En pilotstudie om repeterende transkraniell magnetisk stimulering av Aβ- og Tau-nivåer i Rhesus Monkey Cerebrospinalvæske

Amyloid-β (Aβ) og tau er viktige CSF biomarkører. Aβ består av 42 aminosyrer (_Aβ1-42), som er produktet av transmembran amyloid forløperprotein (APP) hydrolysert av β- og γ-secretases1. _Aβ1-42 kan aggregeres til ekstracellulære amyloidplakk i hjernen på grunn av løselighetsegenskapene1,2. Tau er et mikrotubule-assosiert protein som hovedsakelig er tilstede i axoner og er involvert i anterograd axonal ^transport3. Unormal tau hyperfosforylering er hovedsakelig indusert av ubalansen mellom kinases og fosfater, noe som resulterer i løsrivelse av tau fra mikrotubuler og dannelsen av nevrofibrillære tangles (NFT)¹. Konsentrasjonen av tau øker i CSF fordi tau og fosforylaterte tauproteiner (pTau) slippes ut i det ekstracellulære rommet under nevrodegenerativ prosess. Tidligere studier har vist at CSF biomarkører er relevante for de tre viktigste patologiske endringene i Alzheimers sykdom (AD) hjerne: ekstracellulære amyloidplakk, intracellulær NFT-dannelse og nevrontap4. Unormale konsentrasjoner av Aβ og tau tilstede i det tidlige stadiet av AD, og tillater dermed tidlig ^{AD-diagnose5,6}.

I 2016 fant Tsai et al. at ikke-invasiv lysflimmer (40 Hz) reduserte nivåene av _Aβ1-40 og _Aβ1-42 i den visuelle cortex av pre-deponerende ^mus7. Nylig rapporterte de videre at auditiv tonestimulering (40 Hz) forbedret anerkjennelse og romlig minne, reduserte amyloidproteinnivåer i hippocampus og auditiv cortex (AC) av 5XFAD-mus, og reduserte pTaukonsentrasjoner i P301S tauopathy ^model8. Disse resultatene indikerer at ikke-invasive teknikker kan påvirke Aβ og tau metabolisme.

Som et ikke-invasivt verktøy kan transkraniell magnetisk stimulering (TMS) elektrisk stimulere nevralt vev, inkludert ryggmargen, perifere nerver og hjernebark9. Videre kan det endre eksitabiliteten til hjernebarken på det stimulerte stedet og i funksjonelle forbindelser. Derfor har TMS blitt brukt til behandling av nevrodegenerative lidelser og prognostiske og diagnostiske tester. Den vanligste formen for klinisk intervensjon i TMS, rTMS, kan indusere cortex-aktivering, endre cortexens spenning og regulere kognitiv / motorisk funksjon.

Det ble rapportert at 20 Hz rTMS hadde en in vitro neuroprotective effekt mot oksidative stressorer, inkludert glutamat og Aβ og forbedret den generelle levedyktigheten til monoklonale hippocampale HT22-celler hos ^mus10. Etter 1 Hz rTMS-stimulering ble det β APP-cleaving enzymet 1, APP og C-terminalfragmentene i hippocampus betydelig redusert. Spesielt ble svekkelsen av langsiktig potensiering, romlig læring og minne i hippocampal CA1 ^{reversert11,12}. Bai et al. undersøkte effekten av rTMS på den Aβ-induserte gammaoscillasjonsdysfunksjonen under en arbeidsminnetest. De konkluderte med at rTMS kunne reversere Aβ-indusert dysfunksjon, noe som resulterte i potensielle fordeler for ^{arbeidsminne13}. Det er imidlertid få rapporter om effekten av rTMS på tau metabolisme og de dynamiske endringene i Aβ og tau i CSF før og etter rTMS. Denne protokollen beskriver prosedyren for å undersøke effekten av rTMS ved forskjellige frekvenser (lav frekvens, 1 Hz, høye frekvenser, 20 Hz og 40 Hz) på Aβ- og tau-nivåer i rhesus monkey CSF.

Alle forsøkene ble utført under veiledning for pleie og bruk av forsøksdyr, formulert av Vitenskaps- og teknologidepartementet i Folkerepublikken Kina, samt prinsippene i Basel-erklæringen. Godkjenning ble gitt av Animal Care Committee ved Sichuan University West China Hospital (Chengdu, Kina). Figur 1 viser den enblinde, selvkontrollerte studiedesignen som brukes her.

1. rTMS-enheter

1. Bruk en 8-formet magnetfeltstimulatorspole for å utføre rTMS-stimuleringen.

2. Dyr

1. Hold den mannlige rhesusape (Macaca mulatta, 5 kg, 5 år gammel) i et individuelt hjemmebur med fri tilgang til vann fra springen og standard chow. Sørg for at miljøforholdene styres for å gi en relativ fuktighet på 60-70%, en temperatur på 24 ± 2 °C og et lys på 12:12 timer: mørk ^syklus14,15. Utfør alle forsøkene i henhold til veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr.

3. En seriell cisterna magna CSF prøvetakingsmetode

1. Be to opplærte eksperimentere utføre en kateteriseringsmetode for å prøve CSF fra cisternamagnaten (figur 2).
2. Posisjonering
   1. Bedøv apen ved en intramuskulær injeksjon på 5 mg/kg zolazepam-tiletamin (se materialtabellen). For å sikre vellykket bedøvelse av apen, se etter dyp og langsom pust, kjedelig eller fraværende hornhinnerefleks og avslapning av ekstremiteter. Overvåk temperatur, puls, åndedrett, slimhinnefarge og kapillær påfyllingstid i dette stadiet.
   2. Administrer 2 mg/kg morfin via intramuskulær injeksjon hver fjerde time.
   3. Plasser apen på et operasjonsbord i lateral decubitus posisjon. Bøy apens nakke, anelse baksiden av apen, og ta knærne mot brystet.
3. Punktering
   1. For desinfeksjon, forbered området rundt korsryggen ved hjelp av aseptisk teknikk. Sett inn en spinal nål mellom lumbale ryggvirvler L4 / L5, skyv den inn til det er en "pop" når den kommer inn i lumbal sisternen der ligamentum flavum er plassert.
   2. Skyv nålen igjen til det er en annen "pop" der den kommer inn i dura mater. Trekk stylet fra spinal nålen og samle dråper CSF.
4. Innsetting av kateter
   1. Under fluoroskopisk veiledning setter du epiduralkateteret gjennom punkteringsnålen inn i subarachnoidrommet til det er oppdrift i cisternamagnaten.
5. Portimplantasjon
   1. Lag et 5 cm snitt fra punkteringsstedet til hodets retning og isoler huden fra subkutant vev for å plassere prøvetakingsporten. Koble porten til enden av epiduralkateteret og implanter porten under huden; deretter, suturer snittet. Desinfiser såret daglig for å forhindre infeksjon.
      MERK: Apen gjenoppretter helt dagen etter operasjonen.
6. CSF-samling
   1. Bruk burets stenger for å holde apen fast og holde ryggen bøyd.
   2. Sett inn en sprøyte i midten av prøvetakingsporten for å trekke ut CSF fra cisternamagnaten gjennom kateteret. Kast den første 0,2 ml CSF (det totale volumet av kateteret og porten er 0,1 ml), og samle deretter 1 ml CSF for ^analyse16.

4. Monkey stol adaptiv trening

1. Fest apen på apestolen før eksperimentet for å unngå å avbryte prosessen med rTMS-intervensjon (figur 3A,B).
2. Samle CSF for biomarkør analyse i våken tilstand av apen for å unngå påvirkning av bedøvelsesmidler.
3. På den tredje dagen etter subarachnoid kateterisering, 2 uker før starten av eksperimentet, utsette apen til adaptiv trening med apestolen, to ganger om dagen, i 30 minutter hver gang.

5. rTMS adaptiv trening / sham stimulering

1. Utfør rTMS adaptiv trening / sham stimulering en uke etter den adaptive treningen med apestolen, en uke før starten av det formelle eksperimentet for å unngå å hindre fremdriften av eksperimentet på grunn av vibrasjoner og lyder under stimuleringsprosessen.
2. Bruk en sham spole (som bare produserer vibrasjon og lyd og ikke genererer et magnetfelt) for å stimulere apen. Tilby mat til apen etter stimulering for å hjelpe den med å tilpasse seg prosessen (figur 3C).
3. Utfør rTMS adaptiv trening på en apestol to ganger om dagen, i 30 minutter hver gang i totalt 2 uker.

6. Behandlingsprotokoll

1. Bruk tre forskjellige frekvenser (1 Hz / 20 Hz / 40 Hz) rTMS for å stimulere apens bilaterale DLPFC (R-L-DLPFC), som beskrevet ^tidligere17. Lokaliser DLPFC i henhold til det internasjonale 10-20-systemet.
   1. Utfør tre forskjellige økter med rTMS med en utvaskingsperiode på over 24 ^h18,19.
      1. For den første perioden, bruk følgende parametere: en frekvens på 1 Hz for rTMS, et mønster av rTMS sammensatt av 20 burst tog, 20 pulser med 10 s inter-train intervaller mellom tog, og en intensitet av stimulering av 100% av den gjennomsnittlige hvilemotorterskelen (RMT), to ganger om dagen i tre påfølgende ^dager20,21.
      2. For den andre perioden, bruk følgende parametere: tog med høy frekvens (20 Hz) rTMS med 100% RMT for 2 s varighet med 28 s inter-tog intervaller, totalt 2000 stimuli (40 stimuli / tog, 50 tog) hver økt, to ganger om dagen i tre påfølgende ^dager22.
      3. For den tredje perioden, bruk følgende parametere: tog av gammafrekvens (40 Hz) rTMS med 100% RMT levert i 1 s varighet separert med 28 s inter-tog intervaller. Hold det totale antallet pulser for hver økt på samme måte som med 20 Hz rTMS, to ganger om dagen i tre påfølgende ^dager7,22.

7. CSF biomarkører

1. Analyser fire CSF biomarkører: _Aβ42, _Aβ42/_Aβ40, tTau og pTau.

8. CSF-samlings- og indeksdeteksjonsmetode

1. Bruk en minimalt invasiv kateteriseringsmetode for å prøve CSF.
2. Bruk burets stenger for å holde apen fast og holde ryggen bøyd. Be den andre operatøren om å sette inn en sprøyte i midten av prøvetakingsporten, og sørg for at CSF ekstraheres gjennom kateteret.
3. Samle CSF ved 5 tidspunkter (4 prøver hvert tidspunkt med 3 minutters intervaller): pre-rTMS, 0 t/ 2 t / 6 t / 24 h post-rTMS23,24,25. Samle totalt 60 prøver for 3 frekvenser; og oppbevar dem i et kjøleskap på -80 °C i opptil 1 måned. Etter eksperimentet, underkast alle prøver til væskebrikkedeteksjon i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen).

9. Statistisk analyse

1. Presentere alle data som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD).
2. Utfør Shapiro-Wilk-testen for å teste normaliteten i tilfelle en liten prøvestørrelse. Utfør toveis gjentatte mål ANOVA og Tukeys multi-sammenligningstest.
   MERK: En verdi (tosidet) < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultatene viste at rTMS kunne påvirke Aβ- og tau-nivåene i rhesus monkey CSF. CSF biomarkørnivåer endret seg med tiden etter rTMS-stimulering ved forskjellige frekvenser (1 Hz, 20 Hz og 40 Hz).

_Aβ42 og Aβ42/Aβ40
Som vist i figur 4A, etter 1 Hz rTMS-stimulering, økte _{Aβ42-nivåene} gradvis over 24 timer (p < 0,05) og returnerte til baseline etter utvaskingsperioden. På samme måte, etter å ha stimulert den bilaterale DLPFC av apen med rTMS ved 20 Hz, økte _{Aβ42-nivåene} med tiden og nådde en topp på 6 timer etter stimulering (p < 0,05). Men etter stimulering med 40 Hz rTMS økte _{Aβ42-nivåene} betydelig umiddelbart på tidspunktet for post-rTMS (p < 0,05) og redusert sakte. Generelt økte de høye frekvensene til rTMS (20 Hz og 40 Hz) _{Aβ42-nivåene} i større grad enn den lave frekvensen (1 Hz) (p < 0,05). Videre økte _{Aβ42-nivåene} raskere ved de høye frekvensene, spesielt ved 40 Hz, nådde en topp like etter stimulering. Videre steg _{Aβ42-nivået} på 40 Hz betydelig sammenlignet med det ved 20 Hz (p < 0,05). Forholdet mellom _Aβ42/_Aβ40 viste en oppadgående trend etter stimulering med 1 Hz og 20 Hz rTMS og økte betydelig fra 2 timer etter rTMS-stimulering. Videre økte den i større grad etter 20 Hz rTMS enn med 1 Hz (p < 0,05) (figur 4B). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i forholdet _Aβ42/_Aβ40 ved 40 Hz.

pTau og tTau
Totalt sett økte tTau-nivåene i ape-CSF umiddelbart etter både 20 Hz og 40 Hz rTMS-stimulering (p < 0,05) og redusert gradvis (figur 4C). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell etter 1 Hz rTMS. pTau-nivået økte umiddelbart og dramatisk etter stimuleringen med 40 Hz rTMS (p < 0,05) og redusert til under baseline-nivået etter 24 timer (figur 4D). I tillegg viste pTau-nivået en nedadgående trend etter 1 Hz og 20 Hz rTMS-stimulering. Sammenlignet med de to andre frekvensene (1 Hz og 20 Hz) viste derfor 40 Hz rTMS mer signifikante effekter på Tau-nivåer (p < 0,05).

Grunnlinje etter blekes
Etter en 24 timers utvaskingsperiode ble det ikke observert noen signifikant forskjell fra baseline (p > 0,05) i noen CSF biomarkørnivåer.

Figur 1: Flytskjemaet for denne pilotstudien. Forkortelse: rTMS = repeterende transkraniell magnetisk stimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Minimal invasiv kateterisering for seriell prøvetaking av CSF fra cisternamagnat. En rutinemessig lumbal punktering ble etterfulgt av en minimalt invasiv kateterisering, der et epiduralt kateter trengte inn i subarakkoidrommet og ble holdt flytende i cisternamagnaten under veiledning av røntgen (rød pil). En prøvetakingsport ble etterlatt subkutant ved siden av punkteringspunktet for å tillate prøvetaking av cisternamagnaten CSF under i et fullt bevisst dyr. Forkortelse: CSF = cerebrospinalvæske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Opplæring i tilpasningsevne for apestol. (A) Foran; (B) lateral; (C) rTMS adaptiv trening/sham stimulering. Forkortelse: rTMS = repeterende transkraniell magnetisk stimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Effekter av rTMS på Aβ- og tau-nivåer i rhesusape CSF. De fem stolpene for hver frekvens representerer fem tidspunkter: pre-rTMS, 0 h post-rTMS, 2 h post-rTMS, 6 h post-rTMS og 24 timer etter rTMS. (A) Endringer i _Aβ42 nivå i ape CSF etter rTMS; (B) endringer i forholdet _Aβ42/_Aβ40 i ape CSF etter rTMS; (C) endringer i tTau nivåer i ape CSF etter rTMS stimulering; (D) Endringer i pTau nivåer i ape CSF etter rTMS. * representerer en signifikant forskjell fra pre-rTMS nivå, p < 0,05. # og ▲ representerer signifikante forskjeller fra nivået på henholdsvis 1 Hz eller 20 Hz samtidig. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** representerer p < 0,0001. Forkortelser: rTMS = repeterende transkraniell magnetisk stimulering; CSF = cerebrospinalvæske; tTau = totalt Tau; pTau = fosforylatert Tau. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

_Aβ1-42, en veletablert biomarkør av AD, er en CSF kjernebiomarkør relatert til Aβ metabolisme og amyloid plakkdannelse i hjernen og har blitt mye brukt i kliniske studier og ^klinikken26. Nyere studier har vist at CSF _Aβ42/_{Aβ40-forholdet} er en bedre diagnostisk biomarkør for AD enn _Aβ42 alene fordi det er en bedre indikator på AD-type ^{patologi27,28}. Tau- og pTau-proteiner slippes ut i det ekstracellulære rommet under nevrodegenerativ prosess, noe som resulterer i økte taukonsentrasjoner i ^CSF20,29. Derfor er CSF _Aβ1-42, _Aβ42/_Aβ40, tTau og pTau bekreftet og kombinert CSF biomarkører i de reviderte diagnostiske kriteriene til ^AD1,29.

Denne studien viser at etter rTMS-stimuleringen viste _{Aβ42-nivåene} i CSF en oppadgående trend ved alle frekvenser. Høyfrekvent rTMS (20 Hz og 40 Hz) økte _{Aβ42-nivåene} i større grad enn den lave frekvensen. Ifølge tidligere ^{forskning30,31} er et lavt nivå av _Aβ42 i CSF forbundet med AD-spesifikk nevrodegenerasjon (dvs. hippocampal atrofi). Økningen i Aβ etter rTMS-stimulering reverserer imidlertid de patologiske egenskapene til AD, noe som indikerer at rTMS kan normalisere Aβ-nivåer. En preklinisk studie indikerer at Aβ-nivået er regulert av nevronal ^aktivitet32. Derfor kan høyfrekvent rTMS, vs. lavfrekvent rTMS, øke produksjonen av alle Aβ-stoffer, inkludert _Aβ42, ved å aktivere nevral nettverksaktivitet. I tillegg fant studien at etter 24 timer rTMS ved tre forskjellige frekvenser (1 Hz, 20 Hz og 40 Hz) var pTau-nivået under grunnlinjen. Dette indikerte en reduksjon i det unormale pTau-proteinet, redusere bindingen til mikrotubuler og opprettholde den normale strukturen av nevroner. Men etter høyfrekvent rTMS økte tTau-nivået av CSF umiddelbart og gradvis redusert over 24 timer. Mekanismen bak dette fenomenet er fortsatt uklar.

Denne studien bekrefter objektivt effekten av rTMS på Aβ og tau metabolisme i CSF. Sammenlignet med andre evalueringsmetoder, kan CSF biomarkører reflektere hjernens metabolisme og patologi, noe som gir et vindu for hjernen. Denne metoden er trygg og godt tolerert og har stor klinisk anvendbarhet33,34. Den vanligste teknikken for å samle CSF er å utføre en lumbal punktering. Det er imidlertid utfordrende å samle CSF flere ganger på kort tid, da det er risiko for CNS-infeksjon og CSF-lekkasje på grunn av den gjentatte dural ^{punktering35,36}.

Denne protokollen bruker en ny CSF-prøvetakingsmetode, som muliggjør gjentatt CSF-prøvetaking under helt våkne forhold, med lav risiko for de nevnte bivirkningene. Prøvetakingsporten er plassert under huden slik at apen ikke kan klø på porten. Derfor kan CSF samles direkte gjennom prøvetakingsporten i stedet for ved lumbal punktering. Metoden er praktisk og rask og unngår virkningen av ^bedøvelse16. Derfor kan forskere som trenger flere prøver av ape CSF vurdere denne serielle cisterna magna CSF prøvetakingsmetoden. For å unngå å avbryte prosessen med rTMS, er adaptiv trening av apestol og rTMS adaptiv trening viktig før du begynner eksperimentet.

Likevel har apens hode fortsatt et lite spekter av bevegelse under eksperimentet selv etter treningen. Derfor er det tilrådelig å bruke et robotassistert sporingssystem, for å lokalisere stimuleringsstedene og plassere TMS-spolen samtidig når hodet beveger seg. Denne studien har noen begrensninger: dyret som ble brukt her var en vanlig ape i stedet for en patologisk modell (for eksempel alderen ^{hjørnetenner37}), og prøvestørrelsen var liten. Imidlertid har denne pilotstudien vist interessante dynamiske endringer i nivåene av Aβ og tau etter rTMS, noe som indikerer de potensielle fordelene med rTMS på AD og garanterer videre undersøkelse.