckta toppar kan i efterhand avslås om deras uppskattning eller återinkoppling misslyckas. En särskild prov hanterar upptäckt av nya toppar, vilket skulle initiera nya spår. Detta test används en strängare PFA (10 ^-7), eftersom återansluta en topp till en spår kan tolkas de facto som en validering o f dess relevans (Detta kriterium är per definition inte är tillämplig för nya toppar).

Bana Analys

Möjlig transient inneslutning är nästa utvärderas av en funktion omvänt relaterad till lokal diffusion ^24-29. Tillämpa en tröskel gör det möjligt att definiera begränsad eller inte episoder. Genom iteration dessa över alla spår, kan vi kartlägga membran dynamik i form av övergående inneslutning / långsammare händelser. Detta kan alternativt representeras med användning av antingen den binära eller diskreta värden i denna inneslutning indexet.

Som standard utför MTT automatiskt dessa uppgifter sparar 8 topp parametrar i en textfil: ramnummer, i och j position, signalintensitet, radie, offset och blinkar för varje video ram (grupp 7 rader) och spår (kolumn) . Dessa utgångar parametrar kan laddas i Matlab eller Octave använder fread_data_spt script för vidare analys, dvs spår eller intensiteten signal, som exemplifieras i "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example skript i bilaga.

Ytterligare analyser leder till att kartlägga spår över varje cell (Fig. 1C och 3) och att ge histogram distribution för relevanta parametrar (t.ex. Toppintensiteterna, SNR eller lokala värden diffusion). För varje fil, betyder och standardavvikelse för varje parameter sparas i en textfil, tillsammans med en bild av histogram. Logaritmiska fördelningar, såsom för fyrkantiga förskjutningar r ^2, leder till geometriska medelvärdet. Diffusionskoefficienten D beräknas från en linjär anpassning under de fem första punkterna i MSD kurvan. Dessa värden ger en översikt över ett experiment med t ex kinetik cellulära reaktioner eller läkemedel / enzymatisk behandling som påverkar membranet organisation. Eftersom MTT är en öppen källkod, kan denna aspekt lätt anpassas till någon särskild utredning.

599fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Övervakning membranreceptorer dynamik av MTT. (A) membrankomponenter, såsom EGFR, märks med kvant-punkter kopplade till biotinylerade Fab-fragment (schema med approximativt korrekt skalning av varje molekyl). (B) typiska fluorescerande bild förvärvats från en levande COS-7-cell, med 36-ms exponeringstid, som skildrar diffraktionsbegränsad toppar som motsvarar individuellt märkt receptor. (C) Effekt av MTT-analys visar de rekonstituerade banor av receptorer, som lagts över ljusfält bilden av cellen.

Figur 2. MTT indataparametrar. Köra MTT23i öppnar ett grafiskt användargränssnitt som visar alla inparametrar, namn och standardvärden som beskrivs i vår tidigare offentliggörande ^1. I algoritm utrymme och tid parametrarna (sök fönster, topp radie, max diffusion och blinkande) är i dimensionslösa vanliga enheter, pixlar och ramar. Kalibreringar kan appliceras i efterhand för att konvertera output resultat. Standardvärden, motsvarande en Cascade 512BFT med 100x förstoring, är pixelstorlek: 156 nm / pxl och ram fördröjning: 36 ms / ram.

Utredarna bör optimera några kritiska parametrar, såsom den maximala förväntade diffusionskoefficient ("Diff max") och maximal blinkande försvinnande ("T _off"). Dessa två utrymme och tidsfrister är nästan de enda som behöver omprövas för en given experimentell tillstånd, medan de andra satt till robusta standardvärden. Till exempel är antalet falsklarm direkt in för att se mindre än ett fel per miljon pixlar, alltså mindre än en per ram, vilket är tillfredsställande i de flesta fall. Alla parametrar sparas i en textfil i produktionen mappen så att användarna kan kontrollera efteråt vilka inställningar som användes för analys.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/>
Figur 3. Viktiga steg i MTT analysen. Från och en experimentell bunt med fluorescens bilder, är topparna sekventiellt och automatiskt, beräknas genom en gaussisk passform och kopplas över ramar (första spektrum av transaktioner, övre delen av flödesschemat). Spår kan vidare analyseras för förmodad förlossning, till exempel, vilket slutligen leder till en dynamisk karta över relevanta beskrivningar vid andra typer av transaktioner, nedre delen).

Figur 4. Märkning valens inte påverkar MTT. Att utvärdera eventuella partiskhet som införs genom artefactual multivalent märkning gjordes MTT analys för att spåra endogen EGFR taggade med 2 olika system för att generera och analysera kartor över banor. (A) Receptorer märktes med biotinylerad Fab och kvant-dots605-streptavidin, såsom beskrivs i protokollet.I detta fall kan multi-valensen av kvant-punkter och streptavidins resultera i koppling flera receptorer för ett enda färgämne. (B) Receptorer märktes med Fab direkt kopplad till ett organiskt färgämne, Atto647N. I detta fall kan en Fab, följaktligen en receptor, kopplas till mer än en färg. (C) mean square förskjutning (MSD) kurva beräknas för alla spår för varje cell, märkt antingen med kvant-prick eller Atto färgämnen (vänster och höger grafer, respektive). Diffusionskoefficienter beräknades genom linjär passning över de fem första punkterna i MSD (röd streckad linje). Varje system för märkning ledde till liknande spridning värden (central diagram). Qdot: kvant-dots605 (n = 5 celler), Atto: Atto647N (n = 7-celler), NS: ej signifikant (Students t-test p-värde> 0,05).

I enkel-partikel spårning, bredvid cellen och mikroskopi aspekter utgör analysen en väsentlig del av arbetet. Detta tar den algoritm som används för att utföra de tre huvuduppgifter: att upptäcka, bedöma och återansluta topparna över varje bildruta. Men därmed del i detta arbete ligger i att utarbeta själva algoritmen, som kan behöva anpassas för en ny särskild utredning, främst för de sista, extra stegen (t.ex. dechiffrera former av rörelse, interaktioner eller stökiometri).

Men när algoritmen är fullt utvecklad, löpning är det enkelt, särskilt som vi uppmärksammade på att hålla antalet inparametrar vid minimal (Fig. 3). Detta gör MTT mycket robust och enkel att genomföra. Vid utarbetandet av MTT, som syftar vi på helt omprövning de analytiska alternativ som används för varje uppgift. Vi ville optimera processen längs två utmanande axlar:

1. Hantering av witH Hög täthet av märkning ger detaljerad geografisk information i tid av cellytan provtagning. Helst skulle man försöka följa en nästan fullständig molekylär befolkningen samtidigt för att få en heltäckande observation. Emellertid skulle en sådan uttömmande märkning leda till en bild som liknar den som klassiskt erhållas genom immunofluorescens, utan en enda molekyl upplösning, eftersom alla etiketter starkt överlappar grund av diffraktion. För typiska molekylära antalet (dvs. ~ 10 ⁵ receptorer cell ³⁰⁾ och cellstorlek (dvs. ca 30 m), om vi antar homogen fördelning, är den genomsnittliga mellan molekylen avståndet ~ 100 nm. Diffusion under förvärvet bidrar också till att sprida polyesterstapelfibrer i jämförbar utsträckning: typiskt ~ 100 nm för Brownsk rörelse på 0.1 m ² / s under 30 ms. Anmärkningsvärt är detta sprider isotrop i genomsnitt och därmed fortfarande genererar en gaussisk-liknande polyesterstapelfibrer. Därför upp till 10% av befolkningen kunde teoretiskt upptäckas, eftersom detta skulle lead till ett genomsnittligt avstånd av ~ 300 nm, som är kompatibla med diffraktion och förflyttningsgränser. Måste dock detta vara moduleras av redovisning inhomogenitet i den geografiska fördelningen, märkning begränsningar (till exempel steriska begränsningar, epitop tillgänglighet, etc.), ökar och även olösliga konflikter till följd av korsande banor och övergripande upptäckt effektivitet. Experimentellt kan vi uppnå och noggrant övervaka en väsentlig fraktion av den totala populationen, med densiteter av cirka 1000 etiketter inom ett synfält på 80 | im breda. Denna övre gräns beror på en kompromiss mellan behovet av enskilda upptäckter och målet en uttömmande rumslig mätning (se figur. 1C att uppskatta rumsliga provtagning av cellytan).
2. Hantering av svagaste möjliga SNR ger bildhantering antingen vid låg belysning, vilket är fördelaktigt för celler bärkraft, och / eller med hög hastighet, vilket ger bättre temporal information. Men innebär detta lägre signalerper bild, på grund av färre antal insamlade fotoner. Observera att den kortaste tiden uppnås genom EMCCD kameror (1 ms) tycks motsvara den lägsta godtagbara SNR (20 dB) för korrekt detektering och beräkning av MTT.

Namnge valens är ett återkommande problem i enstaka molekyl studier. I själva verket är direkt mått på färgämne / målförhållandet utmanande höggradigt ^34. Består dock ett alternativt sätt för att undersöka den förmodade fördomar som införs genom artefactual multivalent märkning jämföra åtgärder med antingen quantum-dot taggar (med förmodat flera mål per färg, förmå artefactual tvärbindning) eller organiska färgämnen taggar (med på motsatsen, förmodat flera färgämnen per mål, förspännande endast signalintensitet och blekning egenskaper). Vi och andra ^6,36,37 har observerat liknande beteende vid användning av antingen kvant-punkter eller organiska färgämnen (atto647N i vårt fall, figur 4). I fråga om diffusion och övergång mellan modes av rörelse. Variationen i diffusions-värden mellan de två förhållandena är lägre än den cell-till-cell skillnad (fig. 4C). Detta visar att märkningen valens, även om inte strikt monovalent, inte signifikant påverkar SPT resultat.

Inneslutning och molekylära interaktioner

Övergående eller stabil förlossning kan tolkas som undertecknandet av framförallt affinitet eller interaktion ^24-29. Biomembranes är verkligen starkt inhomogena med lokala församlingar dikteras av strukturella funktioner som hydrofobicitet, transmembrana storlek och ytspänning. Dessa drivkrafter leder till Spatiotemporal ombyggnad av funktionella enheter med kritiska roller för det vill säga signalering, vidhäftning eller handel. Kartläggning och kvantifiering av sådana händelser förväntas ge en nyckel för att dechiffrera hur en cell integrerar kontinuerligt presenteras stimuli. Faktum är att för en cell, uppvisar en adekvat anpassning genom en noggrann svar requires tuning samspelet mellan signalsystem partners och deras omgivning. Membranreceptorer kan interagera med antingen sub-membranet cytoskelettsystemen staket, strukturer membran som endocytiska gropar eller fokala kontakter, eller även proteinsubstanser / lipid parter, deltar i signalering områden till exempel. I vår representation kan sådana händelser kan undersökas genom inneslutning styrka och dess variationer över tid och rum. Detta stärker ytterligare vikten av att arbeta på högsta uppnåeliga rymd-tidsupplösning, i åtanke de begränsningar som är knutna till korta tiderna och höga tätheter, som diskuterats ovan.

Komplementära metoder

Det är en god idé att jämföra dessa dynamiska mätningar med andra metoder. Till exempel andra dynamiska mikroskopitekniker, som FRAP och FCS, ger kompletterande känslighet och upplösning ^4,38,39. FRAP ger en ensemble mätning av molekylär diffusion, medan FCS kan nå sIngle-molekylen känslighet, med en mycket god tidsupplösning. Men båda metoderna i sig begränsad till en lokal åtgärd (vanligtvis inom ett konfokal plats). Detta motiverade oss att ta fördel och tänja på gränserna de rumsliga möjligheter sömlösa rör: Undersökning ett stort synfält, för att omfatta en hel cell på en gång, tillsammans med en lokalt relevant Spatiotemporal noggrannhet.

Ytterligare Utvecklingen och utredningar

Enligt olika biologiska frågor som kan lösas med en enda molekyl mätningar kan MTT förlängas längs olika riktningar, på varje nivå: upptäckt, uppskattning, återkoppling och ytterligare analyser. Till exempel kan man betrakta hanterar mer än en molekylär befolkningen kräver flerfärgad upptäckt - som kan utföras med dedikerade optiska eller analytisk system. Uppskattning kan innehålla nya relevanta deskriptorer, såsom alla spektral och polarisering upplysningar eller axiellaZ-position, för att utvidga spårning till 3D ^40.

För återinkoppling kan Brownsk och blinkar antaganden vara helt omprövas inför ett specifikt problem. Intressant nog enda molekyl mätningar har förlängts under det senaste decenniet till den så kallade nanoskopiska regimen ^17,22,23. Även om MTT direkt ta itu med en enda molekyl lokalisering, är det av avgörande betydelse att ta upp frågan om en fast prov, vilket ger en säker lösning för ett uttömmande lokalisering av en molekylär befolkning. I ett sådant fall är den Brownska antagandet inte längre giltigt. Ersätta den med exakt hantera en nanoskopiska åtgärd endast begränsas av SNR, är avgörande för att nå bästa nanometrisk upplösning.

Längs en sådan utveckling, baserat på antingen flerfärgad, 3D och / eller uttömmande åtgärder är det framtida arbetet förväntas ge en helhetsbild av molekylära statiska och dynamiska data. Detta kommer att ha en direkt relevANCE för studier cellbiologiska, såsom att dechiffrera subtila former som reglerar extra och intracellulära signalering.

Nedladdning MTT

Källkoden för MTT är tillgänglig som öppen källkod för akademisk forskning. Den kan laddas ner från vår hemsida, på ciml.univ-mrs.fr , genom att gå till vårt team sida, han & Marguet Lab, som skapar en länk för programvara beskrivning och nedladdning. Observera att vi frågar efter ditt namn och institution enbart för information, till exempel i fall av ytterligare samarbete eller för att informera dig om en ny version eller uppdatering.