Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2^R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

Die katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als Episoden einer polymorphen ventrikulären Tachykardie (PVT) nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholaminbelastung, die sich zu einem potenziell tödlichen Kammerflimmern verschlechtern kann 1,2,3,4 . Neuere Hinweise nach dem ersten Bericht als klinisches Syndrom im Jahr 1995 implizierten Mutationen in sieben Genen, die alle an der Freisetzung von Ca 2+ durch sarkoplasmatische retikuläre (SR) Speichern beteiligt sind: die am häufigsten berichteten RYR2-kodierenden Ryanodinrezeptor 2 (RyR2) der Ca²⁺-Freisetzungskanäle^5,6, FKBP12.6⁷, CASQ2, die für kardiales Calsequestrin⁸ kodieren^, TRDN kodiert für das junktionale SR-Protein Triadin 9 und CALM1 ⁹, CALM2 10 und CALM3, die identisch für Calmodulin^11,12 kodieren. Diese genotypischen Muster führen die arrhythmischen Ereignisse auf die unregulierte pathologische Freisetzung des SR-Speichers Ca²⁺¹² zurück.

Die spontane Freisetzung von Ca 2+ aus SR kann als Ca 2+ Funken oder Ca 2+ Wellen nachgewiesen werden, wodurch der Na+/Ca ²⁺ Austauscher (NCX) aktiviert wird. Der Wärmetauscher von einem Ca2+ für drei Na⁺ erzeugt einen nach innen gerichteten Strom, der die diastolische Depolarisation beschleunigt und die Membranspannung an die Schwelle des Aktionspotentials (AP) treibt. In RyR2-Knock-in-Mäusen führt die erhöhte Aktivität von RyR2^R4496C im Sinusknoten (SAN) zu einer unerwarteten Abnahme der SAN-Automatik durch Ca2+-abhängige Abnahme der I_Ca,L- und SR^Ca2+-Depletion während der Diastole, wodurch subzelluläre pathophysiologische Veränderungen identifiziert werden, die zur SAN-Dysfunktion bei CPVT-Patienten beitragen^13,14. Das Auftreten der verwandten zytosolischen^Ca2+-Wellen von Kardiomyozyten ist wahrscheinlicher, wenn die zytosolische [Ca²⁺] im Hintergrund nach einer RyR-Sensibilisierung durch Katecholamin, einschließlich Isoproterenol (ISO), erhöht wird.

Detaillierte kinetische Veränderungen in der Ca 2+ Signalübertragung nach RyR2-vermittelter Ca²⁺ Freisetzung als Reaktion auf die Aktivierung des Aktionspotentials (AP), die die Ursache für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien in intakten kardialen CPVT-Modellen sein könnten, müssen noch für das gesamte Spektrum der berichteten RyR2-Genotypen bestimmt^{werden 12}. In diesem Artikel werden der Aufbau und die experimentelle Vorgehensweise für die Hochdurchsatzkartierung von Ca²⁺ Signalen und Transmembranpotentialen (V_m) in murinen Wildtyp- (WT) und heterozygoten RyR2-R2474S/+ Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und nach Isoproterenol-Provokation. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in isolierten Mäuseherzen.

Für die Experimente werden männliche 10 bis 14 Wochen alte Wildtyp-Mäuse oder RyR2-R2474S/+-Mäuse (C57BL/6-Hintergrund) mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Alle Verfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -verwendung der Southwest Medical University, Sichuan, China, genehmigt (Zulassungs-Nr.: 20160930) in Übereinstimmung mit den nationalen Richtlinien, nach denen die Einrichtung arbeitet.

1. Vorbereitung

1. Lagerlösungen
   1. Blebbistatin-Stammlösung: 1 ml 100%iges Dimethylsulfoxid (DMSO) in den Originalkolben mit 2,924 mg (-) Blebistatin-Pulver geben, um eine Konzentration von 10 mM zu erreichen.
   2. Spannungsanzeiger RH237 Stammlösung: 1 ml 100% DMSO in den Originalkolben mit 1 mg RH237-Pulver geben, um eine Konzentration von 2,01 mM zu erreichen.
   3. Kalziumindikator Rhod-2 AM Stammlösung: Geben Sie 1 ml 100% DMSO in 1 mg Rhod-2 AM-Pulver, um eine Konzentration von 0,89 mM zu erreichen.
   4. Pluronic F127 Stammlösung: 1 ml 100% DMSO in 200 mg Pluronic F127 geben, um eine Konzentration von 20% w/v (0,66 mM) zu erreichen.
   5. Aliquotieren Sie die Stammlösungen in 200-μl-PCR-Röhrchen in 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM und 51 μl Blebbistatin) zur einmaligen oder doppelten Verwendung, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Wickeln Sie die Lösungen dann in Aluminiumfolie ein und lagern Sie sie bei -20 °C, mit Ausnahme der Pluronic F127-Stammlösung, die in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur gelagert wird.
2. Perfusionslösung
   1. Krebslösung (in mM): Bereiten Sie 1 L Krebslösung (NaCl 119, NaHCO₃ 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl_4,7, MgCl 2 1,05, CaCl₂ 1,35 und Glucose 10) vor.
   2. Die Lösung wird mit einem aseptischen 0,22-μm-Nadelfilter filtriert und mit 95 % O₂/5 %_CO2 oxygeniert.
   3. Nehmen Sie 40 ml Krebslösung in ein 50-ml-Zentrifugalröhrchen und lagern Sie es bei 4 °C für die anschließende Herzisolierung.
3. Das Langendorff-Perfusionssystem und das optische Mapping-Gerät
   1. Richten Sie das Langendorff-Perfusionssystem ein.
      1. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
      2. Waschen Sie das Langendorff Perfusionssystem mit 1 L deionisiertem Wasser.
      3. Perfundiert die Lösung aus dem Ansaugtrakt und stellen Sie die Abflussrate auf 3,5-4 ml/min ein. Anschließend wird das Perfusat mit O2/_CO2-Gas (95 %/5 %) bei 37 °C oxygeniert.
         HINWEIS: Eine Blase ist im Perfusionssystem niemals erlaubt.
   2. Bereiten Sie das optische Mapping-System vor.
      1. Installieren Sie die EMCCD-Kamera (512 × 512 Pixel), die Linse (40-fache Vergrößerung), die Leuchtdioden (LEDs) des Wellenlängenteilers, den EKG-Monitor (Elektrokardiogramm) und die Stimulationselektrode (Abbildung 1).
      2. Stellen Sie den richtigen Arbeitsabstand zwischen der Linse und der Herzposition ein.
      3. Stellen Sie zwei LEDs an der diagonalen Position des Thermostatbades für eine gleichmäßige Ausleuchtung ein und stellen Sie eine Wellenlänge von 530 nm zur Erzeugung von Anregungslicht bereit. Verwenden Sie einen ET525/50 Sputter-beschichteten Filter, um jegliches Out-of-Band-Licht für die LEDs zu entfernen.
      4. Stellen Sie den Griffschalter so ein, dass ein gleichmäßiges Quadrat der Zieloberfläche erreicht wird, sodass die Spannungs- und Kalziumbilder auf der Erfassungsschnittstelle angemessen angezeigt werden.
      5. Drehen Sie die Blende des Objektivs auf den maximalen Durchmesser, um ein Austreten von Spannungs- oder Kalziumsignalen zu vermeiden.
      6. Stellen Sie das Kameraobjektiv auf die richtige Höhe ein, da es einen feinen Arbeitsabstand zum Thermostatbad hat, meistens werden 10 cm verwendet.
      7. Schalten Sie die Kamera für eine stabile Probenahmetemperatur bei -50 °C ein.

2. Verfahren

1. Entnahme, Kantubierung und Perfusion von Mäuseherzen
   1. Intraperitoneal injizieren Sie den Tieren Avertinlösung (1,2 %, 0,5-0,8 ml) und Heparin (200 Einheiten), um Leiden und Schmerzreflexe zu minimieren und die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Nach 15 Minuten opfern Sie die Tiere durch Gebärmutterhalsverrenkung.
   2. Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere, entnehmen Sie das Herz vorsichtig und legen Sie es in die kalte Krebslösung (4 °C, 95 % O₂, 5 %_CO2), um den Stoffwechsel zu verlangsamen und das Herz zu schützen.
   3. Entfernen Sie das umliegende Gewebe der Aorta, kanülieren Sie die Aorta mit einer speziell angefertigten Kanülennadel (Außendurchmesser: 0,8 mm, Innendurchmesser: 0,6 mm, Länge: 27 mm) und fixieren Sie sie mit einer 4-0 Seidennaht.
   4. Das Herz mit dem Langendorff-System mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3,5-4,0 ml/min durchbluten und die Temperatur bei 37 ± 1 °C halten.
      HINWEIS: Alle nachfolgenden Verfahren werden in diesem Zustand ausgeführt.
   5. Führen Sie ein kleines Kunststoffröhrchen (0,7 mm Durchmesser, 20 mm Länge) in die linke Herzkammer ein, um den Lösungsstau in der Kammer zu lösen und eine Überlastung zu vermeiden.
2. Entkoppler von Anregungs-Kontraktion und Dual-Dye-Beladung
   1. Stecken Sie zwei Elektroden in das Perfusat in der Badewanne, schalten Sie die Stromversorgung der EKG-Verstärkerbox und des elektrischen Stimulationsreglers ein und starten Sie dann die referenzierte EKG-Software und überwachen Sie das EKG kontinuierlich.
   2. Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch, wenn das Herz einen stabilen Zustand erreicht hat (das Herz schlägt rhythmisch mit ~400 Schlägen pro Minute).
   3. Mischen Sie 50 μl 10 mM Blebistatin-Stammlösung mit 50 ml Krebslösung, um eine Konzentration von 10 μM zu erreichen. Perfusionieren Sie die Blebistatin-Krebs-Lösungsmischung 10 Minuten lang konstant in das Herz, um die Kontraktion von der Erregung zu entkoppeln und Kontraktionsartefakte während des Filmens zu vermeiden.
   4. Verwenden Sie eine rote Taschenlampe, um zu überprüfen, ob die Herzkontraktion vollständig aufhört, da die Kontraktion die Qualität der Farbstoffbeladung beeinflusst.
   5. Nach der Entkopplung von Anregung und Kontraktion werden 15 μl Rhod-2 AM-Stammlösung mit 15 μl pluronic F127-Stammlösung in 50 ml Krebslösung gemischt, um die Endkonzentrationen von 0,267 μM Rhod-2 AM und 0,198 μM pluronic F127 zu erreichen. Anschließend wird das Herz 15 Minuten lang kontinuierlich mit Rhod-2 AM-Arbeitslösung im Langendorff-Perfusionssystem perfundiert.
   6. Halten Sie die Sauerstoffversorgung während der intrazellulären Kalziumfarbstoffbeladung aufrecht. Da sich in Pluronic F127 leicht Blasen bilden, sollte eine Blasenfalle in das Perfusionssystem eingesetzt werden, um eine Gasembolisation der Herzkranzgefäße zu vermeiden.
   7. Verdünnen Sie 10 μl RH237-Stammlösung mit 50 ml Perfusat, um die Endkonzentration bei 0,402 μM zu erreichen, und führen Sie eine 10-minütige Beladung durch.
   8. Machen Sie am Ende der Dual-Dye-Beladung eine Reihe von Fotos, um sicherzustellen, dass sowohl die Spannungs- als auch die Kalziumsignale für die Analyse geeignet sind (keine Wechselwirkung zwischen zwei Signalen).
3. Optische Kartierung und Arrhythmie-Induktion
   ANMERKUNG: Die optische Kartierung beginnt nach Beendigung der Kontraktion und einer entsprechenden Farbstoffbeladung, und das Herz wird nacheinander perfundiert, wie in den oben unter 2.1 (4) beschriebenen Schritten beschrieben.
   1. Schalten Sie die beiden LEDs für die Anregungslichter ein und stellen Sie ihre Intensität in einem geeigneten Bereich ein (stark genug für Beleuchtung und relativ einfaches Filmen, aber nicht zu robust für Überbelichtung).
   2. Legen Sie das Herz unter das Erkennungsgerät, stellen Sie sicher, dass es von zwei LEDs ausreichend beleuchtet wird, und stellen Sie den Lichtfleckdurchmesser auf 2 cm ein.
   3. Stellen Sie den Arbeitsabstand von der Linse zum Herzen auf 10 cm ein, was eine Abtastrate von fast 500 Hz und eine räumliche Auflösung von 120 x 120 μm pro Pixel ergibt.
   4. Öffnen Sie die Signalabtastsoftware, um die Kamera digital zu steuern und gleichzeitig Spannungs- und Kalziumsignale zu erfassen.
   5. Starten Sie den Myopacer-Feldstimulator und stellen Sie das Stimulationsmuster auf Transistor-Transistor-Logik (TTL), 2 ms Stimulationsdauer für jeden Impuls und 0,3 V als Anfangsintensität ein.
   6. Verwenden Sie 30 aufeinanderfolgende 10 Hz S1-Stimuli, um die diastolische Spannungsschwelle des Herzens zu testen, die von der EKG-Aufzeichnungssoftware gesteuert wird. Erhöhen Sie die Spannungsamplitude schrittweise, bis eine 1:1-Erfassung erreicht ist (überprüfen Sie die QRS-Welle des EKG-Monitors, die Signale des Aktionspotentials (AP) und der Kalziumtransienten (CaT).
   7. Nach der Bestimmung der Spannungsschwelle wird das Herz mit einer Intensität von 2x der diastolischen Spannungsschwelle mit einem Paar Platinelektroden beschleunigt, die am Epikardial der linken Herzkammerspitze (ELVA) befestigt sind.
   8. Implementieren Sie das S1S1-Protokoll zur Messung von Kalzium- oder Aktionspotentialalternativen und Restitutionseigenschaften. Takten Sie das Herz nacheinander mit einer grundlegenden Zykluslänge von 100 ms und verringern Sie die Zykluslänge in jeder folgenden Sequenz um 10 ms, bis 50 ms erreicht sind. Jede Episode enthält 30 aufeinanderfolgende Stimuli mit einer Pulsbreite von 2 ms. Beginnen Sie gleichzeitig mit dem optischen Mapping vor der Stimulation (die Abtastzeit umfasst ~10 Sinusrhythmen und Stimulationsdauer).
   9. Um die ventrikuläre effektive Refraktärperiode (ERP) unter Verwendung des S1S2-Stimulusprotokolls zu messen, beginnen Sie mit einer S1S1-Schrittzykluslänge von 100 ms, wobei ein S2 mit 60 ms gekoppelt ist, mit einer 2-ms-Schrittdekrementierung, bis S2 den ektopischen QRS-Komplex nicht mehr erfassen kann.
   10. Bei der Induktion von Arrhythmien führen Sie eine kontinuierliche 50-Hz-Burst-Stimulation (50 kontinuierliche elektrische Stimulationen mit einer Pulsbreite von 2 ms) durch und führen Sie die gleiche Stimulationsepisode nach einem Ruheintervall von 2 s durch.
   11. Beobachten Sie die EKG-Aufzeichnungen während der kontinuierlichen Hochfrequenz-Stimulationsphase sorgfältig, damit die gleichzeitigen optischen Mapping-Aufzeichnungen sofort beginnen können, wenn eine interessante arrhythmische EKG-Welle erzeugt wird (da die meisten Herzrhythmusstörungen durch elektrische Stimulation induziert werden, werden die optischen Signale 2-3 s vor der Burst-Stimulation abgetastet, falls wichtige kardiale Ereignisse verloren gehen).
   12. Bild mit EMCCD-Kamera (Abtastrate: 500 Hz, Pixelgröße: 64 x 64).
4. Datenanalyse
   1. Bildbelastung und Signalverarbeitung
      1. Klicken Sie auf Ordner auswählen und Bilder laden, um die Bilder in die Bilderfassungssoftware zu laden, um eine halbautomatische Analyse von Massenvideodaten gemäß dem zuvor beschriebenen Setup und Protokoll^{zu ermöglichen 15,16}.
      2. Geben Sie die richtigen Sampling-Parameter ein (z. B. Pixelgröße und Framerate).
      3. Legen Sie den Bildschwellenwert durch manuelle Eingabe fest und wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus.
      4. Implementieren Sie einen 3 x 3-Pixel-Gauß-Raumfilter, einen Savitzky-Goaly-Filter und eine Basislinienkorrektur mit Zylinder.
      5. Drücken Sie auf Prozessbilder, um die Baseline zu entfernen und die elektrophysiologischen Parameter wie APD80 und CaTD50 zu berechnen.
   2. Analyse elektrophysiologischer Parameter
      1. Stellen Sie die Initiierungszeit der APD am Peak und den Endpunkt bei 80% Repolarisation (APD80) für die Berechnung von APD80 ein. In ähnlicher Weise wird die CaTD-Startzeit als Peak und der Endpunkt als 80%ige Relaxation definiert.
      2. Die Messung der Leitungsgeschwindigkeit (CV) hängt von der Pixelgröße und der Aktionspotential-Leitungszeit zwischen zwei oder mehr Pixeln ab. Berechnen Sie die durchschnittliche Geschwindigkeit aus allen ausgewählten Pixeln - dies ist die mittlere Leitungsgeschwindigkeit des ausgewählten Bereichs. Generieren Sie gleichzeitig entsprechende isochrone Karten für eine klare Sicht auf die Leitungsrichtung.
         HINWEIS: O'Shea et ^al.15 berichteten ausführlich über die CV-Messung.
      3. Für die Analyse von Alternanen und Arrhythmien werden Calcium-Alternane als eine kontinuierliche große und kleine Peakamplitude definiert, die abwechselnd auftreten. Verwenden Sie das Spitzenamplitudenverhältnis, um den Schweregrad von frequenzabhängigen Alternanen (1-A2/A1) zu bewerten. Wenden Sie Phasenkarten an, um komplexe Arrhythmien wie ventrikuläre Tachykardie (VT) zu analysieren. Achten Sie darauf, dass die Rotoren in einem bestimmten Bereich deutlich erscheinen, wenn sich die Rotoren verschieben.

Die optische Kartierung war in den letzten zehn Jahren ein beliebter Ansatz zur Untersuchung komplexer Herzrhythmusstörungen. Der optische Mapping-Aufbau besteht aus einer EMCCD-Kamera, die eine Abtastrate von bis zu 1.000 Hz und eine räumliche Auflösung von 74 x 74 μm für jedes Pixel bietet. Es ermöglicht ein relativ hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei der Signalabtastung (Abbildung 1). Sobald das Langendorff-perfundierte Herz einen stabilen Zustand erreicht hat und die Farbstoffbeladung abgeschlossen ist, wird das Herz in die homöotherme Kammer unter der Beleuchtung von zwei 530-nm-LEDs gelegt, die zur Anregung des Spannungsindikators RH237 und des^Ca2+-Indikators Rhod-2 AM verwendet werden. Das Emissionslicht wird in zwei Wellenlängen von 600 nm (für Ca²⁺) und 670 nm (für V_m) aufgeteilt, die gleichzeitig mit der EMCCD-Kamera detektiert werden. Nach einer Perfusion von Avertin und Heparin für 15 Minuten wird der Brustkorb mit den chirurgischen Instrumenten (Abbildung 2A) geöffnet und das Herz schnell entnommen, dann in die kalte Krebslösung (4 °C, 95 % O₂, 5 %_CO2) überführt (Abbildung 2B). Reinigen Sie das umliegende Gewebe sorgfältig, fixieren Sie die Aorta mit einer 4-0-Naht und führen Sie einen 0,7 mm Kunststoffschlauch in die linke Herzkammer ein (Abbildung 2C), um die Stauung des Perfusats in der linken Herzkammer zu lösen. Legen Sie die EKG-Ableitungen in das Perfusat (Abbildung 2D) und stellen Sie sicher, dass das Herz rhythmisch gemäß der EKG-Überwachung schlägt, die von der EKG-Aufzeichnungssoftware gesteuert wird. Führen Sie dann im Dunkeln eine Dual-Dye-Beladung durch (Abbildung 2E).

Nachdem die Kontraktionsartefakte durch Blebbistatin (10 μM) minimiert wurden und eine ausreichende Farbstoffbeladung erreicht wurde, begann die Filmaufzeichnung für etwa 10 Sinusschläge vor dem S1S1-Stimulationsprotokoll, um frequenzabhängige elektrophysiologische Parameterrestitutionseigenschaften und Kalziumalternativen nach Isoproterenol-Provokation (1 μM ISO) zu bewerten (Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt eine repräsentative EKG-Wellenfront von VT und entsprechende Aktionspotentiale (AP) und CaT-Spuren, die durch eine 50 Hz-Burst-Pacing-Sequenz in einer CPVT-Maus induziert werden. Optische Signal-Imaging-Software wird verwendet, um eine halbautomatische Analyse großer Videodaten durchzuführen.

Die Abbildungen 4A und B zeigen typische Spuren und Heatmaps von APD80 bzw. CaTD80. ISO verkürzt APD80 bei WT- und CPVT-Mäusen, aber es wurde kein Unterschied zwischen WT- und CPVT-Mäusen vor und nach der ISO-Provokation gefunden (Abbildung 4C, **P < 0,01. n = 5/6). Abbildung 4D zeigt, dass CaTD80 in CPVT-Mäusen nach der ISO-Provokation länger ist als in WT, während es vor der ISO-Behandlung keine Signifikanz gab (**P < 0,01. n = 6.).

Für die Leitungsmessung zeigt Abbildung 5A einen Einzelvektoralgorithmus zur Quantifizierung der CV. Entsprechend den Spannungssignalen besitzen das WT- und das CPVT-Herz zu Studienbeginn und nach ISO-Intervention die gleiche Leitungsfähigkeit über das Epikard (Abbildung 5B). Abbildung 5C,D zeigt die repräsentativen Aktivierungskarten von Spannung und Kalzium in WT- und CPVT-Herzen vor und nach der ISO-Challenge.

Calcium alternans ist ein kritischer Parameter für Herzrhythmusstörungen. Die Calciumamplitudenalternativen werden gemäß der in Abbildung 6A dargestellten Formulierung berechnet. Die Kalziumsignale in WT-Herzen bleiben während der aufeinanderfolgenden S1S1-Stimulation bei 14,29 und 16,67 Hz stabil (Abbildung 6B), während CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternane zeigen (Abbildung 6C). Nach der ISO-Provokation zeigen CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternane im Kalziumsignal während der S1S1-Stimulation, während WT-Herzen nicht beeinflusst werden (Abbildung 6D,E). Nach kontinuierlicher S1S1-Stimulation wird ein Burst-Pacing-Protokoll durchgeführt, um letale Arrhythmien zu induzieren. WT- und CPVT-Herzen zeigen eine normale Leitung während der 50-Hz-Burst-Stimulation zu Studienbeginn (Abbildung 7A). Nach der Perfusion mit ISO zeigen CPVT-Herzen nach 50 Hz Burst-Stimulation hochfrequente Rotoren, während WT-Herzen die normale Leitung beibehalten (Abbildung 7B).

Abbildung 1: Optisches Kartierungsgerät. Das System umfasst eine speziell entwickelte EMCCD-Kamera mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung (Abtastrate bis zu 1.000 Hz, minimales Abtastpixel 74 x 74 μm). Ein elektrischer Stimulationsregler wird für die Probenahme und die Ausgabe des elektrischen Stimulationsprotokolls verwendet. Zwei grüne LEDs werden für das Anregungslicht von Fluoreszenzsonden verwendet. Ein dichroitischer Langpassspiegel (610 nm) und entsprechende Emitter teilen die Spannungs- und Kalziumfluoreszenz-Emissionslichter auf. Der spannungsempfindliche Farbstoff RH237 hat ein Emissionslicht mit einer Spitzenwellenlänge von 670 nm, während Rhod-2 AM, der kalziumempfindliche Farbstoff, ein Emissionslicht mit einer Spitzenwellenlänge von 600 nm besitzt. Geringfügige Änderungen in beiden Fluoreszenzsignalen konnten aufgrund der hohen Abtastrate und Empfindlichkeit des Kamerasensors gleichzeitig von der Kamera erfasst werden. Abkürzungen: EMCCD = elektronenmultiplizierendes ladungsgekoppeltes Gerät; LED = Leuchtdiode; EKG = Elektrokardiogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Präparation und Dual-Dye-Beladung . (A) Die chirurgischen Instrumente. (B) Ernte des Mäuseherzens. (C) Schneiden Sie das überflüssige Gewebe vorsichtig ab, um eine freie Sicht auf die Aorta zu erhalten, und führen Sie einen 0,7 mm dicken Kunststoffschlauch von der Aorta in die linke Herzkammer ein. (D) Das Herz wird schnell in das Langendorff-Perfusionssystem gebracht. (E) Dual-Dye-Beladung und Erregungs-Kontraktions-Beendigung im Dunkeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: S1S1-Protokoll und Arrhythmie-Induktionsprotokoll. (A) Repräsentative EKG-Wellenfront und entsprechende AP- und Kalzium-Signalspuren unter Verwendung des S1S1-Stimulationsprotokolls nach ISO-Provokation. (B) VT-Induktion durch eine 50 Hz-Burst-Pacing-Sequenz nach Perfusion von ISO in einer CPVT-Maus. Abkürzungen: EKG = Elektrokardiogramm; AP = Aktionspotential; ISO = Isoproterenol; VT = ventrikuläre Tachykardie; CPVT = katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: APD80- und CaTD80-Analyse bei 10 Hz vor und nach ISO-Challenge. (A) Repräsentative AP-Traces und APD80-Heatmaps von WT- und CPVT-Herzen vor und nach der ISO-Behandlung. (B) Typische CaT-Traces und CaTD80-Heatmaps von WT- und CPVT-Herzen vor und nach der ISO-Challenge. (C) ISO verkürzt APD80 bei WT- und CPVT-Mäusen, aber es wird kein Unterschied zwischen WT- und CPVT-Mäusen vor und nach der ISO-Herausforderung gefunden. (D) CaTD80 in CPVT-Mäusen ist nach ISO-Provokation länger als in WT, während es vor der ISO-Behandlung keine Signifikanz gab. (* P < 0,05, **P < 0,01. n =5/6.) Abkürzungen: AP = Aktionspotential; APD80 = Peak bei 80% Repolarisation; ISO = Isoproterenol; CPVT = katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Leitungsgeschwindigkeitsanalyse bei 10 Hz. (A) Der Einvektoralgorithmus der Leitungsgeschwindigkeit. (B) Kein Unterschied in der CV von AP bei WT- und CPVT-Mäusen. (C) Repräsentative Heatmaps zeigen, dass CPVT-Mäuse die gleiche Leitungsfähigkeit wie WT-Mäuse vor und nach der ISO-Herausforderung gemäß Spannungssignalen haben. (D) Es wurde kein signifikanter Unterschied in den beiden Gruppen für Aktionspotential-induzierte CaT80-Isochronen vor und nach der ISO-Herausforderung gefunden. Abkürzungen: AP = Aktionspotential; ISO = Isoproterenol; CPVT = katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie; WT = Wildtyp; AT = Aktivierungszeit; CV = Leitungsgeschwindigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Kalziumamplituden-Alternans-Analyse. (A) Der Algorithmus zur Berechnung von Kalziumamplitudenalternanen. (B) Die Kalziumsignale in WT-Herzen bleiben während der aufeinanderfolgenden S1S1-Stimulation bei 14,29 und 16,67 Hz stabil, während (C) CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternane zeigen. (D) WT-Herzen werden durch die ISO-Provokation nicht beeinflusst, während (E) CPVT-Herzen nach der ISO-Provokation frequenzabhängige Alternane im Kalziumsignal während der S1S1-Stimulation aufweisen. Abkürzungen: ISO = Isoproterenol; CPVT = katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Tachyarrhythmie-Analyse mit Hilfe von Phasenkarten . (A) WT- und CPVT-Herzen zeigen eine normale Leitung während der 50 Hz-Burst-Stimulation zu Studienbeginn. (B) Nach der Perfusion mit ISO zeigen CPVT-Herzen nach 50 Hz Burst-Stimulation hochfrequente Rotoren, während WT-Herzen eine normale Leitung aufrechterhalten. Abkürzungen: ISO = Isoproterenol; CPVT = katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Basierend auf unserer Erfahrung sind die Schlüssel zu einer erfolgreichen optischen Dual-Dye-Kartierung eines Mausherzens eine gut vorbereitete Lösung und ein gut vorbereitetes Herz, die Farbstoffbeladung, das Erreichen des besten Signal-Rausch-Verhältnisses und die Reduzierung des Bewegungsartefakts.

Herstellung der Lösung
Die Krebslösung ist für ein erfolgreiches Herzexperiment unerlässlich. MgCl2- und_{CaCl2-Stammlösungen} (1 mol/L) werden im Voraus unter Berücksichtigung ihrer Wasseraufnahme hergestellt und der Krebslösung zugegeben, nachdem alle anderen Komponenten in reinem Wasser gelöst sind, da Mg 2+ und Ca 2+ leicht mit _CO3 ²⁺ ausfallen können. Die Krebs-Lösung wird mindestens 30 Minuten lang mit 95 % O₂/5 %_CO2 aufgeblasen, um die Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Da das Mäuseherz besonders empfindlich auf den pH-Wert reagiert, sollte der pH-Wert der Lösung nach der Sauerstoffversorgung bei etwa 7,4 liegen. Selbst wenn sich winzige Partikel in der Lösung befinden, können die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigt werden, da diese Partikel die Kapillaren verstopfen und den Perfusionseffekt beeinträchtigen können. Daher wird die Lösung vor der Verwendung mit einem aseptischen 0,22-μm-Nadelfilter filtriert.

Vorbereitung des Herzens
Bevor die Herzen entnommen werden, werden die Mäuse zunächst heparinisiert, um die Bildung von Blutgerinnseln im Koronararteriensystem zu vermeiden und zu verhindern, dass eine schlechte Farbdurchblutung, die durch eine Herzstauung verursacht wird, die nachfolgende Bildgebung beeinträchtigt. Je kürzer die ischämische Zeit des Herzens ist, desto besser ist der Zustand des Herzens. Daher wird die ischämische Zeit innerhalb von 2-3 Minuten von der Entnahme des Herzens bis zur Kanülierung über die Aorta am Langendorff-System kontrolliert. Darüber hinaus ist auch ein gut gehaltener Perfusionsdruck unerlässlich. Daher wird ein dünner Silikonschlauch (Kunststoff) in die linke Herzkammer eingeführt, um zu vermeiden, dass der linksventrikuläre Druck während der ventrikulären Kontraktion nach der Ligatur des linksventrikulären Ausgangs zu hoch ist, was zu einer schlechten Myokardperfusion und einer Anoxsäure des Gewebes führen kann.

Beladung mit Farbstoffen
Diese Experimente führen eine Farbstoffbeladung durch, indem das Herz im Langendorff-System durchblutet wird. Es ist wichtig, den Herzrhythmus zu überwachen, da eine schlechte Farbstoffbeladung auftritt, wenn der abnormale Rhythmus durch chirurgische Eingriffe oder Ischämie-Reperfusionsschäden verursacht wird. Das Herz muss gesund genug sein, um die folgenden Schritte ausführen zu können. Rhod-2 AM, ein Ca²⁺-empfindlicher Farbstoff, ist ein Acetylmethylester-Derivat von Rhod 2, das in seiner AM-Form leicht in Zellen geladen werden kann. Eine 100-fache Erhöhung der Fluoreszenzintensität des Moleküls resultiert aus der Ca2⁺ -Chelatbildung¹⁷. Pluronic F127 ist in die Rhod-2 AM-Ladelösung integriert, um die Polymerisation von Rhod-2 AM im Puffer zu verhindern und das Eindringen in die Zellen zu unterstützen. Pluronic F127 kann die Stabilität von Rhod-2 AM verringern, daher wird empfohlen, es nur bei der Vorbereitung der Arbeitslösung hinzuzufügen, aber nicht in der Lagerlösung für die Langzeitlagerung. Der spannungsempfindliche Farbstoff RH237 wird in dieser Studie aufgrund seiner günstigen spektralen Eigenschaften für die Verwendung mit dem^Ca2+ -Indikator Rhod-2 AM verwendet.

Erreichen des besten Signal-Rausch-Verhältnisses
Das Ziel der Bildgebung ist es, Bilder mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zu erhalten, aber das Rauschen ist wie ein schattenhaftes Gespenst, das immer Ärger verursacht. Aufgrund schwacher Signale ist ein geringeres Rauschen bei einigen mikroskopischen Hochgeschwindigkeits-Bildgebungsanwendungen, wie z. B. der optischen Kartierung, besonders wichtig. Das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wird als das mittlere quadratische Amplitudenverhältnis zum mittleren quadratischen Rauschen berechnet, wobei die Rauschamplitude beim Ruhepotential¹⁸ ausgewertet wird. Einige Faktoren, wie Lichtquelle, optische Filter, Fokussieroptik und Fotodetektoren, sind unerlässlich, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. In der Studie wird die Hintergrundregion der Probe auf Rauschen untersucht, das oft auf einem winzigen Niveau schwankt. Das optische Signal, das von jedem Pixel erfasst wird, ist der Durchschnitt des von seiner Oberfläche emittierten Lichts. AP- und Kalziumaktivitäten oszillieren während der Arrhythmie, und die Amplitude beider Signale ist relativ gering. Schon geringe Interferenzen können zu Verzerrungen optischer Signale und zu Fehlern bei der Datenanalyse führen. Daher sollte bei der Interpretation optischer Signale Vorsicht geboten werden, wenn die lokale Heterogenität durch elektrische Funktion bei Arrhythmien wie VT verursacht wird.

Reduzieren Sie das Bewegungsartefakt
Im Vergleich zur Elektrodenableitung werden optische Signale aufgrund von Bewegungsartefakten häufig durch die Kontraktionsaktivität der Langendorff-perfundierten Herzen beeinflusst. Um genaue optische Signale zu erfassen, werden meist pharmakologische Inhibitoren der Erregungskontraktion verwendet. Um das Bewegungsartefakt während der Bildgebung zu minimieren, wird Blebbistatin eingesetzt, um den Herzschlag zu stoppen. Es ist ein selektiver Inhibitor der ATPase-Aktivität von Nicht-Muskel-Myosin II und entkoppelt effektiv den Erregungs-Kontraktion-Prozess des Herzens 19,20,21. Obwohl einige Studien einige Nebenwirkungen bei der Verwendung der Verbindung²² andeuten, verwenden wir die niedrigste Arbeitskonzentration von 10 μM, um die mögliche Schädigung des Herzens zu minimieren.

ElectroMap-Software zur Analyse von kardialen optischen Mapping-Datensätzen
ElectroMap ist eine Open-Source-Software mit hohem Durchsatz für die Analyse von optischen Kardiogrammdatensätzen. Es bietet eine Analyse der wichtigsten kardialen elektrophysiologischen Parameter, einschließlich AP- und CaT-Morphologie, CV, diastolisches Intervall, dominante Frequenz, Time-to-Peak und Relaxationskonstante (τ) ^15,23. Die Software ermöglicht mehrere Filteroptionen, darunter den Gauß-Filter, den Savitzky-Goaly-Filter und die Top-Hat-Grundlinienkorrektur. Der Gauß-Filter ist eine zweidimensionale Glättung, bei der die gewichtete durchschnittliche Glättung jedes Kanals und benachbarter Kanäle berechnet wird. Es wird häufig für Spike-Glitch-Geräusche verwendet. Der Savitzky-Goaly-Filter passt eine untere polynomiale und kontinuierliche Teilmenge benachbarter Datensätze durch die Methode der kleinsten Quadrate an, die den Bedarf an verschiedenen glatten Filtern erfüllt und auch für die Verarbeitung nichtperiodischer und nichtlinearer Datensätze geeignet ist, die aus Rauschen abgeleitet werden. Die Top-Hat-Baseline-Korrektur kann die optischen Signale entsprechend den Peaks der Leiterbahnen auf die gleiche Höhe einstellen und Parameter wie die Aktionspotentialdauer (APD) und die Kalzium-Transientendauer (CaTD) viel genauer berechnen. Basisliniendrift tritt gelegentlich bei der Abtastung von Spannungs- und Kalziumfluoreszenzsignalen auf. Es ist auch nützlich bei der Berechnung von Kalziumalternanen und Amplitude. Beide Ventrikel wurden für die elektrophysiologische Untersuchung ausgewählt.

Vor- und Nachteile des Dual-Dye-Mappings und Methoden zur Begrenzung von Interferenzen
In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass es wichtig ist, die Depolarisation oder Repolarisation von Zellen und die Heterogenität der interzellulären Leitung im gesamten Herzen sowie die Kopplung von Membranuhr und Kalziumuhr zu klären, was für das Verständnis des Mechanismus von Krankheiten wie Arrhythmie entscheidend ist^24,25. Die optische Kartierung hat eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung, um die ventrikulären Aktivierungs- und Repolarisationseigenschaften des Herzens transgener Mäuse zu bestimmen^26,27,28,29. Es kann auch Multiparameter-Bildgebung detektieren, z. B. Messung des Membranpotentials und des intrazellulären Kalziums desselben Herzens^24,30 oder Gewebes^31,32, das mit Spannung und kalziumempfindlichem Farbstoff beladen ist. Die Dual-Dye-Bildgebung ist vorteilhaft für die Untersuchung der Beziehung zwischen Aktionspotenzial und Kalzium, wie z. B. die Beziehung zwischen der Membranuhr (M) und der Ca²⁺ (C)-Uhr oder die spontane und verzögerte Kalziumfreisetzung nach Depolarisation (DAD). Eine normale Herzerregung erfordert dann, dass die zyklischen Ereignisse in den beiden Uhren aufeinander abgestimmt werden. Eine Störung dieser Ausrichtung führt zu einer Herzrhythmusstörung²⁵. Die Beziehung zwischen spontaner Kalziumfreisetzung und DAD ist der Mechanismus, der Aktivitäten bei Herzinsuffizienz auslöst ³³. Die Kombination der Farbstoffe sollte jedoch sorgfältig ausgewählt werden. Die Kombination von RH-237/Rhod-2 oder di-4-ANEPPS/Indo-1 ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme, während Fluo-3/4/di-4-ANEPPS zu Fehlern aufgrund überlappender Emissionsspektren von zwei Farbstoffen^{führt 30,34,35}. In diesem Experiment wurden RH237 und Rhod-2 AM ausgewählt, um das Herz zu belasten, und es wurde eine gute Bildqualität erzielt.

Darüber hinaus verfügt die in diesem Protokoll verwendete Kamera über zwei Zieloberflächen, die es ihr ermöglichen, die geteilten Signale auf einer Abtastschnittstelle zu erfassen und es einer einzelnen Kamera zu ermöglichen, zwei verschiedene Emissionswellenlängen zu detektieren. Eine solche gleichzeitige Kartierung von optischen AP und CaT, die verschiedene Photoelektronenspektroskopie-Protokolle (PES) kombiniert, wird es uns ermöglichen, die Wechselbeziehung zwischen abnormalem [Ca²⁺]_i und elektrischer Instabilität unter Stressbedingungen und den Effekt der Potenzierung nach der Aktivierung auf diese Anomalien zu bestimmen. Die räumlich heterogene Natur des SR Ca²⁺ Zyklus und wie sich dies auf die Entstehung, den Schweregrad und die Konkordanz von elektrischen Alternanen und arrhythmogenem Verhalten, wie räumlich diskortanten Alternanen und daraus resultierenden VTs, auswirkt, wird im intakten Herzen in verschiedenen Gruppen untersucht. SR Ca²⁺ Alternane, RyR2 Refraktärität und ihre Rolle in SR Ca²⁺ und APD Alternans werden untersucht.