Gepseudotypeerde virussen als moleculair hulpmiddel om humorale immuunresponsen tegen SARS-CoV-2 te volgen via neutralisatietest

Pseudogetypeerde virussen (PV's) zijn moleculaire hulpmiddelen die in de microbiologie worden gebruikt om interacties tussen gastheer en virus en pathogeen-pathogeen te bestuderen 1,2,3,4. PV's bestaan uit een binnenste deel, de virale kern die het virale genoom beschermt, en een buitenste deel, de envelopglycoproteïnen op het oppervlak van het virus dat het tropisme definieert⁵. Een pseudovirus is replicatie-incompetent in de doelcel omdat het niet alle genetische informatie bevat om nieuwe virusdeeltjes te genereren. Deze combinatie van bijzondere eigenschappen maakt PV's tot een veilig alternatief voor een wildtype virus. Wildtype virussen daarentegen zijn zeer pathogeen en kunnen niet worden gebruikt in BSL 2-laboratoria voor analyse⁶.

De besmettelijkheid van PV's kan worden gecontroleerd door een reporter-gen, dat meestal codeert voor een fluorescerend eiwit (GFP, RFP, YFP) of een enzym dat chemiluminescente producten produceert (luciferase). Dit zit in een van de plasmiden die worden gebruikt voor PV-productie en is opgenomen in het genoom van het pseudovirus⁷.

Er bestaan momenteel verschillende soorten PV-kernen, waaronder lentivirale deeltjes op basis van het HIV-1-genoom. Het grote voordeel van op HIV-1 gebaseerde PV's ten opzichte van andere platforms is hun intrinsieke integratieproces in het genoom van de doelcel⁸. Hoewel HIV-1 een zeer besmettelijk virus is en de veroorzaker van aids is, zijn deze lentivirale vectoren veilig te gebruiken vanwege de uitgebreide optimalisatiestappen door de jaren heen. Optimale veiligheidsomstandigheden werden bereikt met de introductie van lentivirale vectoren van de 2e generatie, waarin virale genen werden uitgeput zonder de transductiemogelijkheden te beïnvloeden⁹. De^3e en 4e^generatie droegen bij aan de verhoogde veiligheid van de behandeling van lentivirale vectoren met de verdere splitsing van het virale genoom in afzonderlijke plasmiden^10,11. De nieuwste generaties PV's worden over het algemeen gebruikt om lentivirale vectoren voor gentherapie te produceren.

PV's kunnen worden gebruikt om interacties tussen virussen en gastheercellen te bestuderen, zowel tijdens de productie- als de infectiefase. PV's worden vooral gebruikt in pseudovirusneutralisatietests (PVNA). PVNA's worden op grote schaal gevalideerd om het neutralisatiepotentieel van serum of plasma te beoordelen door zich te richten op het virale glycoproteïne op de PV-envelop^12,13. Neutralisatieactiviteit, uitgedrukt als de remmende concentratie 50 (IC50), wordt gedefinieerd als de verdunning van serum/plasma die 50% van de toegang tot virale deeltjes blokkeert¹⁴. In dit protocol beschreven we de opzet van een PVNA om de antilichaamactiviteit tegen Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) te testen in sera die zijn verzameld voor en na ontvangst van een boostervaccindosis.

Dit protocol is goedgekeurd door en volgt de richtlijnen van de Ethische Commissie van de Universiteit van Verona (goedkeuringsprotocol nummer 1538). Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van de proefpersonen die aan het onderzoek deelnamen. Volbloedmonsters werden verzameld van vrijwilligers van gezondheidswerkers (HCW) die bezig waren met het ontvangen van anti-SARS-CoV-2-vaccins. Deze monsters werden verzameld in plastic buisjes met anticoagulantia voor de daaropvolgende isolatie van serum¹⁵.

Alle volgende processen moeten worden uitgevoerd in een biologische kap van klasse 2, die onder steriele omstandigheden werkt. Virushantering moet met zorg worden uitgevoerd en alle afvalproducten moeten worden geneutraliseerd in een verdunde bleekoplossing. Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.

Figuur 1: Grafische weergave van een neutralisatietest. (A) PV-productie, (B) PV-titratie en (C) neutralisatietest. Alle procedures worden uitgevoerd in een klasse 2 biologische kap onder steriele omstandigheden. Titratiestap (B) moet worden uitgevoerd om de infectiviteitsniveaus van PV's te standaardiseren voordat ze worden gebruikt in de neutralisatietest (C). Deze figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. SARS-CoV-2 PV-productie- en besmettelijkheidstest

1. Zaad 5 x 10⁵ HEK293T cellen in volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, hoge glucose, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine) in een plaat met 6 putjes (6WP) om een geschikte celdichtheid te bereiken die compatibel is met het gebruikte transfectiereagens. In het geval van transfectie met polyehtylenimine (PEI) (bereid het reagens volgens de instructies van de fabrikant), zorg er dan voor dat de cellen op de dag van transfectie een dichtheid van 40-60% bereiken (stap 1.3). Bewaar de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO_{2 .}
2. Vervang voorafgaand aan de transfectie het gebruikte celmedium door vers medium zonder antibiotica (DMEM, hoge glucose, 10% FBS, 1% L-glutamine) om een hogere transfectie-efficiëntie te bereiken.
   OPMERKING: De dag na het zaaien zijn HEK293T cellen klaar om te worden getransfecteerd.
3. Transfect hechtende HEK293T cellen met een geschikt transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Als u PEI gebruikt, bereidt u twee mixen voor en volgt u de onderstaande stappen.
   1. Om mengsel A te bereiden, voegt u 500 ng pCMV-dR8.91 verpakkingsplasmide¹⁶, 750 ng pCSFLW-reporterplasmide¹⁶ en 450 ng SARS-CoV-2 Spike toe dat plasmide tot expressie brengt in 100 μL gereduceerd serummedium.
   2. Om mengsel B te bereiden, voegt u 17,5 μL PEI (concentratie: 1 mg/ml) toe aan 100 μl van het gereduceerde serummedium.
   3. Laat beide mengsels 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) incuberen. Meng vervolgens de inhoud van beide buisjes door de PEI-mix B toe te voegen aan DNA-mix A.
   4. Incubeer de buis gedurende 20-30 minuten bij RT. Draai de buis elke 3-4 minuten zachtjes om het mengen te verbeteren. Voeg tot slot het mengsel toe aan de HEK293T cellen.
4. Vervang 16-20 uur na de transfectie het kweekmedium door verse, volledige DMEM. Incubeer bij 37 °C en 5% CO_{2 ,} om de productie van PV's door getransfecteerde cellen mogelijk te maken.
5. Oogst 72 uur na de transfectie het supernatans dat PV's bevat. Centrifugeer vervolgens bij 1600 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur om celresten en dode cellen te verwijderen en filtreer deze door een celluloseacetaatfilter van 0,45 μm.
6. OPTIONELE STAP: Om de uiteindelijke opbrengst van de PV-titer te verhogen, voert u meerdere transfecties uit, bundelt u de celmedia die PV's bevatten en concentreert u deze met behulp van concentrerende buizen.
7. Ga direct verder met de volgende stappen ("PV-titratie", sectie 2) of aliquot het PV-houdende medium in geschikte buizen om tot gebruik bij -80 °C te bewaren. Bereid een extra aliquot (400-500 μl) voor titratie.
   OPMERKING: Het maken van meerdere aliquots garandeert reproduceerbaarheid tussen experimenten door overmatige dooi-vriescycli te vermijden.

2. PV-titratie

1. Gebruik het verse PV-medium voor de volgende stappen of ontdooi het testaliquot (stap 1.7) om de titratie van de nieuwe virale voorraad uit te voeren. Het bevriezen van aliquots van dezelfde PV-voorraad garandeert de reproduceerbaarheid.
2. Voeg 50 μL volledige DMEM (of compleet medium dat compatibel is met de gebruikte doelcellijn) toe aan alle putjes van een plaat met 96 putjes (96WP) die nodig is om de PV-voorraad in tweevoud te testen, waarbij rij "A" leeg blijft. Voeg 100 μL PV-voorraad toe aan rij "A". Laat op basis van het aantal te testen preparaten één kolom zonder het virus als "cel alleen"-controle (figuur 2).
3. Pipetteer 50 μl van rij A naar rij B en herhaal dit proces tot rij G om seriële verdunningen van de oorspronkelijke voorraad te verkrijgen. Gooi het overtollige volume van de laatste rij weg.
4. Maak de cellen los met trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur 1x (EDTA) in Dulbecco's fosfaatbufferzoutoplossing 1x (DPBS 1x), na het verwijderen van het verbruikte medium en het tweemaal wassen van de cellen met DPBS 1x. Bereid de cellen voor op een dichtheid van 4 x 10⁵ cellen/ml.
   OPMERKING: In dit protocol werd PV-infectie getest op de vatbare cellijn HEK293T/ACE2; dergelijke cellen werden afgeleid van HEK293T, getransduceerd met behulp van een lentivirale vector om ACE2-receptor tot expressie te brengen.
5. Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan elk putje om een celgetal van 2 x 10⁴ cellen per putje te garanderen.
6. Incubeer bij 37 °C en 5% CO_{2 gedurende} 48 uur.
7. Voer na de incubatie de Luciferase-test uit om de aflezing te verkrijgen volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 100 μL van het luciferase-reagens toe aan de putjes en incubeer gedurende 2 minuten in het donker bij RT. Verplaats de inhoud van elk putje naar een zwarte plaat met 96 putjes (compatibel met de beschikbare plaatlezer) en lees de platen in een plaatlezer met 96 putjes.
   OPMERKING: De luminometer die wordt gebruikt voor de luciferase-uitlezing produceert een spreadsheetbestand met de ruwe, onbewerkte gegevens die zullen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse (in dit geval een Excel-bestand). De infectiviteit van het virus wordt uitgedrukt in relatieve luminescentie-eenheden (RLU) (beschreven in punt 4.1).

Figuur 2: Representatieve lay-out van een plaat met 96 putjes voor PV-titratie. Een vast volume PV-houdend supernatans wordt toegevoegd aan rij A, kolommen 1-11, en serieel verdund. De laatste kolom blijft over als het besturingselement "alleen cel". Deze figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Neutralisatietest

1. Ontdooi de sera van patiënten op ijs. Inactiveer serummonsters door ze gedurende 30 minuten bij 56 °C te incuberen.
2. Voeg in een plaat met 96 putjes 50 μl van de verse, volledige DMEM (of volledig medium dat compatibel is met de gebruikte doelcellijn) toe in elk van de volgende putjes: van rij B (kolommen 1-10) tot rij H (kolommen 1-10). Doe 95 μl van de verse, volledige DMEM in rij A (kolommen 1-10). Voeg respectievelijk 50 μl en 100 μl volledige DMEM toe aan de putjes van kolom 11 en 12. Dit zijn respectievelijk de geïnfecteerde (viruscontrole of VC) en niet-geïnfecteerde (alleen cel of CC) controles (Figuur 3).
3. Voeg 5 μl warmte-geïnactiveerde serum-/plasmamonsters toe in rij A (kolommen 1-10). Elk monster wordt in tweevoud uitgevoerd. Meng met een meerkanaalspipet de monsters in de eerste rij en verplaats 50 μL medium met serum van rij A naar rij B. Herhaal dit proces tot de laatste rij (Figuur 3). Gooi de resterende 50 μL weg.
4. Ontdooi het benodigde aantal aliquots van PV's en verdun tot ≥ 10⁴ RLU/ml. Voeg 50 μl van het verdunde PV-bevattende medium toe aan elk putje (van kolom 1 tot kolom 11) met behulp van een meerkanaalspipet om een 1:1 verdunning van door warmte geïnactiveerd serum/plasma tot virus te bereiken. Incubeer bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 1 uur om de antilichamen in de serummonsters te laten binden aan het SARS-CoV-2-spike-eiwit op de PV's.
5. Bereid ten minste 5 ml suspensie van gevoelige cellen (HEK293T/ACE2) met een celdichtheid van 4 x 10⁵ cellen/ml. Voeg 50 μl van de celsuspensie toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 48 uur.
6. Voer na de incubatie de luciferase-testaflezing uit volgens de instructies van de fabrikant, zoals beschreven in stap 2.7.
   OPMERKING: De luminometer die wordt gebruikt voor het uitlezen van luciferase produceert een spreadsheetbestand (in dit geval .xlsx) met de ruwe, onbewerkte gegevens die zullen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse (het Luciferase-testbestand).

Figuur 3: Plaatweergave op basis van serumverdunning. Helderrood komt overeen met een grotere hoeveelheid serum en helderblauwe strook (kolom 11) komt overeen met geïnfecteerde celcontrole (VC, viruscontrole). Lichtblauwe baan (kolom 12) komt overeen met niet-geïnfecteerde cellen (CC, celcontrole). Deze figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Titratie-analyse

1. Wijs in het Luciferase-testbestand de namen/titels toe aan de bijbehorende monsters.
2. Vermenigvuldig de RLU-meting met de verdunningsfactoren (van boven naar beneden in het rooster: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x) om RLU/ml te verkrijgen. Als er verschillende verdunningsfactoren worden gebruikt, verander dan de vermenigvuldigingsfactoren dienovereenkomstig.
3. Bereken de gemiddelde RLU/ml voor elk PV-preparaat.

5. Analyse van de neutralisatietest van PV's

1. Wijs in het Luciferase-assay-spreadsheetbestand (in dit geval .xlsx) de bijbehorende titels toe aan de geteste monsters. Voer de verdunningsfactor van het monster in (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x, 5.120x). Bereken de Log10 van de verdunningsfactoren.
2. Bereken de gemiddelde RLU van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde controle (Figuur 3, respectievelijk kolommen 11 en 12). Deze waarden zijn nuttig voor de normalisatie in stap 5.5.
3. Open een nieuw document voor gegevensanalyse. Selecteer X/Y-analyse, voer X in als Getallen en Y als Voer 2 replicatiewaarden in naast elkaar subkolommen in.
4. Voer Log10 (verdunning) waarden in als X getallen. Voer de dubbele RLU van de monsters in.
5. Ga naar Analyseren > Normaliseren > Alle voorbeelden op hetzelfde blad markeren. Voer de gemiddelde VC- en CC-waarden in respectievelijk Hoe wordt 0% gedefinieerd? en Hoe wordt 100% gedefinieerd?. Klik op OK.
6. Ga op het genormaliseerde gegevensblad naar Analyse > XY-analyses > Niet-lineaire analyses (curve fit). Markeer alle voorbeelden en klik op OK. Selecteer voor de dosis-respons - remming log(remmer) versus genormaliseerde respons - variabele helling.
7. Wijzig onder Beperking HillSlope in Moet kleiner zijn dan 0.
8. Markeer onder Uitvoer Overzichtstabel en grafiek maken. Klik op OK om de definitieve analyses te verkrijgen. Een werkblad met een sjabloon voor de analyse is opgenomen in aanvullend dossier 1.

Dit protocol beschrijft de productie van SARS-CoV-2 PV's en een stroomafwaartse toepassing van deze PV's om de neutralisatieactiviteit van serum/plasma te analyseren van proefpersonen die anti-COVID-19-vaccinatie krijgen¹⁷. Bovendien kan dit protocol worden toegepast om pseudotypen van elke zorgwekkende SARS-CoV-2-variant (VOC) te produceren om de evolutie van de neutraliserende respons te testen. Ondanks dat dit protocol de studie van de humorale immuunrespons na COVID-19-vaccinatie vergemakkelijkt, kan het worden aangepast om gemakkelijk de neutralisatie van verschillende sera/plasma tegen verschillende virussen te testen 13,18,19.

Figuur 4A geeft de toename van de verdunning van serum (Log(verdunning)) weer die overeenkomt met de toename van het RLU-signaal. Dus hoe hoger de verdunning van het monster, hoe minder het binnendringen van het virus wordt geblokkeerd (figuur 4A). Dit wordt verder uitgedrukt als een percentage van de neutralisatie (figuur 4B).

Het IC50-resultaat toont de neutralisatiecapaciteit van een enkel vaccinserum in de loop van de tijd. In het voorbeeld dat in figuur 4C wordt gerapporteerd, ontwikkelde de proefpersoon vier weken na vaccinatie een sterke humorale activiteit tegen het virus; na 16 weken is de IC50 echter vergelijkbaar met die voorafgaand aan de toediening van het vaccin. In dit geval vertoonde de PVNA het verlies van neutralisatiepotentieel in de loop van de tijd.

Figuur 4: Representatieve resultaten van PVNA. (A) Infectiviteit (RLU, en (B) neutralisatiepercentage worden weergegeven in week 0 (W0, vóór de vaccinatie); W4 (vier weken na vaccinatie); W16 (zestien weken na W0). (C) IC50-waarden op dezelfde tijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Neutralisatieanalysesjabloon. Een werkblad met een sjabloon voor het uitvoeren van de neutralisatieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Hoewel het gebruik van een wildtype virus de werkelijke infectie simuleert, zijn lentivirale PV's een veiligere optie om de mechanismen te bestuderen die verband houden met het binnendringen en infecteren van virussen zonder de strikte veiligheidseisen die nodig zijn om met pathogene virussen te werken ^4,20,21. PV's zijn samengesteld uit een replicatie-defecte virale kern omgeven door het glycoproteïne van een pathogeen virus, wat het doel van het onderzoek is.

Op HIV-1 gebaseerde PV's zijn een van de meest gebruikte platforms en deze zijn in dit protocol gebruikt voor de productie van SARS-CoV-2 pseudovirale deeltjes. Het reporter-gen kan verschillen afhankelijk van het gebruik van de PV's; in dit geval zorgt de keuze voor het luciferase reporter-gen voor een gemakkelijke, snelle en gevoelige uitlezing van de besmettelijkheid van de geproduceerde PV's.

PV's op basis van lentivirussen worden op grote schaal toegepast om anti-HIV-1 humorale respons te bestuderen²². De PV-technologie werd onmiddellijk toegepast tijdens de recente COVID-19-pandemie, veroorzaakt door SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 is een hoogpathogeen menselijk bètacoronavirus, voor het eerst geïdentificeerd in China (Wu Han), dat snel een pandemie werd en wereldwijd meer dan 6 miljoen doden veroorzaakte^23,24. Door de validatie van vaccinstrategieën is de pandemie grotendeels onder controle; niettemin vormt het bij de meeste kwetsbare mensen, zoals kankerpatiënten of mensen met hiv, nog steeds een risico 25,26,27. In deze context is er nog steeds behoefte aan gevalideerde tests om de humorale respons tegen vaccins te volgen in termen van neutraliserende activiteit. In dit artikel hebben we een eenvoudig protocol beschreven dat gemakkelijk kan worden uitgevoerd in laboratoria zonder toegang tot categorie 3-insluiting. Bovendien is het PV-platform een veelzijdig systeem om verschillende SARS-COV-2-virusvarianten te bestuderen. Door het plasmide dat de envelop tot expressie brengt met verschillende spikes te veranderen, is het inderdaad mogelijk om PV's van nieuwe SARS-CoV-2-varianten of van andere coronavirussen te genereren²⁸. Deze virusportfolio's kunnen worden gebruikt om de reactiviteit van door vaccins geïnduceerde humorale respons tegen de verschillende zorgwekkende varianten te beoordelen 15,29,30,31,32. Deze informatie kan als leidraad dienen voor het genereren van nieuwe en effectievere vaccins.

Bij het volgen van dit protocol kunnen zich drie belangrijke obstakels voordoen met betrekking tot transfectieomstandigheden, titratiefalen en/of neutralisatietest. Ten eerste is het mogelijk dat de verpakkingscellen op het moment van transfectie niet voldoende samenvloeien. Dit kan te wijten zijn aan het gebrek aan voedingsstoffen. Zorg ervoor dat stap 1.1. correct wordt opgevolgd. Voer anders het zaaien uit in de ochtend van de dag vóór de transfectie en transfecteer de verpakkingscellen later de volgende dag om de groeitijd te verlengen. Een terugkerend probleem is de mogelijke besmetting van het celmedium tussen transfectie en mediumvervanging de volgende dag. Herhaal in dit geval de procedure door de sterilisatieprocedure voor gebruik te verlengen wanneer u onder de BSL2-kap werkt of antibiotica toe te voegen om ongewenste besmettingen te voorkomen. Ten tweede kan er een onopgemerkt luciferasesignaal optreden dat kan worden toegeschreven aan verschillende stadia van de productie van PV's of de kenmerken van de doelcellijn. Plasmiden moeten worden geëxtraheerd met endotoxinevrije kits. De transfectiestap is van cruciaal belang voor de uitkomst van het protocol. PEI-reagens moet worden bereid in de juiste concentratie van 1 mg/ml. Zachtjes tikken op de buis tijdens de bereiding van transfectiemengsels verbetert de vorming van DNA-PEI-complexen. Om te controleren of de cellen correct zijn getransfecteerd, wordt aanbevolen om de luciferase-test onmiddellijk na het oogsten van de cellen uit te voeren. Voeg daarnaast een controle-virusenvelopglycoproteïne toe, zoals VSV: VSV-PV's geven sterke RLU-signalen op menselijke cellijnen. Bovendien is het noodzakelijk om te vermelden dat de doelcellijn de receptor tot expressie moet brengen, wat gemakkelijk kan worden geverifieerd via western blot of flowcytometrie.

Deze methode is eerder geoptimaliseerd¹⁶ met betrekking tot de experimentele omstandigheden, waaronder de selectie van het transfectiereagens, de bepaling van de verhoudingen tussen de verschillende plasmiden die nodig zijn voor de generatie van de PV, en de selectie van de doelcellijnen, het gebruik van luciferase als reportergenen. Niettemin zal elk laboratorium de voorgestelde methoden moeten valideren in overeenstemming met de beschikbare apparatuur. Zo vereist (stap 2.7) de toevoeging van 100 μL Luciferase-substraat zoals voorgesteld door de producent: dit is optimaal voor het uitlezen van de luciferase-test met de plaatlezer die momenteel beschikbaar is. Aan de andere kant kunnen andere laboratoria die zijn uitgerust met een andere plaatlezer het protocol aanpassen met behulp van andere luciferasesubstraten of volumes van het reagens³³. Bovendien hebben andere auteurs het gebruik van het groen fluorescerende eiwit (GFP) als reporter-gen voorgesteld in plaats van het luciferase. Dit kan worden overwogen als een laboratorium volledig is uitgerust voor GFP-uitlezing, maar niet voor luciferase^34,35.

Kortom, PV's zijn een flexibel en eenvoudig systeem waarmee de infectie kan worden gekwantificeerd met behulp van een eenvoudige detectiemethode. Het vertegenwoordigt een kosteneffectieve aanpak die toegankelijker is voor veel onderzoeksgroepen en die het mogelijk maakt het gebruik van pathogene virussen te vermijden waarvoor een laboratorium van bioveiligheidsniveau 3 vereist^{is 21}. Het gebruik van PV's vertegenwoordigt een goed gekarakteriseerde en veilige benadering voor het bestuderen van antilichaam-gemedieerde neutralisatie bij personen die een SARS-CoV-2-infectie en/of vaccinatie hebben doorgemaakt.