Undersøgelse Cavitation Forbedret Terapi

Ultralyd (US) er blevet brugt bredt som en diagnostisk billeddannelse teknik på grund af sin sikre og ikke-invasive karakter, dens let gennemførelse på en patients seng, og dens omkostningseffektivitet¹. Ved siden af sin diagnostiske og overvågning kapaciteter, USA har et betydeligt potentiale for terapeutiske applikationer. Tidligt arbejde udforskede dets anvendelse i trombolyse, DNA-transfekt, og levering af lægemidler^2,3,4 og terapeutisk USA repræsenterer nu et meget aktivt forskningsområde med applikationer, herunder tumorbehandling^5,6,7,immunterapi^8,9, blod-hjerne-barriere (BBB) forstyrrelse^10,11,12, trombolyse^13,14,15og bakteriel infektionsbehandling^16,17. Et centralt fænomen, der understøtter disse applikationer, er kavitation: nukleation, vækst og svingning af gasformige hulrum på grund af ændringer i væsketryk^18,19.

Der er en række mekanismer, hvorved kavitation giver biologiske virkninger. For eksempel kan den meget ikke-lineære karakter af boble svingninger under påvirkning af en anvendt amerikansk felt generere microstreaming i den omgivende væske, der både kan forbedre stof konvektion²⁰ og udøve forskydning understreger på vævet i nærheden af boblerne. Dette er især udbredt, når bobler er i nærheden af en grænse, hvilket får bobler til at svinge ikke-sfærisk og potentielt kan fremme optagelse af lægemidler gennem forskydningsinduceret gennemtrængningsgennemtrængning^21,22,23,24. Ved højere tryk observeres større amplitude svingninger og hurtigt boblekollaps, der giver direkte mekanisk stress²⁵ og ofte genererer chokbølger og deraf følgende store trykgradienter, der kan forstyrre og gennemtrænge væv^26,27. Sammenbruddet af bobler nær en overflade kan også resultere i dannelsen af høj hastighed flydende mikrojets^28,29,30. Disse mikrojets kan trænge ind i væv, potentielt skabe porer eller fremkalde sekundære stressbølger^31,32. Gennemtrængning af biologiske membraner på både væv og cellulære niveauer kaldes skiftevis sonophoresis, der primært anvendes i forbindelse med amerikansk induceret forbedring i hudens permeabilitet^33,34og sonoporation, der hovedsagelig bruges til at beskrive den reversible gennemtrængning af cellemembranen på grund af dannelsen af membranporer^35,36.

Tyktflydende absorption i væsken umiddelbart omkring svingboblen kan give en betydelig varmeeffekt³⁷. Desuden producerer de meget ikke-lineære svingninger akustisk stråling ved frekvenser, der er højere end det drivende amerikanske felt. Dette fører til øget absorption i det omgivende væv og yderligere opvarmning³⁸. Boblekollaps kan også ledsages af kemiske virkninger på grund af de forbigående høje temperaturer og tryk i boblekernen, såsom generering af meget reaktive arter og elektromagnetisk stråling, kendt som sonoluminescens³². Disse virkninger er blevet undersøgt for at vurdere potentielle skader og/eller aktivering af relevante cellulære veje til levering³⁹ og udnyttet ved lokal aktivering af lysfølsomme lægemidler i en såkaldt sonodynamisk behandling^40,41,42,43.

Mange amerikansk medierede biovirkninger kan kun påbegyndes gennem kontrol af amerikanske feltparametre (trykforstærkning, frekvens, pulslængde og gentagelsesfrekvens og eksponeringsvarighed), men pålideligt genererer kavitation i biologisk væv kræver ofte høj inputenergi og indebærer derfor en forhøjet risiko for skade. Indførelse af eksogene eller kunstige kavitationskerner kan i væsentlig grad reducere den tilførselsenergi, der er nødvendig for at producere den brede vifte af virkninger, der er beskrevet ovenfor, og yderligere introducerer yderligere virkninger, som måske ikke er mulige med USA alene. Kavitationskerner omfatter gasbobler^26,44, flydende dråber^45,46,47 og faste partikler^48,49,50, hvor nanoskala kavitationskerner er et spirende undersøgelsesområde til deres fordele med hensyn til langvarig cirkulationstid, forbedret ekstravasation og langvarig kavitationsaktivitet^49,51,52,53.

De mest almindeligt anvendte kerner er gasmikrobobler (MB), der oprindeligt blev brugt som kontraststoffer i diagnostisk billeddannelse. De er typisk 1-2 mikrometer i diameter og indeholder en kerne af en højmolekylær-vægt gas med lav vandig opløselighed i det omgivende medium. Kernen er omgivet af en beskyttende lipid, protein eller polymerskal, der oftest består af fosforlipider⁵⁴. Når de udsættes for et amerikansk felt, får MBs kompressibilitet dem til at gennemgå volumetriske svingninger, hvilket giver stærk akustisk spredning, som er ansvarlig for MBs succes som kontrastmiddel. Som nævnt fører disse svingninger også til de førnævnte mekaniske, termiske og kemiske virkninger, der kan udnyttes i terapeutiske applikationer. MB-belægningsprocessen tilbyder også en mekanisme til indkapsling af lægemidler inden for MB-strukturen og til fastgørelse af lægemidler og/eller målretning af arter til MB-overfladen. Denne teknik letter den udløste frigivelse af lægemidler for at reducere systemisk^{toksicitet 55}. Det er også for nylig blevet påvist, at materiale fra MB-overfladen kan overføres til biologiske strukturer, hvilket forbedrer lægemiddellevering gennem såkaldt "sonoprinting"^56,57,58.

Overvågning af usa-medieret kavitationsaktivitet kan give indsigt i de resulterende biologiske virkninger både in vitro og in vivo og giver potentielt mulighed for tuning og optimering af disse virkninger. De to mest anvendte metoder til overvågning af kavitationsaktivitet er i) optisk, som anvender ultrahurtsbåndsvideomikroskopi og generelt ikke er mulige in vivo; og ii) akustiske, som registrerer de udstrålede lydfelter, der produceres af oscillerende og/eller kollapsende bobler. Både amplitud- og frekvenskomponenterne i det akustiske signal indeholder oplysninger om bobleadfærd. Lave koncentrationer af bobler ved lav hændelse amerikanske amplituder har vist sig at producere overvejende harmoniske emissioner (heltals multipla af kørefrekvensen)⁵⁹. Efterhånden som kørselspresset stiger, kan bobleemissionsspektret også indeholde fraktionerede komponenter kendt som subharmonics og ultraharmonics^60, der indikerer stærkere ikke-lineær adfærd samt bredbåndsstøj, hvilket er tegn på inertiel kavitation. Heltalsharmoniker er en primær indikator for boblesvingninger, men kan også være forårsaget af ikke-lineære forhold overalt i et forsøgssystem, f.eks. Derimod er fraktioneret harmoniske og bredbåndsstøj meget stærkt korreleret med bobledynamik.

Forholdet mellem bobleadfærd og de fundne akustiske emissioner kan kompliceres af faktorer, herunder hændelsen amerikanske felt, nukleationsmiljøet og egenskaberne ved detektionsvejen⁶⁰. Ikke desto mindre kan vigtige oplysninger om bobleadfærd og deres interaktioner med celler opnås ved at skelne tendenser i frekvens og energi i det akustiske spektrum. Disse data kan også give værdifulde oplysninger, der kan bruges til at danne grundlag for kliniske behandlingsovervågningsteknikker. For fuldt ud at udnytte disse oplysninger er det nødvendigt at udvikle robuste, omsættelige og reproducerbare forsøgsmetoder.

I øjeblikket er der betydelig variation i rapporterede protokoller for at designe systemer og gennemføre undersøgelser for at støtte udviklingen af kavitation-støttede behandlinger. Med hensyn til apparatet er der foretaget en række konstruktionsmetoder. Flere grupper har gjort brug af parallel-plade^{kamre 56,61,62,63}, enten specialbygget eller kommercielt tilgængelige (f.eks OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) udviklede et cellekammer kombineret med et amerikansk sonikeringsmodul og confocal imaging i realtid⁶⁴, Carugo et al. (2015) anvendte et system bestående af en kommercielt tilgængelig cellekulturskål med et skræddersyet PDMS-låg for at muliggøre dykning i et vandbad under amerikansk eksponering⁶⁵, og Pereno et al. (2018) brugte en enhed bestående af lagdelte acoustofluidic resonatorer, der giver mulighed for samtidig optisk og akustisk karakterisering af bobledynamik og boblecelleinteraktioner⁶⁶. Brugen af specialfremstillede og anvendelsesspecifikke design komplicerer karakteriseringen af det amerikanske felt og andre miljøeksponeringsforhold, hvilket gør krydsstudiesammenligninger udfordrende. For eksempel er der betydelig variation i de amerikanske parametre identificeret for at opnå en vellykket sonoporation, som omfatter centerfrekvenser fra 0,02 til 15 MHz, arbejdscyklusser varierende fra 1% til kontinuerlig bølge, og sjældnefactional tryk spænder fra 0,1 til 20 MPa^{23,64,67,68,69,70} ( Tabel1). Der er ligeledes betydelig variation i spektralkomponenterne (harmoniske komponenter, subharmonier osv.), som er blevet identificeret som værende forbundet med særlige biovirkninger.

Formålet med dette arbejde er derfor at skabe en let reproducerbar systemudformnings- og gennemførelsesramme for den in vitro-undersøgelse af kavitationsfremkaldte cellulære biovirkninger med specifik inddragelse af en kavitationsovervågningskapacitet.

1. Principper for systemdesign

BEMÆRK: Dette afsnit præsenterer de designprincipper, der bruges til at oprette systemer til overvågning af eksponering og kavitation i USA. Disse principper illustreres med to eksisterende systemer til akustisk transfekt (SAT) (vist i figur 1). Hvert system består af et celleeksponeringsrum, en amerikansk kilde og en enkelt elementtransducer, der fungerer som en passiv kavitationsdetektor (PCD), som alle er integreret i et bænkepladetestkammer. Disse design bygger på den tidligere systemudvikling, der er beskrevet i Carugo et al. (2015)⁶⁵.

1. Maksimer brugervenligheden.
   1. Gør celleeksponeringsrummet kompatibelt med eksisterende kulturteknikker og billeddannelsessystemer ved at bruge eksisterende kommercielle cellekulturenheder som seeding/vækstsubstrater.
      1. For SAT2 skal du bruge en kulturret (35 mm diameter, hvoraf et areal med en diameter på 21 mm kan observeres, se Materialeoversigt).
      2. For SAT3 skal du bruge en Transwell-indsats (6,5 mm diameter, se Materialetabel). Transwells har en gennemtrængelig membran og skal derfor placeres i cellemedier snarere end vand.
2. Muliggøre hurtig indlæsning og forsegling af celleeksponeringsrummet.
   1. Form SAT2 celleeksponeringsrummet ved at trykke på et fleksibelt polymerlåg over kulturretten (Carugo et al. 2015⁶⁵). Som det ses i figur 1C, har låget et par huller med en diameter på 1,2 mm, der gør det muligt at fylde rummet med en 18 G stump nålsprøjte. Efter påfyldning forsegles disse påfyldningsporte med korte plaststænger (Materialetabel).
   2. Fyld SAT3-rummet med sprøjte eller pipette og forsegl ved tryk, der monterer en gummiprop/bung.
   3. Muliggøre hurtig indlæsning af det forseglede celleeksponeringsrum i prøvekammeret. Holdere til celleeksponeringsrummene blev indbygget i kammerlågene, hvor en let tryktilpasning er tilstrækkelig til at sikre korrekt justering. Med de systemer, der er vist i figur 1, kan tiden for prøveændringer være så kort som 20 sekunder, når der på forhånd er forberedt flere celleeksponeringsrum.
   4. Minimer kammerets interne volumen, så systemet er bærbart, og mængden af påkrævet vand/medier kan minimeres. Dette fremskynder også genopretningen fra utilsigtede udslip eller lækager af kavitationsmidler ud af celleeksponeringsrummet.
      BEMÆRK: Den interne SAT2-diskenhed er ca. 0,8 L. Den SAT3 interne volumen er ca 7,6 L - gjort større for at imødekomme nem lastning og ændring af kildetransducer eller dens konfiguration. Der blev tilføjet et internt kammer på 0,3 L for at minimere det disponible volumen og for at tillade, at der anvendes biologisk relevante væsker, bortset fra tanken, fylder vand (f.eks. cellekulturmedier). Den indvendige kammerbund er lavet af 30 μm tykt mylarark for at tillade maksimal akustisk transmission.
   5. Gør kammeret og de indvendige komponenter ud af optisk klare materialer, når det er muligt, så eventuelle problemer (f.eks lækager, indspændte makrobobler) hurtigt kan observeres og afhjælpes.
3. Maksimer den akustiske transmissibility af eksponeringsrummet.
   1. Maksimer transmissibilitet gennem valg af rumvægmaterialer og tykkelser. Under forudsætning af, at væskerne på hver side af en væg stort set er de samme (f.eks. vand), er størrelsen af den normale forekomst trykoverførselskoefficient^71:
      , hvor λ er bølgelængden i væggen af tykkelse L, og z _L og z_o er de karakteristiske impedanser (produkter af henholdsvis massefylde og lydhastighed) for vægmaterialet og væsken. T = 1 angiver perfekt transmission.
   2. Til bredspektret overvågning af kavitation (f.eks. 1-8 MHz) vil de fleste laboratoriepolymerer (f.eks. PDMS, PTFE, polystyren) ændre det overførte tryk med højst 10%, hvis materialets tykkelse er mindre end 1/10^af en bølgelængde i materialet. Denne betingelse kan være vanskelig at opfylde med standardforsyninger ved høje frekvenser (f.eks. #1,5 coverslip ved 8 MHz), så det er god praksis at forudsige eller direkte kalibrere transmissionsfrekvensresponsen.
   3. For smalbåndstransmission af det amerikanske kildesignal ind i celleeksponeringsrummet skal der tillades et tykkere lag, hvis det er ca. et heltal multiplum af en halv bølgelængde i lagmaterialet. PDMS-låget i SAT2 bruges f.eks.
4. Maksimer eksponeringsområdet ved at vælge kilde- og cellemiljø.
   1. For at maksimere antallet af eksponerede celler skal du gøre området med celletilbehør så bredt som muligt, samtidig med at kompatibiliteten med tilgængeligt dyrknings- og billedbehandlingsudstyr bevares.
   2. Brug en amerikansk kilde med et felt, der spænder over cellevedhæftningsområdet med minimal rumlig variation ved hjælp af det præ-focal-område af en stor fokuseret kilde (SAT2) eller en fokuseret eller linsekilde med en hovedflippbredde, der matcher diameteren af cellevedhæftningsområdet (SAT3). Se materialeoversigten for specifikke kilder.
   3. Minimer den feltkompleksitet, der introduceres af cellerumsholderen, ved mekanisk at støtte cellerummet langt væk fra den stærkeste del af hændelsesfeltet, minimere holderens sprednings tværsnit eller placere absorberende materiale på holderen. Eksempler er vist i figur 1A og 1D.
5. Sørg for gentagne eksponeringsforhold.
   1. Afslut det akustiske felt i en fast grænse for at eliminere variabilitet, der kan opstå fra luft-vand-grænseflader i delvist fyldte kamre. I SAT2 og 3 opnås dette ved at installere en akustisk absorber (se Materialetabel) på kammerlåget med en yderligere fordel at reducere den feltkompleksitet, der kan opstå som følge af grænserefleksioner.
   2. Overvåg og registrer kildedrevspændingen ved forstærkerens udgangs-/kildeindgang, så der hurtigt kan registreres mindre variabilitet eller større fejl. Brug en spændingssonde eller anden enhed, der er sikker at bruge over drevet spændingsområde af interesse. Kontroller regelmæssigt kalibreringen af spændingssonden ved hjælp af en velkendt kilde som f.eks.
   3. Kontroller, overvåg og registrer kammerets temperatur og dets indhold. Reaktionerne fra celler, transducere og formeringsmedium kan alle være temperaturfølsomme. I SAT2 udføres overvågning og kontrol med et par cirkulationsporte, der er tilsluttet et vandkonditioneringssystem, mens SAT3 anvender en akvarievarmer (ikke vist). Indstil vandtemperaturen efter behov for at efterligne de relevante fysiologiske forhold for den terapeutiske anvendelse.
      BEMÆRK: De interne temperaturer kan ændre sig både som følge af eksterne faktorer og som følge af den amerikansk genererede opvarmning af transduceren og mediet.
   4. Afgas kammervæsken/-væskerne forsigtigt for at minimere sandsynligheden for utilsigtet kavitation og/eller spredning fra allerede eksisterende bobler i formeringsstien.
      BEMÆRK: Hvis afgasning ikke udføres, f.eks. på grund af den negative indvirkning på cellerne, vil der være et forbedret baggrundsniveau for bobleaktivitet, som er passende.
6. Kalibrere det fuldt samlede system.
   1. Medtag et middel til måling af trykfelthændelsen på de eksponerede celler, når alle systemkomponenter er på plads, herunder celleeksponeringsrummet. I SAT2 og 3 opnås dette med en åbning i kammerlåget, hvorigennem en nål eller fiberoptisk hydrofon kan indsættes uden at forstyrre det felt, der skal måles. Gør målingerne så tæt som muligt på, hvor cellerne er placeret.
   2. Vælg en hydrofon med en følsom radius (en_rcv) er lille nok til, at den ikke vil fejlrapportere det trykfelt, der måles. Den acceptable størrelse er en funktion af kildefrekvens (f) og radius (en_src) samt afstanden mellem kilden og feltscanningen (z_rcv). Et generelt kriterium for valg af hydrofonstørrelse er: , hvilket fører til: , hvor c er lydhastigheden⁷².
   3. Sørg for, at hydrofonen kalibreres under de forhold, der anvendes i systemkarakterisering, herunder temperaturen som angivet i punkt 1.6. Hvis hydrofonen holdes i en vinkel med hensyn til scanningsplanet, skal hydrofonen kalibreres i denne vinkel, da direkte virkning kan afvige betydeligt fra dem, der forventes udelukkende baseret på geometri. Ændringen i hydrofonfølsomheden med hensyn til temperatur bør være tilgængelig fra producenten.
   4. Scan hele det område, hvor celler kan blive eksponeret. Hvis du vil registrere et passende feltdetaljer, skal du bruge en scanningsafstand, der ikke er grovere end 1/5^af en bølgelængde med den højeste frekvens af interesse. Hvis der observeres uventet feltkompleksitet, kan du overveje at bruge korte burstsignaler (f.eks. 1-3 cyklusser) for at muliggøre identifikation og kvantificering af direkte og spredte feltbidrag.
7. Indarbejd en kapacitet til overvågning af kavitation.
   1. Bestem overvågning transducer type og placering som en del af udformningen af det samlede system, snarere end som en eftermontering. I praksis fører dette til et system, der er maksimalt kompakt uden at gå på kompromis med evnen til pålideligt at justere de kritiske systemkomponenter.
   2. Placer en kavitationsovervågningsanordning i systemet på en sådan måde, at den kan placeres gentagne gange med minimal ekstra opstillingstid eller forstyrrelse af arbejdsgangen. I SAT2 opnås dette med et enkelt element piezoelektrisk transducer, der fungerer som pcd monteret i kammerlåget, mens SAT3 integrerer PCD i kildebasen ved hjælp af en 90 ° reflektor.
   3. Vælg PCD-figuren i overensstemmelse med forsøgenes mål. I figur 2viser beregninger af halvforstærkelseskonturerne af ufokuserede (venstre) og fokuserede (højre) enheder de dybe forskelle i rumlig følsomhed med hensyn til frekvens. Den ufokuserede enhed er bedre egnet til overvågning af store mængder med beskeden rumlig variation med hensyn til frekvens, mens den fokuserede enhed er bedre egnet til mere radialt kompakte målinger ved de frekvenser, der er af interesse.
   4. Vælg PCD-centerfrekvensen og båndbredden, så den passer til eksperimentets behov. Centerfrekvensen vælges typisk til at være mindst fem gange så høj som den amerikanske kildes for at minimere følsomheden over for direkte kildeemissioner. Båndbredden maksimeres typisk for at observere en bred vifte af bobleadfærd (harmonisk og bredbåndsstøj).
   5. Vælg konditionerings-, registrerings- og behandlingsmetoder, der gør det muligt at analysere kavitationsdata som beskrevet i næste afsnit.

2. Instrumentering og behandling af overvågning af kavitation

BEMÆRK: Dette afsnit præsenterer de signalflowkomponenter og -funktioner, der anbefales til indsamling af kavitationsovervågningsdata, og den databehandling, der fører til kvalitative og kvantitative vurderinger af kavitationsaktivitet.

1. Instrumentering (se også figur 3).
   1. Medmindre applikationen kræver en tilpasset enhed, skal du vælge et PCD fra den brede vifte af kommercielt tilgængelige enkeltelementtransducere, der typisk markedsføres til ikke-destruktiv test af neddykkede mål. Disse leverandører har også kabler og tilbehør (f.eks. spejlreflektoren i SAT3).
   2. Minimer PCD-svar på den amerikanske kilde. Dette kan gøres både gennem valg af PCD (centerfrekvens og båndbredde) og ved hjælp af et hak eller et højpasfilter. Sidstnævnte kan implementeres enten som et enkeltstående modul eller som en del af en signalkonditioneringsenhed.
   3. Brug en digitaliseringsenhed med et stort dynamisk område (mindst 12 bit) til at opfange så mange data som muligt med minimal sandsynlighed for høj signalklip og maksimalt signal til støjforhold (SNR) af de mindste signaler. Når du sammenligner enheder, skal du gennemgå specifikationerne for signal til støj og forvrængning og/eller effektivt antal bit, da disse er mere komplette beskrivelser af opnåeligt dynamisk område. Overvej også, om størrelsen på hukommelsesbufferen er tilstrækkelig til den ønskede længde og hastighed for datahentning.
   4. Optimere brugen af digitalisatorens dynamiske område. PCD-signaler kan dække flere størrelsesordener, både på grund af en lang eksponering (som bobler elimineres), og hvis du kører eksperimenter på forskellige amerikanske drev niveauer. Det er derfor nødvendigt at kontrollere, at signalkonditioneringskæden skalerer alle signaler, så de kan registreres korrekt.
   5. Medtag en forforstærker i signalkæden, så de mindste forventede signaler kan opfanges på passende vis. Det er vores erfaring, pcd selvstøj er et godt stykke under de fleste digitizers, så en beskeden grad af forforstærkning (f.eks <100x) kan stadig forbedre SNR af det endelige resultat.
   6. Filtrer den amerikanske kildefrekvens før forforstærkning for at undgå mætning af forstærkeren.
   7. Hvis en amerikansk puls/modtager bruges til at give forstærknings- og/eller filtreringsfunktioner, skal du bruge den i pulstilstand til at bekræfte stiens længde/justering eller kontrollere, om der er uventede spredere i overførselsstien mellem PCD'et og celleeksponeringsrummet.
   8. Aktiver streaming i realtid af data til opbevaring. SAT2- og SAT3-systemerne anvender begge 12-bit streaming USB-oscilloskoper (se Materialetabel),som har bekvemmelighederne ved bærbarhed og velbyggede brugergrænseflader.
   9. Bekræft korrekt impedansmatchning i signalkæden for at undgå forstærknings- eller båndbreddefejl. PCD-enheder har typisk output impedanser nær 50 ohm, så en passende proces er at erstatte PCD med et kendt signal fra en bølgeform generator (med 50 ohm output impedans) og bekræfte, at signalstørrelsen vises på digitalisator matcher forventningerne, skalaer lineært, når det injicerede signal er ændret, og ingen klipning observeres for det største signal af interesse.
2. Forbehandling
   1. Ret de rå spændingssignaler for alle kendte gevinster og følsomheder i signalvejen, der vedrører behandling af data i det frekvensområde, der er af interesse.
   2. Hvis dataene blev registreret med DC-inputkobling eller på anden måde viser en DC-forskydning, skal du fjerne denne forskydning ved direkte subtraktion eller med et højpasfilter.
3. Beregn effektspektret P for hvert optaget signal.
   1. Indstil Fourier transformeringslængdeN _ft, så den grundlæggende frekvens for den amerikanske kilde f₀ er et stort heltal multiplum af transformeringsplaceringsbredden: N_ft =   nf_s/f₀, hvor n er et heltal, og f_s er eksempelfrekvensen for de digitaliserede data. Sæt n ≥ 50 for klar indfangning af spektrale træk. For eksemplet med en 1 MHz grundlæggende stikprøven ved 50 MHz, N_ft er 2500 og bin bredde er 0,02 MHz.
   2. Da transformeringslængden N_ft normalt er mindre end varigheden af det registrerede signal, skal du bruge en effektspektraltæthed (PSD) estimator som Welchs metode⁷³. Effekt i et frekvensbånd, der strækker sig fra f₁-f_2, er , hvor dF er transformeringsplaceringsbredden.
   3. For at karakterisere bobleaktivitet under hver eksponering skal du estimere bidragene til effektspektret fra heltals-multipla af f₀ (harmoniske), ulige heltals multipla af f₀/2 (ultraharmonics) og bredbåndsstøj (inertial kavitation).
   4. Harmonisk og ultraharmonisk indhold estimeres mest ved at vælge effektspektrumværdierne ved bestemte frekvenser. Store amplitude-toneresponser kan dog sprede sig til et lille antal tilstødende frekvensbeholdere (f0 ± 2-3), så disse bør indgå i beregningerne af smalbåndseffekten og udelukkes fra bredbåndsberegningerne.
   5. Anslå bredbåndsbåndskavitationskraft ved at subtraktion af de harmoniske og ultraharmoniske bidrag fra det samlede effektspektrum. Alternativt kan disse bidrag anslås ved hjælp af mere sofistikeret forbehandling⁷⁴.
   6. Anslå den kumulative kavitationssignalenergi over eksponeringens varighed, helst i henhold til frekvensfunktion / bobleaktivitetstype.
   7. Hvis det antages, at alle dataposter havde samme varighed T_r, er den akkumulerede energi i de registrerede data , hvor M angiver antallet af poster.
   8. Hvis der er huller mellem optagelserne, som det kan ske, når eksponeringen er kontinuerlig, og de gemte filer fanger en brøkdel af den samlede eksponeringstid T_e, kan den kumulative energi anslås som
   9. Estimer målingen SNR ved sammenligning af frekvensniveauer med niveauet for baggrundsstøj registreret i mangel af AMERIKANSK.

3. Eksperimentel protokol

1. SAT Forberedelse
   1. Minimer sandsynligheden for kavitation i formeringsvejen ved at afgasning af fyldvæsken (typisk filtreret vand) under et tryk på -10⁵ Pa i mindst to timer. Bekræftelse med en opløst iltsonde af, at det delvise ilttryk er under 10 kPa, anbefales.
   2. Fyld testkammeret langsomt for at minimere genindføring af luft i den afgassede væske. Fortsæt med at afgase det fyldte kammer, hvis det er nødvendigt.
   3. Ryd alle resterende bobler fra transducer- og mediebeholderoverfladerne umiddelbart efter påfyldning og igen lige før eksponeringseksperimenter påbegyndes.
   4. Sørg for, at kammerets temperatur og indhold er stabiliseret, inden eksponeringseksperimenter påbegyndes.
   5. Lad den amerikanske udgangsforstærker varme op (pr. producentanbefaling), så forstærkningen og udgangen er stabil med hensyn til tid.
2. Forberedelse af eksponeringsrum
   1. Suspension af kavitationsmiddel
      1. Ved fortynding af kavitationsmidlet omrøres forsigtigt og kontinuerligt for at foretage en ensartet suspension uden at fange makrobubbles eller ødelægge midlet (især hvis de er afskallede bobler).
      2. Når du arbejder med MB'er, skal du trække og dispensere langsomt ved hjælp af den største målernål, der er tilgængelig for at minimere ødelæggelsen under lasteprocessen⁷⁵. En 18 G stump fyldnål er blevet brugt regelmæssigt med SAT-systemerne.
3. SAT2 Forberedelse
   1. Steriliser PDMS-låget før brug i eksperimenter med levende celler.
   2. Form celleeksponeringsrummet ved at trykke på PDMS-låget på kulturretten.
   3. Forbered en sprøjte med en 18 G stump nål og fyld med ca. 10 mL væske (f.eks. MB suspension eller vandkontrol).
   4. Sæt nålen gennem et af PDMS-fyldhullerne, og fyld langsomt kammeret, og vip, så makrobubbles kan slippe gennem det åbne fyldhul. For at opnå de bedste resultater skal du vippe kammeret, så det åbne hul er over fyldhullet.
   5. Når det er fyldt, skal du lukke det åbne hul ved at indsætte en kort (4-5 mm) polymerstang. Indstil samlingen, så begge huller er vandrette.
   6. Fjern den stumpe påfyldningsnål, mens du injicerer ekstra væske, så der ikke trækkes luft ind. Luk hullet med en anden polymer stang. Denne proces fuldender forseglingen af celleeksponeringsrummet.
   7. Kontroller visuelt rummet for tegn på indspændte makrobobler, og gentag 3.3.3.-3.3.6, hvis der findes nogen.
   8. Tryk på celleeksponeringsrummet i rumholderen. Sæt kammerlåget på plads på toppen af kammeret. Sænkning af låget med en vinkel til vandret afskrækker makrobubbles fra at hvile på de nedsænkede dele (absorber, holder).
   9. Overvej opdriften af partiklerne i suspension, når du beslutter retningen af celleeksponeringsrummet (f.eks. flydende bobler eller synkende nanopartikler), og hvordan dette vil påvirke deres kontakt med celler.
   10. I alle operationer skal du bruge så lidt kraft som muligt for at minimere flexure af cellevækstoverfladen og løsrivelse af celler.
4. SAT3 Forberedelse
   1. Transwell fyldes med ca. 150 μL væske (f.eks. MB-affjedring eller vandkontrol).
   2. Form celleeksponeringsrummet ved omhyggeligt at forsegle transwellen med et gummistik, fjerne enhver overløbsvæske med et rent køkkenrulle eller tørre. Før brug i eksperimenter med levende celler, sterilisere gummiproppen.
   3. Kontroller visuelt rummet for tegn på indspændte makrobubbles, og hvis der findes nogen, skal du fjerne stikket, fjerne makroboblerne og gentage 4.4.2.
   4. Tryk på celleeksponeringsrummet i rumholderen. Sæt kammerlåget på plads på toppen af kammeret. Sænkning af låget med en vinkel til vandret afskrækker makrobubbles fra at hvile på de nedsænkede dele (absorber, holder).
      BEMÆRK: Som nævnt ovenfor kan makrobobler forårsage en række ikke-repeterbare og potentielt skadelige virkninger på amerikanske eksponeringseksperimenter. Mest kritisk kan makrobobler, der er fanget i celleeksponeringsrummet, forårsage PCD-reaktioner og lokale cellulære biovirkninger, der ikke er repræsentative for den tilsigtede behandling. Undersøg altid visuelt alle systemkomponenter for at finde og fjerne makrobobler, før du starter amerikanske eksperimenter.

4. Dataindsamling

1. Fastlæg pcd-responsniveauer i baggrunden ved at udføre indledende forsøg med et celleeksponeringsrum fyldt med kontrolvæske (f.eks. afgasset vand eller cellemedier).
2. Optag PCD-data uden at køre den amerikanske kilde til at etablere baggrund elektroniske støjniveauer.
3. Optag PCD-data, mens du kører den amerikanske kilde på hele spektret af planlagte drevniveauer. Disse data angiver, hvilke dele af den akustiske respons der ikke er relateret til de kavitationsstoffer, der skal testes efterfølgende.
   BEMÆRK: Almindelige laboratorievæsker (f.eks. PBS eller cellemedier) vil udvise kavitation ved moderat tryk (f.eks. 0,5 MPa ved 0,5 MHz), hvis de ikke afgasses.
4. Før målinger påbegyndes, skal affjedringen tid til termisk ekvilibrering med kammertemperaturen. En fin nål termoelement kan være nyttigt til dette formål.
5. Overvåg eksperimenterne i realtid i både tids- og frekvensdomæner.
   1. Overvågning af pcd'ens tidsdomæne afslører, om signalerne er tilpasset de aktuelle instrumenteringsindstillinger. Specifikt skal signalklip undgås, da det vises i frekvensdomænet som multi-tone harmonisk respons.
   2. Overvågning af pcd'ens tidsdomæne viser også, om kavitationssignaler ses tidligere end forventet baseret på overførselstid fra den amerikanske kilde til eksponeringsrummet for PCD. Hvis sådanne signaler ses, kan dette indikere lækage af kavitationsmidlet ind i testkammeret.
   3. Overvågning af frekvensdomænet for PCD'et angiver typen af bobleadfærd og kan bruges til at justere drevniveauerne efter behov for at opnå den ønskede cellestimulans (f.eks. lavere drevniveauer til harmonisk excitation).
6. For at sikre, at de første eksponeringer ikke går glip af, skal du starte dataindsamlingsprocessen, før du tænder for det amerikanske kildedrevsignal.
7. Overvåg forstærkerudgangssignalet, der driver den amerikanske kilde (i modsætning til bølgeformgeneratoroutputtet) under hele eksperimentet for at sikre, at eksponeringen fortsætter som forventet. Brug en højspændingssonde til denne måling, og sørg for, at oscilloskopet er indstillet til at kompensere for sondedæmpning.
8. Når du har eksponeret en prøve, skal du forsigtigt fjerne den fra testkammeret.
   1. Fjern og rengør PDMS-låget (SAT2)/gummiprop (SAT3) som forberedelse til eventuel efterfølgende brug.
   2. Overfør kulturretten (SAT2)/Transwell (SAT3) efter behov til efterfølgende analyse (f.eks. mikroskopi, fluorescensbilleddannelse).
   3. Efter et lille antal eksponeringer (f.eks. 3-5) er det god praksis at generhverve baseline cavitation signaler (i mangel af kavitationsmiddel) og sammenligne med det oprindelige datasæt for at sikre, at kammermedierne ikke er blevet forurenet.

Figur 4 viser eksempler på pcd-svar for tids- og frekvensdomæne, hvilket illustrerer tre forskellige kavitationsadfærd. Alle data blev indsamlet på SAT3 ved hjælp af SonoVue MBs fortyndet 5x i PBS, med en endelig koncentration på ~ 2 * 10⁷ MB / ml. Temperaturen for alle eksempler i dette afsnit var 19 ± 1 °C. Den amerikanske kilde blev drevet med en 2,0 ms puls ved 0,5 MHz for at opnå et faldstop negativt tryk på 0,20 (Figur 4A og 4B), 0,30 (Figur 4C og 4D) og 0,70 MPa (Figur 4E og 4F). Signaloptagelserne begyndte 1,4 ms før t = 0 starten af den amerikanske puls. De indsat spor viser signalet som registreret (rød) og med en 2 MHz høj pass filter (blå) for et tidsvindue centreret på tidspunktet for flyvningen fra kilde til celle eksponering rum til PCD. Den lave respons før dette tidspunkt skyldes direkte modtaget stråling fra kilden, hvilket er almindeligt i konfigurationer, hvor PCD'et er bag den amerikanske kilde.

Ved det laveste hændelsestryk består PCD-responsen udelukkende af heltalsharmoniker af 0,5 MHz grundlæggende amerikanske frekvens. Stigende fra 0,20 til 0,30 MPa resulterer i udtalt ultraharmonics i spektret ud over yderligere forhøjet heltal harmoniske. Den tid domæne bølgeformer på disse to tryk ser ens ud, selv om 0,30 MPa resultater viser mere variation over pulsen varighed. Ved det højeste tryk er tidsdomænets bølgeforme amplitude vokset ulineært i forhold til det lavere tryk som følge af klart forhøjet bredbåndsstøj, der er synlig i spektret. Denne støj anses almindeligvis for at være et resultat af inertiel kavitation og svarer i dette eksempel til ødelæggelse af MB' er.

Hvis du vil se dette tydeligere, vises PCD-svar som en funktion af tiden i figur 5. I venstre panel (Figur 5A) vises fuld spektre over en 50 sekunders eksponeringstid, hvor kilden udsendte 2,0 ms pulser hvert 0,20 sekund. Tilsvarende samlede, harmoniske og bredbåndskræfter vises i højre panel (Figur 5B). USA blev tændt på t = 3 ,0 s, på hvilket tidspunkt store amplitude bredbånd svar blev set. Den oprindelige spike menes at svare til ødelæggelsen af de største bobler i suspensionen (SonoVue er polydisperse) og er en almindelig observation i kavitationseksperimenter med afskallede bobler og endda med ikke-afgassede medier (f.eks PBS).

Efter et par sekunder faldt bredbåndsresponsen hurtigt, tilsyneladende på grund af bobledestruktion, og signalet består overvejende af harmoniske. Dette tyder på, at den frigjorte gas og de resterende MB vibrerer stabilt og ikke-inertially. Ved 50'erne er bredbåndskomponenten faldet til niveauet for den oprindelige baggrundsstøj. Eksponeringstest som denne er derfor vigtige, når man forsøger at forstå de tidsskalaer, hvor forskellige bobleeffekter kan virke på cellerne i kammeret.

Bobler vil sandsynligvis oversætte som reaktion på strålingskræfter genereret under amerikansk eksponering og bevægelse af MB ind og ud af PCD synsfeltet kan føre til øget variation i det overvågede kavitationssignal, især når der beskæftiger sig med fortyndede suspensioner. Pcd'ens følsomme område bør derfor strække sig over så meget af celleeksponeringsoverfladen som muligt. En sammenligning af de fokuserede og ufokuserede pct. med identiske centerfrekvenser (se figur 2) er vist i figur 6, hvor der foretages en 20:1-fortynding af MB i normal PBS SAT2. Tids- og stikprøvegennemsnittet i panelet Figur 6A viser, at det ufokuserede PCD indeholder en stærkere bredbåndsrespons ledsaget af reduceret variation fra stikprøve til stikprøve i både harmoniske (figur 6B) og ultraharmoniske kræfter (figur 6C).

Det er vigtigt at erkende, at medier, der anvendes til in vitro-cellearbejde, ikke afgasses og kan udgøre et forbedret baggrundsniveau for bobleaktivitet. Figur 7 viser reaktionen i SAT2 på PBS, der anvendes i leverandørformen, og efter to timers afgasning under vakuum, hvorefter luftmætningen blev reduceret fra 92 % til 46 % som bestemt med en optisk sensor (PreSens, Tyskland). Spektre i figur 7A blev i gennemsnit over eksponeringstid og gentagelser med fem uafhængige prøver, og viser tydeligt tydeligt forhøjede ultraharmonikere i normal PBS. Beføjelser, der lægges sammen over tre harmoniske(figur 7B),ligger et godt stykke inden for standardafvigelsen for hver forsøgsproduktion. I modsætning hertil viser de ultraharmoniske beløb i figur 7C, at normal PBS har næsten en størrelsesorden højere niveau og væsentligt højere variation mellem prøverne. Disse eksempler angiver, at et almindeligt cellekompatibelt medie kan udvise funktionsmåder, der (fejlagtigt) kan tilskrives tilstedeværelsen af MB'er. Da det normalt er upraktisk at degaskulturmediet på grund af den negative indvirkning på celler og/eller kavitationsstabilitet, er det afgørende at udføre passende kontroller i enhver kavitationsrelateret undersøgelse.

Figur 1: Illustrationer af to amerikanske eksponeringssystemdesign, der omfatter kavitationsovervågning: SAT3 (D-F). (A) SAT2 kommenteret samling med sidevæg fjernet for klarhed. (B)SAT2 med sidevæg intakt. (C) SAT2 celleeksponeringsrum, adskilt. (D) SAT3 kommenteret samling. (E) SAT3 i normale (venstre) og linsede (højre) konfigurationer for strålebredde, der matcher ved forskellige frekvenser. (F) SAT3 celleeksponeringsrum, adskilt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Beregninger af halv amplitudetryksfeltkonturer for 12,7 mm diameter ufokuseret (venstre) og sfærisk fokuserede (højre) transducere. Frekvenser på henholdsvis 2, 4 og 8 MHz vises som henholdsvis røde, blå og grønne konturer for et PCD-element ved koordinatens oprindelse (0,0). Den ufokuserede enheds yderste konturer er relativt ufølsomme over for frekvens, men den indvendige struktur er frekvensafhængig. De sfærisk fokuserede feltkontrakter, efterhånden som frekvensen øges, men inde i konturerne varierer felterne jævnt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Instrumentering til kavitationssignalkonditionering og -registrering (blå pile), amerikansk kildeledning (røde linjer) og udløsning af dataindsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Tid (venstre) og frekvens (højre) domæne PCD svar registreret med MB fortyndet 5x i PBS. Hændelse peak negative tryk var (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, alle på 0,5 MHz. Signal optagelser begynder 1,4 ms før t = 0 starten af 2,0 ms varighed ultralyd puls. (A, C, E) Tidsdomænesignaler (rød) vises på en fast lodret skala, der angiver, hvordan responsniveauet ændrer sig med hændelsestryk. De indsat spor viser signalet som registreret (rød) og med en 2 MHz høj pass filter (blå) for et tidsvindue centreret på tidspunktet for flyvningen fra kilde til celle eksponering rum til PCD. (B, D, F) Støj- og signaleffektspektrale tætheder beregnes for henholdsvis t<0 og t>0. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Frekvenshistorik over 50 sekunders eksponering af en suspension af MB fortyndet 5x i PBS. (A) Fuld spektre og (B) samlede, harmoniske og bredbåndssignal beføjelser, alle som en funktion af tid. Drev betingelser var 0,5 MHz, 0,7 MPa peak undertryk, 2,0 ms puls varighed, 200 ms puls gentagelse periode. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Effekt af PCD-fokuseringsgeometri registreret med en 20:1-fortynding af mikrobobler i normal PBS. Kørselsforhold var: 1,0 MHz, 0,50 MPa peak undertryk, 3,0 ms puls varighed, 10 ms puls gentagelse periode. (A) Fuld spektre gennemsnit over eksponeringstid og tre uafhængige prøve gentager. (B) Effekt i 3, 4 og 5 MHz harmoniske, og (C) magt i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonics. Tykke linjer er prøvemidler, skyggeområder angiver +/- 1 standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Effekt af afgassede medier optaget med PBS. (a)Fuld spektre gennemsnit over eksponeringstid og fem uafhængige prøve gentagelser. (B) Effekt i 3, 4 og 5 MHz harmoniske, og (C) magt i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonics. Tykke linjer er prøvemidler, skyggeområder angiver +/- 1 standardafvigelse. Drev betingelser var 1,0 MHz, 0,50 MPa peak undertryk, 1,0 ms puls varighed, 200 ms puls gentagelse periode. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Resumé af rækken af rapporterede parametre, der letter sonoporation in vitro.

De kritiske skridt for enhver akustisk måling blev indkapslet af Apfel i 1981⁷⁶ som "kend din væske, kend dit lydfelt, ved, hvornår der sker noget." I forbindelse med denne protokol omfatter disse transducerkalibrering og -justering samt vandforberedelses- og boblehåndteringstrinnene. For det første er det vigtigt, at den hydrofon, der anvendes til kalibrering af den drivende transducer og/eller PCD, selv er nøjagtigt kalibreret gennem regelmæssig ekstern service eller intern sammenligning med en referencestandard. På samme måde skal reaktionen fra både køretransduceren og PCD regelmæssigt karakteriseres for at kontrollere, om der er ændringer i outputtet og/eller tab af følsomhed. Hvis systemets kørselsforhold og modtage følsomhed er ukendte, vil det være umuligt at udlede nogen meningsfuld sammenhæng mellem eksponeringsforhold, biovirkninger og akustiske emissioner. Direkte i denne forbindelse skal transducernes tilpasning til hinanden og prøvekammeret kontrolleres nøje for at sikre, at eksponeringsbetingelserne i kammeret er som forventet, og at prøvetagningsvolumen for pcd'et svarer til det pågældende område. Som nævnt kan temperatur- og gasindholdet i ophængningsmediet påvirke de endelige resultater betydeligt, og konsistens er yderst vigtig i denne henseende^77,78. På samme måde kræver præparatet, karakteriseringen og håndteringen af suspensionen af kavitationsmidlet meget nøje opmærksomhed for at sikre, at den forventede størrelsesfordeling og koncentration af partikler er til stede i prøven. For eksempel, hvis koncentrationen af bobler er for høj, vil der være effektiv afskærmning af prøvevolumen fra hændelsen amerikanske felt. MB-agenser er særligt modtagelige for ødelæggelse og sammensmeltning, og yderligere vejledning om håndteringen af dem findes i Mulvana et. al. (2012)⁷⁹.

Et meget almindeligt problem med påvisning af kavitationssignaler er at opnå en passende SNR. Dette skyldes til dels selve signalets art, som beskrevet, men kan også skyldes kilder til elektrisk støj inden for forsøgsopsætningen. Kontrol af forbindelserne mellem systemkomponenter, især dem, der involverer koaksialkabler, kan bidrage til at fjerne nogle af disse. Udskiftning eller reparation af koaksialkabler kan være nødvendig. Identifikation og fjernelse eller deaktivering af andet udstyr i laboratoriet, såsom pumper, der kan forårsage elektrisk støj, kan også hjælpe. Dårlig elektrisk impedansmatchning mellem systemkomponenter kan være en yderligere årsag til dårligt signal til støjforhold og også potentielt skade på udstyr og bør kontrolleres omhyggeligt. De udløsende indstillinger på signalgeneratoren og oscilloskopet bør ligeledes kontrolleres for at bekræfte, at de er konfigureret korrekt til eksperimentet og ikke er vendt tilbage til producentens standardindstillinger. Hvis der er betydelig ødelæggelse af bobler under håndtering, i tilfælde af SAT2, kan det være nyttigt at fastgøre en anden sprøjte til udløbsporten og bruge dette til forsigtigt at udtrække væske fra kammeret og derved trække i suspensionen. Dette kan også hjælpe med at eliminere makrobobler eller aktivere flow under amerikansk eksponering, hvis det ønskes.

Det er ikke muligt helt at eliminere akustiske refleksioner i prøvekammeret, og derfor vil hændelsesfeltet ikke være helt ensartet over hele prøvevolumenet. Som nævnt i trin 1.3.2 og 1.3.3 vil muligheden for at overføre akustiske vinduer være frekvensafhængig, og den ønskede båndbredde til akustiske emissionsmålinger bør derfor overvejes nøje. Der kan især være betydelige flere refleksioner af højere frekvenskomponenter. Dette er en anden grund til, at kalibrering af feltet i det fuldt samlede system er så vigtig for at minimere usikkerheden i hændelsestrykket. Passende gating af de registrerede signaler bør også overvejes for at minimere virkningerne af flere refleksioner. Brugen af kommercielle anordninger for nemheds skyld og behovet for akustisk gennemsigtighed betyder, at en vis optisk gennemsigtighed skal ofres. Dette kan påvirke kvaliteten af efterfølgende billeddannelse, f.eks. Nogle af de membraner, der anvendes i kommercielle enheder, er også porøse, og der opstår således ufuldkommen isolation mellem prøvekammeret og det omgivende vandbad. Som ovenfor kan den tilsvarende risiko for kontaminering mindskes ved hjælp af et mindre underkammer, hvis indhold regelmæssigt kan udskiftes. De cellekulturanordninger, der er angivet i materialetabellen, er primært egnet til cellemonomer, der muligvis ikke er repræsentative for væv, hvad angår alle amerikanske/kavitationsmedierede biovirkninger. Cellernes nærhed til en fast overflade vil også påvirke MB-dynamikken på en måde, der måske ikke afspejler forholdene in vivo, f.eks. Disse begrænsninger kan imidlertid afhjælpes ved blot at erstatte alternative vævsmodeller.

Formålet med at foreslå SATs er at tilvejebringe et middel til at forbedre reproducerbarheden af akustiske eksponeringsforhold og akustiske emissioner mellem undersøgelser af amerikansk medierede biovirkninger, hvilket forhåbentlig vil lette en bedre forståelse af de underliggende mekanismer og udviklingen af behandlingsovervågningsteknikker for at forbedre sikkerheden og effektiviteten. Systemerne er designet til at være kompatible med kommercielt tilgængelige cellekulturudstyr, hvilket gør det muligt at udføre en bred vifte af biologiske assays i henhold til anvendelse af interesse og muliggøre udførelsen af eksperimenter med høj gennemløb, hvilket fjerner behovet for tidskrævende tilpasningsprocedurer mellem kørsler. Ved at standardisere protokoller for karakterisering af eksponeringsforhold og opsamling af akustiske emissioner kan systemets afhængige variabilitet forhåbentlig reduceres. Den række parametre, der bør undersøges for et bestemt forsøg, vil afhænge af anvendelsen (ønsket bioeffekt, celletype, dybde af målvæv, hvis in vivo osv.) og arten af ethvert kavitationsmiddel, der anvendes. I betragtning af det store antal variabler (amerikansk frekvens, trykforstærkning, pulslængde, pulsgentagelsesfrekvens osv.) er det usandsynligt, at det vil være praktisk muligt at udforske hele parameterrummet fuldt ud. En fordel ved den foreslåede protokol er, at den gør det muligt hurtigt at oprette nogle grænser for dette parameterområde. For eksempel gør det det muligt at bestemme det mindste tryk, hvor der genereres et kavitationssignal, det maksimale tryk eller pulslængde, der kan bruges, før celleafmontering / død opstår, og det tryk, hvor der produceres fraktioneret harmoniske eller bredbåndsstøj. Det anbefales, at et sådant sæt afgrænsningsmålinger udføres som et første skridt i enhver undersøgelse.

Som præsenteret er SAT'erne designet til realtidsovervågning af akustiske emissioner, hvor biologiske assays udføres uden for eksperimentet. Det ville imidlertid være forholdsvis enkelt at ændre SAT for at muliggøre direkte optisk observation af prøvekammeret via et mikroskopmål. Dette kan igen kobles til et fluorescens- og/eller højhastighedsmikroskopisystem for f.eks. PCD-outputtet, som det i øjeblikket præsenteres med hensyn til spænding, indikerer: i) typerne af kavitationsadfærd og deres relative proportioner; ii) hvor længe disse kavitationsadfærd fortsætter; iii) om de observerede tids-kumulative eksponeringskarakteristika er korreleret med en bestemt bioeffektiv virkning og iv) om de relative niveauer og tidsafhængige adfærd er i overensstemmelse med tidligere forsøg i eksponeringssystemet. Mens pcd'ets modtagefølsomhed kan kvantificeres for pålideligt at karakterisere de akustiske emissioner i form af absolut energi, kræves der yderligere rumlig information. Dette kan opnås ved at erstatte PCD med en array sonde til at gennemføre passiv akustisk kortlægning (PAM)⁸⁰. Dette vil imidlertid øge kompleksiteten af signalbehandling og den beregningsmæssige tid og strøm, der kræves.

Andre instrumenter til måling af membranens elektriske modstand eller anvendelse af fysiske målretningsmetoder, f.eks. Det ville også være muligt at bruge tre-dimensionelle væv strukturer såsom tumor sfæroider, organoider, eller endda ex vivo vævsprøver på akustisk "bløde" gel substrater i stedet for cellen monolayers at studere USA og kavitation-medieret effekter i mere realistiske væv miljøer.