Værtscelleproteinanalyse ved hjælp af berigelsesperler kombineret med begrænset fordøjelse

Værtscelleproteiner (HCP'er) er urenheder, der frigives fra værtsorganismens cellekultur og renses sammen med monoklonalt antistof (mAb)1,2,3,4. Sporniveauer af HCP'er kan have en negativ indvirkning på kvaliteten af lægemiddelproduktet 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, og derfor ønskes en følsom HCP-analysemetode til påvisning af HCP'er i sub-ppm til ppm niveauer.

Ortogonale metoder kan anvendes til at detektere HCP'er i lav overflod. Enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) anvendes generelt til at kvantificere de samlede HCP'er, og det kan også detektere og kvantificere individuelle HCP'er, hvis de tilsvarende antistoffer er tilgængelige¹⁶. Imidlertid er produktionen af HCP-specifikke antistoffer tidskrævende og arbejdskrævende. I modsætning hertil kan væskekromatografi kombineret med massespektrometri (LC-MS) give omfattende information om individuelle HCP'er i mAb-lægemidler og anvendes bredt til HCP-identifikation 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20^, 21,22,23,24,25,26,27.

Der er udviklet flere metoder til påvisning af HCP'er med LC-MS/MS, herunder begrænset fordøjelse²⁰, filtrering¹⁷, protein A-deletion²¹, immunudfældning (IP) og ProteoMiner-berigelse (PM)¹⁸. De fleste metoder sigter mod at reducere mængden af mAb og berige HCP'er før LC-MS/MS-analyse og derved reducere det dynamiske område mellem mAb-peptider og HCP-peptider. Denne protokol præsenterer en proteomisk prøveberigelsesmetode, der kombinerer ProteoMiner-teknologi og begrænset fordøjelse (PMLD)²⁸. ProteoMiner-berigelsesprincippet indebærer anvendelse af kommercielt tilgængelige proteomberigelsesperler, der indeholder et forskelligartet bibliotek af kombinatoriske peptidligander. Disse ligander binder specifikt til proteiner på antistof-lægemiddelprodukter, hvilket muliggør fjernelse af overskydende molekyler, mens de koncentrerer værtscelleproteiner med lav overflod (HCP'er) på deres respektive affinitetsligander. På den anden side indebærer princippet om begrænset fordøjelse anvendelse af en lav koncentration af trypsin. Denne koncentration er tilstrækkelig til at fordøje sundhedspersonale med lav forekomst, men ikke nok til at fordøje alle antistoflægemidler. Denne fremgangsmåde muliggør genvinding og berigelse af fordøjede HCP-peptider fra opløsningen.

Sammenlignet med filtreringsmetoder er PMLD-teknikken ikke begrænset af størrelsen af de påviste HCP'er¹⁷. Protein A-deletionsmetoder er specifikke til påvisning af HCP'er forbundet med antistoffer²¹, mens immunudfældning er begrænset til foruddefinerede HCP'er fra en bestemt cellelinje (såsom cellelinjen Chinese Hamster Ovary (CHO), hvor der blev genereret et anti-HCP-antistof⁴. I modsætning hertil kan PMLD anvendes til at detektere HCP'er fra ethvert lægemiddelmodul og værtscelleproteiner co-renset med lægemiddelprodukter fra forskellige cellelinjer. Derudover udviser PMLD bedre følsomhed sammenlignet med de nævnte metoder 17,18,20,21,24.

Denne fremgangsmåde kan berige HCP-koncentrationen med 7000 gange og sænke detektionsgrænsen til 0,002 ppm²⁸. Den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 1.

De forkortelser, der anvendes i protokollen, er anført i supplerende tabel 1.

1. Fremstilling af opløsninger og buffere

BEMÆRK: De kommercielle detaljer for alle reagenserne er angivet i materialetabellen.

1. Forbered 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0 opløsning ved at tilsætte 1 ml 1 M Tris-HCI, pH 8,0 i 9 ml deioniseret vand i et hætteglas, og bland godt ved hvirvelstrøm. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
2. Der fremstilles 24 mM natriumdeoxycholat (SDC) ved at opløse 10 mg SDC i 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
3. Forbered 24 mM natriumlauroylsarcosinat (SLS) ved at opløse 7 mg SLS i 1 ml 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0.
4. Forbered elueringsbuffer ved at blande 24 mM SDC og 24 mM SLS i forholdet 1:1 (v/v).
5. Forbered 50 ng / μL trypsinopløsning ved at tilsætte 400 μL deioniseret vand i 20 μg trypsin.
6. Forbered 25 mg/ml dithiothreitol (DTT) ved at tilsætte 308 μL 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, til 7,7 mg DTT.
7. Der fremstilles 0,25 M iodoacetamid (IAM) ved at tilsætte 1,2 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, i 56 mg IAM.
8. Forbered 10% TFA ved at tilsætte 1 ml trifluoreddikesyre (TFA) i 9 ml deioniseret vand. Vortex i 4 s og spin ned. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
9. Forbered buffer A ved at tilsætte 1 ml 10% TFA i 99 ml deioniseret vand.
10. Forbered buffer B ved at tilsætte 1 ml 10% TFA og 49 ml deioniseret vand i 50 ml acetonitril (ACN).
11. Forbered 10 mM histidinbuffer ved at tilsætte 37 mg L-histidin og 54,8 mg L-histidinmonohydrochloridmonohydrat i 50 ml vand.

2. Fremstilling af monoklonale antistofopløsninger (mAb)

1. For lægemidler med koncentrationer over 50 mg/ml fortyndes 15 mg af det monoklonale antistof (mAb) (se materialetabel) med deioniseret vand i et 2 ml mikrocentrifugerør, hvilket resulterer i et samlet volumen på 300 μL og en endelig pH på ~6. Juster om nødvendigt pH ved hjælp af eddikesyre eller Tris-HCI.
2. For lægemidler med koncentrationer under 50 mg/ml udføres bufferbytning efter trin 2.2.1 til 2.2.5.
   1. 20 mg af hver prøve overføres til en 10k centrifugalfilteranordning (se materialetabellen) og centrifugeres ved 14.000 x g i 25 minutter (ved stuetemperatur, RT), indtil der er ca. 100 μL volumen tilbage.
   2. Tilsæt 350 μL 10 mM histidin (se materialetabel), pH 6,0 buffer i filteret, hvirvelstrømmen og centrifuger ved 14.000 x g i 25 minutter ved RT. Gentag én gang.
   3. Vend filteret på hovedet, og anbring det i prøveopsamlingsrøret, og centrifuger derefter prøverne ved 1000 x g i 5 minutter ved RT for at hente hele volumenet i opsamlingsrøret. Filteret vaskes med 200 μL 10 mM histidinbuffer og pipet op og ned for at genvinde eventuelle resterende proteinprøver. Overfør hele opløsningen til det samme opsamlingsrør, hvirvel og drej ned.
   4. Mål prøvekoncentrationen med NanoDrop. Koncentrationen af hver proteinprøve justeres til 50 mg/ml ved at tilsætte histidinbufferen før inkubation med berigelsesperler.
   5. 300 μL af prøven overføres til et 2 ml mikrocentrifugeglas.

3. Fremstilling af proteomberigelsesperler

1. Fjern den øverste og nederste hætte fra hver centrifugeringskolonne fra det kommercielle proteinberigelsessæt (se materialetabel). Kassér ikke hætterne, da de vil blive brugt senere.
2. Tag centrifugeringssøjlen og placer den i et 2 ml mikrocentrifugerør uden hætte. Centrifuger opsætningen ved stuetemperatur og 1.000 x g i 30-60 s ved RT for at eliminere opbevaringsopløsningen. Bortskaf det materiale, der er indsamlet i løbet af dette trin.
3. Tilsæt 200 μL vaskebuffer til de kommercielt tilgængelige berigelsesperler (se materialetabellen) og pipet op og ned flere gange. Centrifugeringskolonnen anbringes i et 2 ml mikrocentrifugeglas og centrifugeres ved 1.000 x g i 30-60 s ved RT for at fjerne bufferen. Kassér indsamlet materiale.
   BEMÆRK: Vaskebufferen er inkluderet i det kommercielle proteinberigelsessæt.
4. Gentag trin 3.3 to gange.
5. Sæt bundhætten på igen, tilsæt 200 μL vand, og sæt derefter tophætten på igen.

4. Berigelse af protein

1. Pipet op og ned ad gyllen (fra trin 3.5) og overfører 40 μL gylle til prøven fremstillet i trin 2. Inkuber og drej røret ved stuetemperatur i 2 timer.
2. Lav en spids med fritte (se Materialetabel) med 16 G nålen for at få den passende fritstørrelse, og sæt den derefter ind i spidsen af 200 μL spidsen.
3. Overfør prøven med perler til spidsen forberedt i trin 4.2. Centrifuger spidsen med 2 ml mikrocentrifugerør ved 200 x g i 3 minutter ved RT for at fjerne opløsningen.
4. Puds perlerne ved at tilsætte 200 μL vaskebuffer til spidsen, og centrifuger spidsen med et 2 ml mikrocentrifugerør ved 200 x g i 2 minutter ved RT for at fjerne vaskeopløsningen. Gentag trinnet to gange.
5. Puds perlerne ved at tilsætte 200 μL vand til spidsen og centrifuger spidsen med et 2 ml mikrocentrifugerør ved 200 x g i 2 minutter ved RT for at fjerne vandet.
6. Elueringsproteiner fra perler ved at tilsætte 10 μL elueringsbuffer (trin 1.4) i spidsen, og pipet gyllen ti gange i spidsen for at sikre, at perlerne er gennemblødt med elueringsbuffer.
7. Centrifuger spidsen med et nyt 0,5 ml mikrocentrifugerør ved 200 x g i 30 s ved RT for at opsamle elueringsmidlet. Gentag trin 4.6-4.7 to gange, og kombiner al eluering i et 0,5 ml mikrocentrifugeglas.
8. Der tilsættes 1,5 μL trypsinopløsning (trin 1.5) til elueringsmiddel til nedbrydning natten over ved 28 °C. Der tilsættes 1,5 μL 25 mg/ml DTT (trin 1.6), og prøven opvarmes til 90 °C i 20 minutter.
9. Der tilsættes 1,5 μL 0,25 M IAM (trin 1,7) og inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 20 min. Der tilsættes 3,5 μL 10% TFA (trin 1,8), hvirvel i 2 minutter, og sørg for, at pH-værdien er ~2-3.
10. Der centrifugeres ved 14.400 × g i 10 minutter ved RT for at udfælde SDC og SLS. Supernatanten opsamles til afsaltning.
11. Udfør afsaltning ved at følge nedenstående trin.
    1. Der tilsættes 50 μL buffer B (trin 1.10) til GC-afsaltningsspidsen (se materialetabellen). Centrifuger spidsen med en holder ved 1000 x g i 3 minutter ved RT. Kassér det indsamlede materiale.
    2. Tilsæt 50 μL buffer A (trin 1.9) til spidsen. Centrifuger spidsen med en holder ved 1000 x g i 3 minutter ved RT. Kassér det indsamlede materiale.
    3. Tilsæt den syrnede prøve til spidsen. Centrifuger spidsen med en holder ved 500 x g i 6 minutter ved RT. Kassér det indsamlede materiale.
    4. Spidsen vaskes ved at tilsætte 50 μL buffer A til spidsen. Centrifuger spidsen med holderen ved 500 x g i 3 minutter ved RT. Kassér det indsamlede materiale. Gentag én gang.
    5. Eluer peptidet fra spidsen ved at tilsætte 50 μL buffer B til GC-afsaltningsspidsen. Centrifuger spidsen med et nyt rør ved 500 x g i 3 minutter ved RT. Opsaml materialet. Gentag trinnet én gang, og kombiner elueringsmidlet.
    6. Elueringsmidlet tørres med en vakuumkoncentrator (se materialetabel).
12. Det tørrede elueringsmiddel resuspenderes i 30 μl 0,1% myresyre (FA)-opløsning.
13. UV af peptidblandinger måles ved 214 nm med et spektrofotometer (se materialetabel). Koncentrationen af peptidblandinger bør ligge mellem 0,1 og 0,5 mg/ml.
14. 10 μL af hver fordøjet prøve overføres til et hætteglas med LC-prøve, og derefter injiceres 1 μg af hver fordøjet prøve på nano LC-MS/MS (se materialetabellen). Udfør analysen ved at følge trin 5. Opbevar resten af de afgassede prøver i en fryser til -80 °C.

5. Nano LC-MS/MS-analyse

1. Injicer peptidblandingen i et nano-LC-system koblet til et massespektrometer. Peptidblandingerne (~1 μg) anbringes på en C18-fældekolonne med den gradient, der er angivet i tabel 1A til afsaltning, og derefter på en C18-analysekolonne ved 40 °C til separation.
   BEMÆRK: Den mobile fase A-buffer bestod af 0,1% FA i ultrarent vand, og den mobile fase B bestod af 0,1% FA i 80% ACN.
2. Peptiderne adskilles og elueres med gradienten i tabel 1B med en strømningshastighed på 250 nL/min.
   BEMÆRK: Massespektrometeret blev betjent i dataafhængig tilstand (DDA) med en cyklustid på 3 s. Ioner gennemgik fragmentering gennem kollisionsdissociation med højere energi (HCD) med en normaliseret kollisionsenergi på 30% for hver fuld MS-scanning. Scanningerne blev udført med en opløsning på 60.000 med et AGC-mål (automatisk forstærkningskontrol) på 3e6, en maksimal injektionstid på 20 ms og et m/z-område på 380-1600. MS/MS-hændelser blev udført med en opløsning på 15.000 med et AGC-mål på 1e5, en maksimal injektionstid på 60 ms og et m/z-interval på 200-2000. Udelukkelsens varighed blev sat til 45 s. Ionkildeegenskaberne er angivet i tabel 1C, og de specifikke massespektrometriparametre findes i tabel 2A-F.

6. Analyse af data

1. Udfør en søgning i NISTmAb-råfilerne til massespektrometri mod UniProt mus+musculus-databasen²⁹. Derudover skal du søge efter de rekombinante proteinspikede mAb DS-massespektrometri-råfiler mod UniProt Cricetulus Griseus-databasen³⁰.
   BEMÆRK: Disse søgninger blev udført i Proteome Discoverer-software (se materialetabel) ved hjælp af søgemaskinerne Sequest HT og Mascot. De anvendte databaser var fri for overflødige poster.
2. Til massespektrometrisøgninger skal du anvende en massetolerance på 10 ppm og indstille fragmentmassetolerancen til 0,02 Da.
   BEMÆRK: Søgekriterierne omfattede statisk carbamidomethylering af cysteinrester (+57,0214 Da) og variabel modifikation af oxidation (+15,9949 Da) på methioninrester. Derudover blev der anvendt en variabel modifikation af deaminering (+0,984 Da).
3. Udfør databasesøgningen ved hjælp af trypsinfordøjelsen, hvilket giver mulighed for maksimalt to ubesvarede spaltninger. Indstil false-discovery-raterne for både proteiner og peptider til 0,01.
   BEMÆRK: For positivt at identificere værtscelleproteiner (HCP'er) blev der anvendt et minimumskrav på mindst to unikke peptider. Tabel 3 giver en repræsentativ oversigt over identificerede HCP'er forbundet med NIST mAb analyseret af Proteome Discoverer-software.

Denne protokol præsenterede en prøveforberedelsesarbejdsgang, kaldet proteinberigelse kombineret med begrænset fordøjelse (PMLD), til analyse af værtscelleproteiner (HCP'er) i en monoklonal antistofprøve (mAb). Figur 1 illustrerer den trinvise procedure for PMLD. Forskerne sammenlignede resultaterne af HCP-analyse ved hjælp af direkte fordøjelse (vist i øverste panel i figur 2) og PMLD (vist i nederste panel i figur 2). Total Ion Chromatogram (TIC) profilerne indikerede, at PMLD signifikant reducerede eller eliminerede større mAb-peptider, samtidig med at det tillod observation af nogle HCP-peptider, der kan sammenlignes med mAb-peptider. Der gives detaljerede parametre for nano LC (tabel 1) og MS/MS (tabel 2) analyser. Derudover viser tabel 3 en oversigt over identificerede HCP'er forbundet med NIST mAb, herunder oplysninger såsom tiltrædelsesnummer, HCP-navn, art, dækningsprocent, PSM'er, unikke peptider, molekylvægt, forventet isoelektrisk punkt (pI), maskotscore, Sequest HT-score og antallet af peptider identificeret af Mascot og Sequest HT.

Figur 1: Arbejdsgange for prøveforberedelse af proteinberigelse kombineret med begrænset fordøjelse (PMLD). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Total ionkromatogramprofil (TIC) til HCP-analyse af NIST mAb. Toppanel: TIC-profil til HCP-analyse af NIST mAb ved direkte fordøjelse. Nederste panel: TIC-profil til HCP-analyse af NIST mAb ved hjælp af PMLD. Det fremgår af TIC-profilen, at sammenlignet med direkte fordøjelse er de fleste af de vigtigste mAb-peptider blevet reduceret eller elimineret efter PMLD, mens nogle peptider, der tilhører HCP'er, kan observeres og kan sammenlignes med mAb-peptider. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Parametre for nano LC. (A) Hældning af læssepumpe. B) NC-pumpens gradient. (C) Ionkildeegenskaber. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Parametre for MS/MS. (A) Fuldstændige scanningsegenskaber. B) MIPS-egenskaber. (C) Intensitetsegenskaber. (D) Egenskaber for opladningstilstand. (E) Dynamisk udelukkelse. (F) Dataafhængige MS2-scanningsegenskaber. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Repræsentativ oversigtstabel over identificerede HCP'er forbundet med NIST mAb analyseret af Proteome Discoverer-software. Tabellen indeholder oplysninger såsom tiltrædelsesnummer, HCP-navn, art, procentdel af dækning, antal peptidspektrummatches (PSM'er), antal unikke peptider, molekylvægt, forventet isoelektrisk punkt (pI), maskotscore, Sequest HT-score og antallet af peptider identificeret af Mascot og Sequest HT. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 1: Liste over anvendte forkortelser. Klik her for at downloade denne tabel.

Der er to versioner af kommercielt tilgængelige proteinberigelsesperler: den ene med en mindre kapacitet og den anden med en større kapacitet (se materialetabellen). Begge versioner af berigelsesperlerne indeholder ti preps i pakken. Producentens instruktioner tyder på, at hver prep fra det lille kapacitetssæt kan bruges til at berige 10 mg total protein. For optimal ydeevne af værtscelleprotein (HCP) berigelse fra DS er hver prep imidlertid god til fem DS-prøver. Derfor kan hvert kit bruges til at berige HCP'er fra halvtreds prøver. For hver forberedelse fra det store kapacitetssæt er det godt for berigelse af sundhedspersonale fra femogtyve DS-prøver, hvilket muliggør påvisning af sundhedspersonale fra i alt to hundrede og halvtreds prøver.

Trin 3.1 fraråder at kassere top- eller bundhætterne, da de vil blive genbrugt i hele protokollen. Hvis perler sætter sig i tophætten, skal du udskifte dem efter fjernelse af bundproppen og centrifugering, mens du holder tophætten på søjlen. For at bruge bundhætten som et stik skal du vende den om og placere den sikkert i bunden af centrifugeringssøjlen.

Et kritisk trin i proceduren er trin 4.1, hvor perleopslæmningen sætter sig i bunden af røret. Derfor er det afgørende at opretholde kontinuerlig pipettering op og ned, mens gyllen overføres til prøverne af monoklonale antistoffer (mAb). Et andet kritisk trin er trin 4.6, hvor det er vigtigt at pipette gyllen ti gange inden for spidsen, mens perlerne er mættet med elueringsbuffer. Centrifugeringsvarigheden i trin 4.3-4.5, 4.7 og 4.10 kan variere afhængigt af mængden af akkumulerede værtscelleproteiner (HCP'er). Derfor er det afgørende at kontrollere og sikre, at væskerne i spidsen er blevet spundet ordentligt ned, inden du fortsætter til næste trin. Igen, når man starter med en indledende mængde på 15 mg antistof-lægemiddelprodukt, kan ca. 30 μg antistof og berigede værtscelleproteiner (HCP'er) elueres. For at opnå et protein-til-enzym-forhold på 400: 1 for begrænset fordøjelse blev 75 ng trypsin tilsat. Når der anvendes en lavere mængde inputmateriale, er det nødvendigt at måle koncentrationen af den eluerede proteinprøve. Denne måling hjælper med at justere mængden af trypsin, der skal tilsættes i overensstemmelse hermed. Trin 4.9 viser et hvidt bundfald efter tilsætning af 10% TFA. For at forhindre, at overfladeaktive stoffer interfererer med MS-signalet, er det afgørende at kontrollere pH-værdien efter tilsætning af trifluoreddikesyre (TFA) for at sikre, at vaske- og rengøringsmidlet fjernes fuldstændigt fra supernatanten.

Efter tørring og resuspension af elueringsmidlet i vand er det nødvendigt at udføre en UV-måling af peptidblandingen. Denne måling er afgørende, fordi mængden af peptider, der lægges på søjlen, kan påvirke detektionen ved hjælp af MS. Efter evaluering blev det konstateret, at ca. 1 μg af peptidblandingen udviste den bedste ydeevne i MS. Derfor skal denne optimale mængde injiceres i nano LC-MS / MS til yderligere analyse.

PMLD-tilgangen giver flere fordele ved prøveforberedelse, herunder tilstrækkelig monoklonal antistof (mAb) DS-reduktion, samtidig med at størstedelen af værtscelleproteiner med lav overflod (HCP'er) bevares. I modsætning til immunudfældning (IP) er denne teknik ikke afhængig af anti-HCP-antistoffer, hvilket eliminerer bias forbundet med foruddefinerede antistoffer og reducerer arbejdskraft og tid, der kræves til fremstilling af anti-HCP-antistoffer. I modsætning til filtreringsmetoder baseret på molekylvægt cut-off¹⁷ beriger PMLD desuden sundhedspersonale uanset deres størrelse. Det kan anvendes til at berige HCP'er fra forskellige lægemiddelmoduler, såsom antistoffer, fusionsproteiner, ScFv og mere, hvilket gør det til en alsidig tilgang sammenlignet med protein A-deletionsmetoder²¹.

Ud over disse fordele udviser PMLD en lavere detektionsgrænse og muliggør påvisning af et større antal HCP'er fra NISTmAb, en bredt karakteriseret referencestandard, sammenlignet med andre metoder. Det er dog værd at bemærke, at PMLD kræver hjemmelavet udstyr, hvilket begrænser dets anvendelse til automatisering. For at udvide dets anvendelighed er det muligt at udskifte visse udstyr, såsom spidsen med frit, med kommercielt tilgængelige alternativer. Derudover kan udførelse af afsaltning på plader med 96 brønde muliggøre højere gennemstrømning ved hjælp af denne tilgang. Udforskning af automatisering eller semiautomatisering i fremtidige eksperimenter kan være et logisk næste skridt til at udvide den bredere anvendelse af PMLD.