Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten}DNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen

Luftverschmutzung ist heute ein ernstes Umweltproblem, mit dem die Welt konfrontiert ist. Feinstaub (PM_2.5),einer der wichtigsten Indikatoren für die Luftqualität, kann eine große Anzahl von Schadstoffen enthalten und in den Blutkreislauf gelangen, was die menschliche Gesundheit ernsthaft schädigt¹. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine PM_{2.5-Exposition} zu einem erhöhten Risiko für angeborene Herzfehler (KHK) führen kann^2,3. Beweise aus Tierversuchen zeigten auch, dass PM_2,5 eine abnormale Herzentwicklung bei Zebrafischembryonen und den Nachkommen von Mäusen verursachen^kann,aber die molekularen Mechanismen der kardialen Entwicklungstoxizität von PM_2,5 sind noch weitgehend unbekannt⁴,^5,6.

DNA-Schäden können zu einem Stillstand des Zellzyklus führen und apoptose induzieren, was das Potenzial von Vorläuferzellen weitgehend zerstören und folglich die Herzentwicklung beeinträchtigen kann⁷⁾. Es ist gut dokumentiert, dass Umweltschadstoffe, einschließlich PM_2,5,das Potenzial haben, DNA durch oxidative Stressmechanismen anzugreifen^8,9. Sowohl die herzische Entwicklung des Menschen als auch des Zebrafisches reagiert empfindlich auf oxidativen Stress^10,11,12. 8-OHdG ist ein oxidativer DNA-Schadensmarker, und das γH2AX-Signal ist ein Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. N-Acetyl-L-Cystein (NAC), ein synthetischer Vorläufer von intrazellulärem Cystein und Glutathion, wird häufig als antioxidative Verbindung verwendet. In dieser Studie verwenden wir NAC, um die Rolle von oxidativem Stress bei PM_2,5- induzierten DNA-Schäden¹³zu untersuchen.

Zebrafisch als Modellwirbeltier wurde häufig verwendet, um die Herzentwicklung und menschliche Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen, da Mechanismen der Herzentwicklung bei Wirbeltieren hoch konserviert sind^14,15. Zu den Vorteilen der Verwendung von Zebrafischen als Modell gehören ihre geringe Größe, ihre starke Fortpflanzungsfähigkeit und ihre niedrigen Fütterungskosten. Von besonderem Interesse für diese Studien sind Zebrafischembryonen, die während der frühen Entwicklung nicht vom Kreislaufsystem abhängig sind und schwere Herzfehlbildungen überleben können¹⁴. Darüber hinaus ermöglicht ihre Transparenz die direkte Beobachtung des gesamten Körpers unter dem Mikroskop. Somit bieten Zebrafischembryonen eine hervorragende Gelegenheit, die molekularen Mechanismen zu bewerten, die an der Induktion der kardialen Entwicklungstoxizität infolge der Exposition gegenüber verschiedenen Umweltchemikalien beteiligt sind^5,16,17. Wir haben bereits berichtet, dass PM_{2,5-induzierter}oxidativer Stress zu DNA-Schäden und Apoptose führt, was zu Herzfehlbildungen bei Zebrafischen führt¹⁸. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung von PM_{2,5-induzierten}DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zur Verfügung.

Wildtyp-Zebrafische (AB), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China, bezogen. Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Animal Care Institution der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.

1. PM_2.5 Probenahme und Extraktion organischer Verbindungen

HINWEIS: PM_2.5 wurde in einem städtischen Gebiet in Suzhou, China, vom 1. bis 7. August 2015 gesammelt, wie zuvor^{beschrieben 5}.

1. Backen Sie 47 mm Quarzmembranfilter in einem 500 °C Schalldämpferofen für 2 h, um die organischen Bestandteile zu entfernen.
2. Legen Sie einen Filter in einen PM_{2.5-Probenehmer} für 24 Stunden ununterbrochene Probenahme.
3. Den Filter abnehmen und 24 h bei Raumtemperatur trocknen lassen.
4. Quantifizieren Sie den Filter mit einer Analysenwaage.
5. Extrahieren Sie organische Komponenten aus dem Filter durch Soxhlet-Extraktion unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel¹⁹.
6. Trocknen Sie das EOM durch eine Rotationsverdampfung in einem 60 °C Wasserbad und Stickstoffstrom. EOM in DMSO auflösen und bei -20 °C lagern.

2. Entnahme und Behandlung von Zebrafischembryonen

1. Halten Sie den Zebrafisch bei 28,5 ± 0,5 °C in einem rezirkulierenden Aquakultursystem mit einem 14 h hellen und 10 h dunklen Photoperiodenzyklus.
2. Legen Sie gesunde erwachsene Zebrafische in einem Verhältnis von 2: 1 männlich zu weiblich in ein Becken.
3. Sammeln Sie am nächsten Tag die Embryonen und waschen Sie sie mit Systemwasser (z. B. Zebrafischbrutwasser).
4. Auswahl und zufällige Aufteilung von Zebrafischembryonen, die eine normale Entwicklung zeigen (gleichmäßige Größe, volle Körner und keine Eigerinnung), in 4 Gruppen in einzelnen Glas-Petrischalen mit einem Durchmesser von 7 cm (ca. 50 Embryonen pro Gericht).
5. Behandeln Sie die Embryonen mit PM_2,5 (5 mg/L) in Gegenwart oder Abwesenheit von NAC bei 0,25 μM von 2 hpf bis 72 hpf. Verwenden Sie DMSO als Fahrzeugsteuerung bis zu einer Endkonzentration von 0,1% (v/v).

3. Morphologische Beobachtung von Zebrafischembryonen und Herzdissektion

1. Bei 72 PSf embryonieren Sie sie auf Glasobjektträger und beobachten unter einem Stereomikroskop. Zeichnen Sie Herzfehlbildungen wie Perikardödeme, veränderte Schleifen und verminderte Größe auf.
2. Berechnen Sie die Fehlbildungsraten (den Prozentsatz der Embryonen mit Herzfehlern an den gesamten lebenden Embryonen) und analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen mitHilfe der Einweg-ANOVA, gefolgt vom türkischen Multiple Comparison Test (p < 0,05 = statistisch signifikant).
3. Betäuben Sie die Embryonen mit 0,6 mg/ml MS-222, um sie auf Glasobjektträgern zu immobilisieren.
4. Zeichnen Sie Herzschläge für 30 s auf und quantifizieren Sie die Herzfrequenz mit der ImageJ-Software^5,20.
5. Sezieren Sie Herzen aus Zebrafischembryonen mit einer Einwegspritzennadel unter einem Stereomikroskop. Achtung: Vermeiden Sie es, die Herzform zu zerstören.

4. Immunfluoreszenz-Assay

1. Um einen Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten} DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zu verwenden, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einer sauberen Glasseite zu zeichnen.
2. Fügen Sie 50 μL 4% Paraformaldehyd zu 1,25 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um eine fixierende Lösung herzustellen.
3. 3 sezierte Herzen in einen hydrophoben Barrierestiftkreis geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 5 min, so dass die Herzen vollständig an den Glasobjektträgern haften.
5. Waschen Sie die Dias dreimal in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST) für 5 min pro Waschgang.
6. Fügen Sie 50 μL Rinderserumalbumin (BSA) zu 1000 μL PBST hinzu, um eine 5% ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 1 h, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.
7. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 Minuten pro Waschgang.
8. Verdünnen Sie 2 μL monoklonalen Antikörper der Maus gegen 8-OHdG und 2 μL polyklonaler Antikörper gegen γH2AX in 296 μL PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.
9. Inkubieren Sie die Herzproben mit 50 μL der primären Antikörper-Cocktaillösung gegen 8-OHdG und γH2AX in einer befeuchteten Kammer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (Inkubation über Nacht kann die Signalintensität erhöhen).
10. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 Minuten pro Waschgang.
11. Verdünnen Sie 1 μL FITC-markierten sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und 1 μL cy3 Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 498 μL PBST, um eine funktionierende sekundäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Proben mit den sekundären Antikörpern (1:500 in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
12. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für 5 minuten pro Lichtschutz.
13. 20 μL DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) werden den Proben zur Kernfärbung für 30 min bei Raumtemperatur zugeführt.
14. Tragen Sie einen Abdecklip auf, um ihn zu gleiten und mit Nagellack zu versiegeln, um Trocknung und Bewegung zu verhindern. Dann bilden Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software. Berechnen Sie die relativen Änderungen mit dem Durchschnitt der DMSO-Kontrollproben. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Daten wie in Schritt 3.2.

Dieser Immunfluoreszenz-Assay ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Proteinexpressionsänderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen, die Umweltchemikalien ausgesetzt sind.

In dieser repräsentativen Analyse wurden Embryonen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des Antioxidans NAC pm_2,5 ausgesetzt waren, auf das Vorhandensein von Herzfehlbildungen untersucht (Abbildung 1). Wie beobachtet, verursachte EOM von PM_2,5 einen signifikanten Anstieg der kardialen Teratogenese, wie Perikardödem, veränderte Schleifen und verminderte Größe, im Vergleich zu DMSO-kontrollbehandelten Herzen. Die Herzschlagrate war auch bei Embryonen, die EOM ausgesetzt waren, signifikant verringert (Abbildung 1B). Die Zugabe von NAC dämpfte EOM-induzierte Herzfehler signifikant ab (Abbildung 1).

Hier wurde der Immunfluoreszenz-Assay verwendet, um die 8-OHdG- und γH2AX-Expression in Zebrafischembryonen zu messen, um das Ausmaß der DNA-Schädigung in EOM-behandelten Geweben zu bewerten. Wie in Abbildung 2gezeigt, waren die Spiegel der 8-OHdG- und γH2AX-Expression in den Herzen von Zebrafischembryonen, die mit der EOM-Gruppe behandelt wurden, im Vergleich zu den Kontrollherzen, DMSO-behandelten Herzen signifikant erhöht, was auf eine Zunahme oxidativer DNA-Schäden bzw. DNA-Doppelstrangbrüche hindeutet. Des Weiteren wurde der EOM-induzierten DNA-Schädigung teilweise durch NAC-Supplementierung entgegengewirkt (Abbildung 2).

Abbildung 1. Herzfehler von Zebrafischembryonen bei 72 HPF. (A) Bilder von Zebrafischembryonen mit 72 HPF. Gepunktete Linien zeigen Vorhöfe (rot) oder Ventrikel (blau) an. Maßstabsleiste, 200 μm. (B) Herzfehlbildungen und Herzschlagraten. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. In jeder Gruppe wurden mindestens 50 Embryonen untersucht. EOM: EOM bei 5 mg/L; NAC: NAC bei 0,25 μM. **,P < 0,01; , S<0.001 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen bei 72 HPF. A) Immunfluoreszenzfärbung. Maßstabsleiste, 100 μm. B) Quantitative Ergebnisse. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Mindestens 15 Herzen aus jeder Gruppe wurden untersucht. EOM: EOM bei 5 mg/L; NAC: NAC bei 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; S<0.001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Obwohl Zebrafische ein ausgezeichnetes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardialen Entwicklungstoxizität von Umweltchemikalien sind, ist es aufgrund der geringen Größe des Embryoherzes schwierig, genügend Protein für die Western-Blot-Analyse zu erhalten. Daher präsentieren wir eine empfindliche Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus von DNA-Schadensbiomarkern in den Herzen von Zebrafischembryonen, die PM_2,5ausgesetzt sind.

Während der Dissektion ist es wichtig, die Integrität des Herzens intakt zu halten. Unserer Erfahrung nach ist es relativ einfach, die Isolierung bei 72 PSF durchzuführen. Darüber hinaus muss das Herz so schnell wie möglich nach der Entnahme in eine Fixierungslösung gebracht werden. Ein weiterer kritischer Schritt ist das Trocknen der Proben, um sicherzustellen, dass die sezierten Herzen vollständig am Glasobjektträger befestigt sind. Andernfalls können die Proben während der Etikettierung vom Objektträger abgewaschen werden.

Eine duale Immunfluoreszenzfärbung wird durchgeführt, um sowohl 8-OHdG- als auch γH2AX-Signale in den isolierten Herzen zu erkennen. Diese Methode spart nicht nur Arbeit und ermöglicht die Verwendung einer reduzierten Stichprobengröße, sondern erleichtert auch die Co-Lokalisierung der beiden Signale. Obwohl diese antikörperbasierte Methode keine Fluoreszenzsignale in lebenden Embryonen nachweisen kann, kann dieses schnelle Protokoll verwendet werden, um die Proteinexpression in isolierten Zebrafisch-Embryoherzen nachzuweisen.

Es wurde häufig berichtet, dass oxidativer Stress PM_{2,5-induzierte}DNA-Schäden^{vermittelt 8,9}. Übermäßige ROS-Produktion kann zu DNA-Schäden und Apoptose während der Embryonalentwicklung von Zebrafischen führen^21,22,23. Wie wir bereits berichtet haben¹⁸, wird eine erhöhte 8-OHdG- und γH2AX-Signalexpression in den Herzen von Zebrafischembryonen beobachtet, die EOM ausgesetzt sind, deren Expression durch die Behandlung mit dem ROS-Fänger NAC signifikant entgegengewirkt wird. Es ist bemerkenswert, dass NAC die PM_{2,5-induzierte}DNA-Schadenssignalexpression nicht vollständig umkehrt, was darauf hindeutet, dass oxidativer Stress nur teilweise zu den DNA-Schäden beitragen kann, die in den Herzen von Zebrafischembryonen beobachtet werden, die PM_2,5ausgesetzt sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode eine empfindliche Technik zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten} DNA-Schäden in den intakten Herzen von Zebrafischembryonen verwendet. Darüber hinaus kann die Methode angewendet werden, um Veränderungen der Proteinexpression in den Herzen von Zebrafischembryonen nachzuweisen, die anderen Umweltchemikalien ausgesetzt sind.