Levende calciumbilleddannelse af virusinficerede humane tarmorganoidmonolag ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer

Calcium er en bredt bevaret anden budbringer, der spiller en kritisk rolle i reguleringen af cellulær fysiologi¹. På grund af sin stærke ladning, lille størrelse og høje opløselighed under fysiologiske forhold er calcium en ideel manipulator af proteinkonformation. Dette gør calcium til et kraftfuldt middel til at transducere elektrokemiske signaler til enzymatiske, transkriptionelle eller posttranskriptionelle ændringer. De strenge calciumkoncentrationsgradienter over det endoplasmatiske retikulum (ER) og plasmamembraner skaber en høj drivkraft, der muliggør hurtige ændringer i cytosolisk calciumkoncentration. Flere mekanismer, herunder både buffering og aktiv transport, opretholder denne gradient tæt. Selvom det er nødvendigt for normale cellulære funktioner, er denne vedligeholdelse energisk dyr, hvilket gør den særlig modtagelig i stresstilstande ².

Som sådan er dysregulering af calcium i cytosolen et næsten universelt signal om mange slags cellulær stress. Metaboliske forstyrrelser, toksiner, patogener, mekaniske skader og genetiske forstyrrelser kan alle forstyrre calciumsignalering. Uanset stimulus kan vedvarende, ukontrollerede stigninger i cytosolisk calcium på helcelleniveau fremme apoptose og til sidst nekrose ^3,4. Ændringer i cytosoliske calciumniveauer med lavere amplitude eller højere frekvens har imidlertid varierende virkninger². Ligeledes kan resultaterne af calciumfluktuationer variere baseret på det rumlige mikrodomæne, hvor de forekommer⁵. Overvågning af calciumniveauer kan derfor give indsigt i dynamiske signalprocesser, men dette kræver prøveudtagning med relativt høj tidsmæssig og rumlig opløsning.

Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er) er effektive værktøjer til kontinuerlig prøveudtagning i levende cellesystemer⁶. Nogle af de mest anvendte GECI'er er GFP-baserede calcium-responsive fluorescerende proteiner kendt som GCaMPs⁷. Den kanoniske GCaMP er en fusion af tre forskellige proteindomæner: en cirkulært permuteret GFP (cpGFP), calmodulin og M13⁶. Calmodulindomænet gennemgår en konformationsændring ved binding af calcium, hvilket tillader dets interaktion med M13. Calmodulin-M13-interaktionen inducerer en konformationsændring i cpGFP, der øger dens fluorescerende emission ved excitation. Som sådan korrelerer en stigning i calciumkoncentration med en stigning i GCaMP-fluorescensintensitet. Disse sensorer kan være cytosoliske eller målrettet mod specifikke organeller⁸.

I lighed med de fleste væv regulerer calcium en række funktioner i mave-tarmepitelet. Tarmepitelet er integreret for næringsstof- og væskeabsorption, men skal også danne en tæt barriere og immungrænseflade for at undgå patogeninvasion eller giftige fornærmelser. Calciumafhængige veje påvirker næsten alle disse vitale funktioner ^9,10,11. Imidlertid forbliver calciumsignalering i tarmepitelet en underudforsket grænse med lovende potentiale som et terapeutisk mål. Mens overvågning af calciumdynamikken i tarmepitelet in vivo fortsat giver udfordringer, tilbyder humane tarmorganoider (HIO'er) et tilpasningsdygtigt ex vivo-system til eksperimenter¹². HIO'er er 3-dimensionelle (3D) sfæroider afledt af humane tarmstamceller og rekapitulerer efter differentiering meget af den cellulære mangfoldighed af det indfødte tarmepitel¹².

Denne protokol beskriver omfattende metoder til at konstruere HIO'er, der udtrykker GECI'er og derefter forberede konstruerede HIO'er som monolag til levende celle calciumbilleddannelse. Det tilbyder virusinfektion som et eksempel på en patologisk manipulation, der forstyrrer calciumsignalering og giver en analytisk tilgang til kvantificering af disse ændringer.

Alle de humane tarmorganoider (HIO'er), der anvendes i denne protokol, og de repræsentative eksperimenter blev afledt af humant væv opnået og vedligeholdt af Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Alle prøver blev indsamlet i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Review Board ved Baylor College of Medicine.

1. Fremstilling af materialer og reagenser

1. Til organoid vedligeholdelse samles cellekulturbehandlede 24-brøndplader, kældermembranmatrix (BMM), 15 ml koniske rør og 1,5 ml koniske rør.
   1. For at forberede komplette medier uden vækstfaktorer (CMGF-) tilsættes 5 ml 1M HEPES, 5 ml 100x antibiotika-antimykotikum, 5 ml 100x glutamintilskud til 500 ml avanceret DMEM F12.
   2. For at forberede Wnt-, R-spondin- og Noggin-holdige (WRNE) medier, bland lige dele CMGF- og Wnt-konditionerede medier, tilsæt Noggin-konditioneret medium, 10% volumen, R-spondin konditioneret medium, 20% efter volumen, 50 ng / ml human epidermal vækstfaktor, 10 mM nikotinamid, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 500 nM A-83-01, 10 μM SB202190, 1x B27 supplement, 1x N2 supplement, og 1 mM N-acetylcystein.
2. Til lentiviral transduktion fremstilles føtalt bovint serum (FBS), 0,05% trypsin-EDTA i 1x fosfatbufret saltvand (PBS), CMGF- med 10% FBS, steril 1x PBS, polybrene, 10 μM Y-27632, Lentivirus, High Wnt WRNE + 10 μM Y-27632
3. Til generering af organoide monolag skal du forberede glasbund 10-brønds cellekulturglas, FBS, Kollagen IV (1 mg / ml i deioniseret (di) H₂O), kældermembranmatrix, 0,5 mM EDTA i 1x PBS, 5 mM EDTA i 1x PBS, enzymatisk dissociationsbuffer, CMGF- med 10% FBS, WRNE + 10 μM Y-27632.
4. Til viral infektion af organoide monolag skal du forberede trypsin, rotavirusbestand, CMGF-, 25G nål, steril 1x PBS og phenol rødfri differentieringsmedier.
   1. For at forberede phenol rødfri differentieringsmedier skal du tage 500 ml phenol rødfri cellekulturmedier, tilsæt 5 ml 100x MEM ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml 100x L-glutamin, 5 ml 100 nM natriumpyruvat og 7,5 ml 1M HEPES.
5. Til immunofluorescensfarvning af organoider fremstilles 4% formaldehyd (16% formaldehyd fortyndet i 1x PBS), Triton X-100 (0,1% Triton X-100 i 1x PBS), Bovin serumalbumin (3% bovint serumalbumin i 1x PBS),_NH4Cl-opløsning (50 mM), DAPI (1 μg/ml DAPI-opløsning i 1x PBS).

2. Engineering organoider til at udtrykke genetisk kodede calciumsensorer

BEMÆRK: Denne protokol beskriver trinene til transducering af en enkelt brønd af 3-dimensionelle humane tarmorganoider belagt i 30 μL kældermembranmatrix (BMM) på en 24-brøndplade¹³. De fleste linjer vil indeholde omkring 400.000 celler pr. Brønd. En anden, ikke-transduceret brønd bør medtages som kontrol. Opbevar alle reagenser og cellesuspensioner på is.

1. Efter 2-5 dage fra den sidste passage fjernes vedligeholdelses-WRNE-mediet fra to brønde med HIO'er. Udskift med 300 μL 0,05% trypsin-EDTA pr. brønd, og pipette forsigtigt op og ned 5x for at løsne BMM fra pladen. Anbring i en 37 °C inkubator i 4 min.
2. Tilsæt 500 μL CMGF- + 10% FBS pr. hul. Forbelæg en 1 ml lavbundet pipettespids med FBS ved at pipettere 1 ml FBS op og ned 2x. FBS kan genbruges på flere spidser. Med den forcoatede spids pipetteres HIO'erne op og ned 10x.
3. Overfør indholdet af hvert hul til sit eget forbelagte 1,5 ml mikrocentrifugerør. Skyl hvert hul med yderligere 500 μL CMGF- og tilsæt vasken til det respektive rør.
4. Centrifuger glassene ved 100 x g i en svingende spandcentrifuge i 5 minutter ved 4 °C. Supernatant og eventuel rest-BMM fjernes.
5. Resuspender i 1 ml 1x PBS. Hvert glas opdeles i to mikrocentrifugeglas til i alt 4 reagensglas. Centrifuger glassene ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes.
6. Hvert glas resuspenderes yderligere én gang i 1x PBS, og centrifugeres ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C.
7. Der fremstilles 400 μL transduktionsmedium og kontrolmedium (tabel 1). 2 resuspenderede 2 resuspenderede glas i 200 μl af kontrolmediet og 2 glas i 200 μl af transduktionsmediet.
8. Der inkuberes i en 37 °C cellekulturkuvøse i 24 timer. Resuspendering ved pipettering op og ned med en belagt spids med jævne mellemrum (f.eks. 2 timer efter transduktion (hpt), 12 hpt, 18 hpt) for at fremme ensartet transduktion.
9. Efter 24 timer centrifugeres reagensglas ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes.
10. Resuspender pellet i 500 μL 1x PBS til vask. Der centrifugeres ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes.
11. Brug en iskold 200 μL pipettespids til at resuspendere hver af de 4 pellets i 30 μL BMM. Pipetter forsigtigt op og ned for at sprede jævnt.
12. Plade indholdet af hvert rør i sin egen brønd på en plade med 24 brønde. Der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C for at lade BMM størkne, før der tilsættes 500 μL HighWnt WRNE + 10μM Y-27632.
13. Lad transducerede HIO'er vokse i 1 uge, og genopfrisk mediet (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) hver anden dag. Efter 1 uge kontrolleres ekspressionen af fluorescerende indikator ved mikroskopi. Hvis signalet er stærkt, skal du begynde lægemiddelvalg. Hvis signalet er svagt, gentages transduktionen som beskrevet ovenfor.
14. Når linjen er etableret, kontrolleres fluorescensindikatorens funktion via agonistbehandling. 100nM ADP er en pålidelig agonist til GCaMP-validering. Test 3D-organoider til indledende validering som beskrevet nedenfor.
    1. Efter en passage plades en brønd (eller flere) organoider i BMM på en separat billeddannelsesbundplade. Plade organoiderne ved ca. 1/3 af den normale densitet for at undgå overskydende overlapning ved billeddannelse. Fortsæt ikke med at passere disse HIO'er efter agonistbehandling, da det er vanskeligt at sikre sterilitet.
    2. Tillad 2-3 dage for HIO'erne at komme sig efter passage. Før billeddannelse skal du skifte mediet til phenol rødfri differentieringsmedier.
    3. Brug et fluorescerende mikroskop til at oprette en 3 minutters kørsel med billeder erhvervet hver 5. sek. ved hjælp af 488 nm excitation og et FITC / GFP-filtersæt. Efter 30 s billeddannelse tilsættes 100 nM ADP eller køretøjskontrol. Fortsæt billeddannelsen, indtil signalet vender tilbage til nær baseline, ~2 min. En forbigående, ~ 2 gange stigning i GCaMP-fluorescens med ADP-behandling indikerer vellykket transduktion og biosensorfunktion. For mere præcist skøn over transduktionseffektiviteten, gentagen agonisttest med billeddannelse ved hjælp af monolag genereret via den proces, der er beskrevet i del 3.

3. Forberedelse af HIO-monolag til levende fluorescensbilleddannelse

1. Overtræk alle brønde i et 10-brønds billeddannende bundkammerglas med kollagen IV. For at gøre dette blandes 34 μL 1 mg / ml kollagen IV med 960 μL sterilt deioniseret vand. Der tilsættes 95 μL fortyndet kollagen IV-opløsning til hvert hul og inkuberes ved 37 °C i 0,5-2 timer.
2. Fjern WRNE-vedligeholdelsesmediet fra 4 brønde med 3D HIO'er. HIO'er skal være 5-7 dage fra deres sidste passage.
   BEMÆRK: 1 10-brønds plade kræver typisk ~ 1,25 x 10⁶ celler. Dette kræver typisk 2-4 brønde med 3D HIO'er belagt med 30 μL BMM hver, men vil variere afhængigt af densitet.
3. Der tilsættes 500 μL 1x PBS + 0,5 mM EDTA pr. hul. Med en forbelagt 1 ml spids pipetteres let op og ned for at løsne BMM fra pladen. Overfør suspensionen til et forbelagt 15 ml konisk rør, der kombineres som brønde i det samme rør.
4. Skyl hvert hul med yderligere 500 μL PBS + 0,5 mM EDTA. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten og rest-BMM fjernes.
5. Brug en forbelagt spids til at resuspendere den resterende pellet i 3 ml PBS + 5 mM EDTA (bemærk, at dette er 10x mere EDTA end den første vask).
6. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten og rest-BMM fjernes. Resuspender pellet i 2 ml enzymatisk dissociationsbuffer.
7. Inkuberes i 37 °C perle/vandbad i 5 min. Tilsæt 3 ml CMGF- + 10% FBS og pipette forsigtigt for at blande.
8. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes. Tilsæt 1 ml CMGF-.
9. Pipetter kraftigt op og ned med en forbelagt spids 80x-100x for mekanisk at bryde HIO'er i enkeltceller. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes.
10. Opslæm igen i 1 ml WRNE + 10 μM Y-27632. Få et celletal for 1 ml suspensionen.
11. Fortynd cellesuspensionen med WRNE + 10μM Y-27632 for at opnå en koncentration på 1,25 x 10⁵ celler/100 μL (1,25 x 10⁶ celler/ml).
12. Brug en 200 μL pipette til at fjerne kollagenopløsningen fra pladen, der blev fremstillet i trin 1, da kollagen nu har lagt sig til bunden af brønden. Undgå at røre bunden af brønden med pipettespidsen.
13. Brug en forbelagt 200 μL pipettespids til at tilsætte 100 μL af celleopløsningen fra trin 3.11 (1,25 x 10⁵ celler) pr. hul.
14. Der inkuberes i 24 timer i en cellekulturkuvøse med 37 °C. Efter 24 timer fjernes dyrkningsmediet fra alle huller, og det erstattes med 100 μL differentieringsmedium pr. hul.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt skal cellerne klæbe til pladen. Bemærk, at monolaget sandsynligvis ikke vil være sammenflydende eller fuldt plan.
15. Objektglasset anbringes tilbage i cellekulturkuvøsen med 37 °C. Differentieringsmediet opdateres hver 24. time, indtil monolaget er sammenflydende. Dette kræver normalt 3-5 dage fra plettering. Efter dette punkt er monolagene klar til downstream-applikationer.

4. Viral infektion af HIO monolag

1. Forbered virusinokulumet. Om nødvendigt aktiverer trypsin virusbestanden. Til rotavirus tilsættes 10 μg/ml Worthingtons trypsin til virusstammerne, og der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
   1. Fortynd den aktiverede virusbestand ved hjælp af en af følgende to metoder.
      1. Hvis du sigter mod det maksimale antal inficerede celler, der kun bruger en viral stamme, blandes 50 μL af den aktiverede virale stamme med 50 μL CMGF-.
      2. Hvis du sammenligner flere stammer, skal du forberede podningerne for at opnå ækvivalente infektionsmultipliciteter (MOI'er). Brug følgende formel til at bestemme mængden af viruslager pr. brønd, der er nødvendig for den ønskede MOI. Der tilsættes CMGF- til mængden af viruslager beregnet til at opnå et endeligt volumen på 100 μL pr. brønd.
         
         BEMÆRK: Et enkelt HIO-monolag belagt i en brønd med en diameter på 5,46 mm (96-brøndplade) indeholder ca. 200.000 celler. På grund af den dårlige effektivitet af infektion i monolag foretrækkes en høj MOI (100-1 million virale partikler pr. Celle). Den optimale MOI skal bestemmes empirisk.
   2. Inficer monolagene ved forsigtigt at fjerne mediet fra HIO-monolaget ved hjælp af en 200 ml pipette. Udskift med 100 ml virusinokulum eller mock podning.
      1. Da de fleste rotavirusbestande formeres i MA104-celler, skal du bruge et uinficeret MA104-cellelysat til mock-podningen. Brug et volumen svarende til den mængde viruslager, der anvendes til de inficerede brønde, og tilsæt CMGF- for et endeligt volumen på 100 ml pr. brønd.
      2. For vira, der inficerer celler basolateralt, såsom rotavirus¹⁴, skal du bruge en 25G-nål til at score monolaget. Det er nemmest at lave en enkelt score over monolagets længde, fra bunden til toppen af brønden. Tryk forsigtigt nålen ind i monolaget i en vinkel med skråsiden opad, modsat bevægelsesretningen, og træk den hen over monolagets længde for at skabe et ar (figur 2A).
   3. Der inkuberes i en inkubator på 37 °C i 2 timer. Fjern virussen og mock inokulum. Vask monolag én gang med 1x PBS.
   4. Tilsæt 100 μL phenol rødfri differentieringsmedier. Placer dias i en 37 °C inkubator, indtil den er klar til afbildning. Det optimale billeddannelsesvindue varierer afhængigt af virusinfektionens kinetik. For rotavirus skal du begynde billeddannelse 6-8 timer efter infektion.

5. Ca²⁺ Billeddannelse af inficerede monolag

1. Forvarm stage-top-inkubatoren til 37 °C. Kør befugtet CO₂ ved 0,02 l / min. Placer glide med de inficerede monolag i inkubatorkammeret og forsegl låget.
2. Brug brightfield-belysning (BF) og et 20x-mål til at vælge X- og Y-koordinaterne for synsfelterne inden for det monolag, der skal afbildes. Det er bedst at vælge punkter med det scorede område i betragtning, da de fleste inficerede celler vil være nær bunden.
3. Optimer billeddannelsesparametre og erhverver et billede ved hjælp af 488 nm excitation. For at minimere fototoksicitet skal du indstille lyskilden til 50% effekt med en eksponeringstid på 50 ms. De relevante anskaffelsesparametre kan variere og bør optimeres ved at erhverve flere anskaffelser. Sørg for, at ingen pixels er mættede. Juster eksponeringstid og lyseffekt efter behov for at sikre, at hele det dynamiske område af den fluorescerende calciumsensor kan detekteres.
4. Hvis du bruger andre fluoroforer (f.eks. fluorescerende mærkede vira), skal du gentage optimeringen på disse kanaler. Konfigurer billedsløjfen, og hent et billede på 488 nm ved hver valgt X, Y-koordinat i en løkke på 1 min. Afbild denne løkke kontinuerligt. Når du bruger en fluorescerende mærket virus, skal du erhverve et billede på den relevante kanal hver 10^. sløjfe (dvs. 1 billede / 10 min).
5. Saml billeder i ~ 18 timer. Hvis du bruger vira uden fluorescerende tags, skal du rette monolag og udføre immunofluorescensfarvning for at identificere inficerede celler. Udfør dette, når du har fuldført billedkørslen som beskrevet nedenfor.
   1. Fjern billedmedier og erstat med 100 μL 4% formaldehyd i 1x PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
   2. Fjern fikseringsmidlet og sluk med 100 μL 50mM NH₄Cl i 10 min. Fjern NH₄Cl. Permeabiliser monolagene med 100 μL 0,1% Triton X-100 i 1x PBS i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
   3. Fjern permeabiliseringsbuffer. Blok med 100 μL 3% bovin serumalbumin i 1x PBS i 1 time.
   4. Fjern blokeringsopløsningen. Der tilsættes primære antistoffer fortyndet til den anbefalede/optimerede koncentration i 1x PBS. Der tilsættes 100 μL antistofopløsning pr. hul.
   5. Der inkuberes natten over ved 4 °C med let vuggen. Fjern primære antistoffer. Vask 3x med 1x PBS.
   6. Der tilsættes fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer fortyndet til den anbefalede/optimerede koncentration i 1x PBS. Der tilsættes 100 μL pr. hul. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: FPBase¹⁵ er en fantastisk ressource til at hjælpe med at vælge sekundære, der undgår gennemblødning ved multiplexing. De fleste sekundære er effektive ved en 1:1000 fortynding i 1x PBS.
   7. Fjern sekundære antistoffer. Lav en 1 μg/ml DAPI-opløsning i 1x PBS og tilsæt 100 μL pr. hul. Inkuber i 20 min. Fjern DAPI. Vask 3x med 1x PBS.
   8. Opbevar faste monolag i 100 μL 1x PBS til billeddannelse. Placer diaset tilbage på mikroskopstadiet, genindlæs X- og Y-koordinaterne fra live-billedkørslen, og afbild hvert multipunkt på kanalen, der svarer til det sekundære antistof, der blev brugt til farvning. Henvis til billederne fra livebilledkørslen for at sikre, at de samme punkter optages.

6. Kvantificering af intercellulære calciumbølger

1. Sørg for, at Fiji is Just ImageJ (FIJI) er installeret med følgende plug-ins: Bioformater (skal være forudinstalleret i FIJI, men vil ikke være i ImageJ); Kogebog: Hvis du vil installere, skal du fra FIJI-menuen gå til Hjælp > opdateringer > Administrer opdateringswebsteder. Tjek kogebog. Genstart FIJI.
2. Opdel datafilen fra live billedbehandlingskørslen i flere filer, der adskiller hver X, Y-koordinat. I Nikon NES Elements skal du vælge Filer > Import/eksport > Opdel multipunkter. Vælg en mappe til eksport og et passende præfiks.
3. Åbn FIJI. Indlæs en enkelt fil fra de opdelte multipunkter. Hvis du bruger et billede med flere kanaler, skal du opdele kanalerne. Vælg vinduet med billederne fra 488 nm-kanalen (GCaMP).
4. Kør funktionen DeltaF Up for at bestemme ændringen i hver pixelværdi fra et tidspunkt til det næste. For at gøre dette skal du vælge Kogebog > T-funktioner > Delta F Up.
5. Rul gennem stakken, indtil der findes et billede med en calciumbølge. Når calciumbølgen er synlig, skal du indstille en tærskel ved at klikke på Billede > Juster > tærskel. Juster den nedre grænse for at minimere mængden af signal, der ikke er en del af bølgen, der kommer forbi tærsklen. For 16-bit billeder, der er taget ved hjælp af parametrene beskrevet ovenfor, skal du starte med en lavere tærskel på 600 og justere efter behov.
6. Kør partikelanalysatoren for at segmentere bølger ved at klikke på Analysér > Analysér partikler. Indstil minimumsstørrelsen af bølgen i μm² ved at justere området. Den er indstillet til 0-uendelig ved baseline. For billeder af MA104-celler, der er taget ved hjælp af et 20x-mål, skal du starte med at øge den nedre grænse til 10.000 μm² og justere efter behov.
7. Markér afkrydsningsfelterne for Vis resultater og Ryd resultater. I rullemenuen "Vis" skal du vælge Konturer og derefter klikke på OK. Dette skulle resultere i 2 output: Et vindue, Resultater, viser hver registreret bølge, bølgens areal og dens middelværdi, minimum og maksimale intensitetsværdier (baseret på delta F). Det andet vindue med titlen Tegning af [filnavn] indeholder en ny stak med konturerne af segmenterede bølger. Brug dette til at kontrollere bølgeregistrering. Juster tærskelværdier og størrelsesinterval, hvis det er nødvendigt, og kontroller bølgeopkaldene igen.
8. Til batchbehandling skal du bruge det medfølgende makroscript (supplerende kodningsfil 1). For at udnytte dette skal du følge nedenstående trin.
   1. Opdel flere punkter i enkelte filer som beskrevet i trin 6.2. Åbn FIJI. Vælg Behandl > batch->makro. I feltet "input" skal du give kortet til mappen, der indeholder de opdelte multipunktfiler. Lad boksen "output" være tom.
   2. Indsæt scriptet fra supplerende kodningsfil 1 i feltet. Juster intensitetstærsklen og størrelsestærsklen i scriptet, så de afspejler de optimerede parametre fra trin 6.5 og 6.6.
   3. Klik på Behandl. Afhængigt af antallet af multipunkter og computerens behandlingshastighed kan det tage 30 minutter eller længere at behandle alle billeder. Når de er færdige, skrives dataene i en ny regnearksfil med navnet "Omdøb mig efter skrivning" på skrivebordet. Outputfilen skal for hvert multipunkt indeholde et bølgeantal og bølgemålinger (areal, gennemsnitlig intensitet, minimum og maksimal intensitet og intensitetstæthed).

Figur 1A viser en BMM-kuppel indeholdende 3-dimensionelle humane tarmorganoider, der er blevet transduceret for stabilt at udtrykke GCaMP6'er. Figur 1B viser den samme linje af organoid forgyldt som et monolag ved 24, 48 og 72 timer efter såning. For at validere funktionen af GCaMP6s blev monolaget afbildet ved fluorescensmikroskopi hver 2. s i 4 minutter, og 100 nM ADP blev tilføjet til medierne efter ~ 20 s. ADP fremkalder calciumfrigivelse fra det endoplasmatiske retikulum, hvilket øger cytosolisk calcium. Den fluorescensintensitet, der påvises på 488 nm-kanalen ved hver eksponering, er afbildet i figur 1C. Sporet viser en stabil baseline fluorescensintensitet efterfulgt af en hurtig stigning ved ADP-tilsætning og en gradvis tilbagevenden mod baseline. En køretøjskontrol er inkluderet for at verificere, at responsen er en sand signalhændelse og ikke blot en ændring i fluorescensintensitet, der kan opstå som følge af tilsætning af medier.

Scoring af et HIO-monolag øger effektiviteten af rotavirusinfektion. Mens teknikker til scoring varierer, er det nemmest at få konsekvent infektion ved hjælp af en enkelt score langs monolagets længde, som vist i figur 2A. Ved anvendelse af rekombinante stammer af rotavirus, der udtrykker fluorescerende proteiner, kan infektion verificeres under levende billeddannelse (figur 2B). Ved anvendelse af en stamme, der ikke udtrykker en markør, kan infektion detekteres ved immunofluorescens efter billeddannelse. I betragtning af cellernes bevægelighed i HIO-monolag er det ofte vanskeligt at spore en enkelt inficeret celle over tid. Brug i stedet endepunktsfarvningen som en metode til at verificere infektion og bekræfte, at mangfoldigheden af infektion matches mellem synsfelter (figur 2C).

Intercellulære calciumbølger i HIO'er kan observeres kvalitativt som vist i figur 3A. Bestemmelse af frekvensen af calciumbølger i et givet synsfelt kræver imidlertid kvantitativ analyse. Trinnene til vellykket segmentering, som beskrevet i trin 6 i protokollen ovenfor, er illustreret i figur 3A. Figuren viser det rå billede (figur 3Ai), billedet efter pixelintensiteterne fra den forrige ramme er trukket fra (figur 3Aii), derefter den segmenterede calciumbølge (figur 3Aiii).

Når calciumbølgerne er blevet segmenteret og kvantificeret for hvert synsfelt i løbet af billeddannelseskørslen, er det ofte informativt at sammenligne frekvensen af bølger i monolag udsat for forskellige forhold. Strimmeldiagrammet i figur 3B viser det samlede antal calciumbølger pr. synsfelt i mock- og rotavirusinokulerede monolag. Dette eksempel omfatter to stammer af RV: en stamme af humant rotavirus (Ito HRV) og en rekombinant stamme af simian rotavirus SA11, der udtrykker mRuby (SA11-mRuby). Den mock-inficerede kontrol tages som baseline calciumbølgefrekvens, de ubehandlede rotavirusinficerede monolag tjener som positive kontroller, og de rotavirusinficerede, behandlede monolag er de eksperimentelle betingelser. Mock-inficerede og RV-inficerede monolag behandlet med lægemidler, herunder ADP-receptorhæmmeren, BPTU, kan derefter sammenlignes med begge kontrolbetingelser ved envejs ANOVA. Dataene tyder på, at BPTU effektivt reducerer frekvensen af intercellulære calciumbølger.

Figur 1: Validering af GCaMP6s-ekspression i jejunale humane tarmorganoider. (A) Efter lentivirustransduktion gennemgik de GCaMP-ekspressive HIO'er selektion og flere passager, vist her 7 dage siden den seneste passage. Ved stimulering med 488 nm-laseren er GCaMP6s-ekspression tydelig i de transducerede HIO'er belagt i 15 μL kældermembranmatrix som 3-dimensionelle sfæroider (Ai). 50 ms eksponeringer blev opnået ved 50% lasereffekt ved hjælp af et 20x mål og derefter syet sammen for at visualisere hele kældermembranmatrixkuplen. En lignende proces blev udført under anvendelse af 4 ms brightfield-eksponeringer (Aii). På brightfield-billedet er de mørke HIO'er i midten af kuplen en indikation af, at kulturerne er klar til passage. (B) HIO'er blev enzymatisk fordøjet til en enkeltcellesuspension og derefter genbelagt med en densitet på 150.000 celler pr. Brønd (5 mm i diameter) af en billeddannende bundplade, der var præbelagt med kollagen IV. Ved 72 timer efter såning var monolaget flydende og klar til downstream-applikationer. For at validere GCaMP's funktion blev billeder taget ved hjælp af 488 nm filtersættet med 50 ms eksponeringer ved 50% lasereffekt hver 2. sek. i 4 min. (C) De spor, der vises her, repræsenterer fluorescensintensiteten i hele feltet normaliseret til den første erhvervelse i løbet af billeddannelsen. Omkring 20 s (pil), efter den tiende eksponering, blev 100 nM adenosindiphosphat (ADP) tilsat for at fremkalde en stigning i cytosolisk calcium (rød). Tilføjelsen af et tilsvarende volumen på 1x PBS fremkaldte ikke et meningsfuldt svar (blåt). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Scoring af et HIO-monolag for at lette RV-infektion. (A) Figuren illustrerer en passende teknik til at score et monolag ved hjælp af en 25G-nål. (B) Et HIO-monolag blev inficeret med en rekombinant stamme af RV, der udtrykker mRuby-fluorescerende protein (magenta, pil), hvilket muliggør identifikation af inficerede celler. Alternativt, når der anvendes en naturligt forekommende stamme af RV, kan inficerede celler identificeres ved anvendelse af immunofluorescens. (C) De viste billeder er fra 4 forskellige HIO-monolag efter fiksering, DAPI-farvning (blå) og antistofmærkning af rotavirusantigen (magenta). Begge teknikker illustrerer den foretrukne RV-infektion nær den scorede del af monolaget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Segmentering og kvantificering af RV-inducerede intercellulære calciumbølger. De 488 nm eksponeringer af RV-inficerede HIO'er, der udtrykker GCaMP6'er, blev erhvervet hvert 1. minut i 16 timer ved hjælp af protokollen. (A) Figuren illustrerer processen med intercellulær calciumbølgesegmentering. For det første trækkes pixelværdierne fra den forrige erhvervelse (_t-1) fra hvert råbillede (Ai) for at kvantificere ændringen i fluorescensintensitet (Aii). Der anvendes derefter en tærskel baseret på en eksperimentelt optimeret minimumsforøgelse af intensiteten fra det forrige billede. Billederne filtreres derefter for et minimum sammenhængende signalområde for at vælge intercellulære calciumbølger (Aiii) og udelukke enkeltcellede calciumsignaler. Denne behandling muliggør kvantificering af calciumbølger ved hvert synsfelt. I dette eksperiment blev monolag enten mock-inficeret, inficeret med ITO-stammen af humant rotavirus (HRV) eller inficeret med en rekombinant stamme af simian rotavirus, der koder for mRuby på gensegment 7, nedstrøms for ikke-strukturelt protein 3 (SA11-mRuby). Inficerede monolag blev enten behandlet med ADP-receptorhæmmeren BPTU eller efterladt ubehandlet. Monolag blev derefter afbildet i 8 forskellige positioner, og calciumbølger i hvert synsfelt blev kvantificeret ved hjælp af rørledningen beskrevet i denne protokol. Punkterne på strimmeldiagrammet angiver antallet af calciumbølger detekteret på hver position overlejret på et søjlediagram, der markerer middelværdien og SD. Envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts tests viser, at mens begge stammer af RV øger frekvensen af intercellulære calciumbølger over den for den uinficerede gruppe, forhindrer BPTU-behandling den RV-medierede stigning i calciumbølgefrekvens. **p<0,01, ***p<0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Lentivirustransduktionsmedium. Transduktionsmediet og kontrolmediet fremstilles ved at kombinere reagenserne i de volumener, der er angivet i henholdsvis anden og tredje kolonne. Sigt efter en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10 lentivirustransduktionsenheder pr. Celle. For LV pakket internt kræver dette normalt ~ 25-50 μL koncentreret LV. Titeren for de fleste kommercielt emballerede LV vil blive forsynet med analysecertifikatet.

Supplerende kodningsfil 1: ImageJ makroscript for at muliggøre calciumbølgekvantificering ved batchbehandling. Klik her for at downloade denne fil.

Ændringer i cytosoliske Ca²⁺ niveauer kan være både en årsag og virkning af patologier i epitelet 10,16,17. Stigninger i cytosolisk calcium kan direkte drive sekretion via aktivering af den calciumafhængige chloridkanal TMEM16A^18,19. Aktivering af TMEM16A som reaktion på Ca²⁺ muliggør apikal udstrømning af chlorid og etablerer en osmotisk gradient, der fremmer væskesekretion^20,21. Desuden udløser stigninger i Ca²⁺ i enteroendokrine celler frigivelsen af serotonin, som stimulerer afferente sensoriske neuroner, der kan modulere aktiviteten i det enteriske nervesystem²². Ca²⁺ signaler kan også modulere tætte kryds for at påvirke barrierefunktionen^23,24 og regulere spredning i tarmstamceller²⁵. Således kan dysregulering af Ca²⁺ have brede og vidtrækkende virkninger.

Mange vira manipulerer cytosolisk Ca²⁺ for at skabe et cellulært miljø, der fremmer replikation²⁶. Rotavirus er et glimrende eksempel på dette inden for tarmepitelet²⁷. Rotavirus non-structural protein 4 (NSP4) er en Ca²⁺-ledende kanal, der muliggør udstrømning af Ca²⁺ fra det endoplasmatiske retikulum til cytosolen^28,29. Dette stimulerer autofagi og hjælper samlingen af det ydre kapsid 30,31,32. Rotavirusinfektion inducerer også frigivelsen af ADP, der udløser intercellulære Ca²⁺ bølger, der bidrager til patogenese¹⁷. Andre enteriske vira, herunder både calicivirus og enterovirus, koder for Ca²⁺-ledende viroporiner, der udløser lignende dysregulering af Ca²⁺ i inficerede celler^33,34.

Live-cell Ca²⁺ billeddannelse af humane tarmorganoider tilbyder en alsidig platform til at studere virusinduceret signalering i epitelet. Styrken af de konklusioner, der drages af billeddata, afhænger imidlertid uløseligt af sundhedsvæsenets sundhed og kvalitet, passende billeddannelsesparametre og en sund analytisk tilgang.

Effektiv lentiviral transduktion er ofte det begrænsende trin ved etablering af nye HIO-linjer, men high-titer lentivirus og multiple transduktioner hjælper med at sikre tilstrækkelig transgenekspression. Det er vigtigt, at dette skal afbalanceres med potentialet for betydelig cellulær stress ved transduktion. Dette er oftest midlertidigt og aftager efter udvælgelse og flere passager. Ikke desto mindre er det afgørende, at HIO'er, der er konstrueret til at udtrykke GECI'er, viser normal vækst og spredning, inden eksperimenter påbegyndes. På samme måde inducerer dispergering af 3-dimensionelle HIO'er og reformering af dem som monolag cellulær stress. Det er bedste praksis at tillade tre eller flere dage for monolag at tilpasse sig efter plettering. Overtrækning af pladerne med kollagen IV er afgørende for monolagsintegritet^35,36. Aliquoting af kollagen IV og opbevaring ved -80 °C mellem anvendelser hjælper med at sikre overholdelse af monolag. Bestemmelse af den optimale såtæthed for hver HIO-linje kan også bidrage til at forbedre konsistensen. Endelig er det nødvendigt at inkludere de korrekte kontroller og sammenligne dem på tværs af eksperimenter for at sikre, at enhver observation repræsenterer et svar på den pågældende variabel snarere end en teknisk confounder.

Mens scoring af et monolag kan forårsage uønsket celleskade, forbedrer det i høj grad RV-infektion af 2D HIO'er. Figur 2 illustrerer dette, da næsten alle inficerede celler er direkte ved siden af ridsen. Eksperimentelle beviser tyder på, at RV inficerer mest effektivt på den basolaterale overflade af intestinale epitelceller³⁷. Det forudsiges således, at scoring af et monolag forbedrer infektiviteten ved at udsætte den basolaterale overflade. Effektiv enkeltlagsinfektion kan også opnås ved plettering af HIO'er på polykarbonatmembraner suspenderet i brønde indeholdende dyrkningsmedium, som giver adgang til den basolaterale overflade. Den relativt lange afstand mellem pladen og polykarbonatmembranen, selve polycarbonatmembranen og plastoverfladen ved bunden af brønden gør dem imidlertid uegnede til epifluorescensbilleddannelse. Således forbliver scoringsmetoden beskrevet i denne protokol den foretrukne tilgang. I betragtning af at scoring i sig selv kan føre til signalforstyrrelser, er inkluderingen af den uinficerede, scorede kontrol afgørende for fortolkningen. For vira, såsom humant norovirus, der effektivt inficerer via den apikale membran, er det ikke nødvendigt at score monolaget³⁸.

Som med ethvert levende billedbehandlingssystem kan fototoksicitet let forvirre eksperimenter ved hjælp af HIO-monolag. Gennem et billeddannelseseksperiment er det vigtigt at overvåge for uventet vakuolisering, membrangabning eller andre morfologiske indikatorer for stress³⁹. Hvis nogen af disse tegn detekteres, skal varigheden, hyppigheden eller effekten af excitation reduceres. Forøgelse af signal-støj-forholdet kommer ofte på bekostning af langsigtet cellesundhed, så empirisk optimering af parametre er afgørende. Fotoblegning, som indikeret ved et fald i baseline fluorescensintensiteten over tid, er et varsel om cellestress og bør undgås.

Visualiseringen af billeddata kan få efterforskere til at favorisere kvalitative snarere end kvantitative analyser. Som med enhver modalitet kræver reproducerbare konklusioner imidlertid kvantificering. Kvantitativ billedanalyse indeholder langt mere kompleksitet, end der kan dækkes i et enkelt manuskript, men det er værd at fremhæve et par nøglepunkter. For det første kræver konsekvent kvantificering konsekvent erhvervelse. En analysepipeline, der er udviklet til et givet sæt anskaffelsesparametre, er muligvis ikke effektiv til billeder, der er optaget ved forskellige frekvenser, eksponeringstider, laserkræfter eller bølgelængder. For det andet har mangfoldigheden af infektion en overdimensioneret indflydelse på hyppigheden af viralt inducerede calciumsignaler. Som sådan er det vigtigt at evaluere antallet af inficerede celler pr. synsfelt og sikre konsistens på tværs af behandlingsbetingelser. Alternativt kan normalisering af signalfrekvensen til antallet af inficerede celler pr. synsfelt hjælpe med at reducere fejl. Endelig, mens den nyligt udviklede mNG-baserede calciumindikator (NEMO) tilbyder en lovende tilgang til bestemmelse af absolutte^Ca2+ -koncentrationer i celle⁴⁰, formidler de fleste biosensorer kun relativ information om biologiske systemer. Således er baggrundssubtraktion, normalisering og sammenligning med en kontrol kritisk.

Mens denne protokol fokuserer på calciumbilleddannelse under virusinfektion, er den generelle tilgang let tilpasningsdygtig. Virusinfektion kan let erstattes af en alternativ behandlingstilstand, og der er en stadigt voksende litani af biosensorer til overvågning af mange forskellige cellulære veje og processer. Med enhver protokoltilpasning skal efterforskere holde analysen top-of-mind og designe eksperimenter med klare, kvantificerbare resultater.

Samlet set giver live imaging uovertruffen tidsmæssig opløsning, hvilket forbedrer karakteriseringen af meget dynamiske processer. Inkorporering af organoider i levende billeddannelseseksperimenter muliggør observation af disse processer i en fysiologisk relevant model, der er sandt for væv. Vi håber, at den her beskrevne protokol letter eksperimentelt design og optimering, hvilket giver forskere mulighed for at afdække nye aspekter af celle- og vævssignalering.