Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 tecnologia está acelerando a engenharia do genoma em muitos tipos de células, mas até agora, entrega do gene e modificação genética estável ter sido desafiador no primárias células NK. Por exemplo, entrega de transgene usando transdução Lentivirus ou retroviral resultou em um rendimento limitado de geneticamente modificadas as células NK devido a apoptose celular NK substancial procedimento associado. Descrevemos aqui um método livre de DNA para edição de genoma de células humanas primárias e expandidas NK usando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permitiu eficiente nocaute do TGFBR2 e HPRT1 de genes em células NK. Dados de RT-PCR mostram uma diminuição significativa no nível de expressão do gene, e um ensaio de citotoxicidade de um produto representativo da célula sugeriu que as células NK RNP-modificado tornou-se menos sensíveis a TGFβ. Células geneticamente modificadas podem ser expandido post-eletroporação por estimulação com mbIL21-expressando irradiado células do alimentador.
Introduction
Imunoterapia tem sido avançada nos últimos anos. As pilhas de T do receptor (carro) de antígeno quimérico geneticamente modificados são um excelente exemplo de células do sistema imunológico engenharia implantado com sucesso em imunoterapia. Estas células foram recentemente aprovadas pelo FDA para o tratamento contra CD19 + B de células malignas, mas sucesso até agora tem sido limitado a doenças tendo alguns antígenos targetable e direcionamento de tais repertórios antigênicos limitados é propenso ao fracasso pela fuga imune. Além disso, as células T de carro foi centraram-se sobre o uso de células autólogas T devido ao risco de enxerto versus doença-- host causada por pilhas de T alogênico. Em contraste, as células NK são capazes de matar alvos de tumor de forma independente de antigénio e não causam GvHD, que os torna um bom candidato para câncer imunoterapia6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnologia tem sido usada recentemente em engenharia células do sistema imune, mas geneticamente reprogramar células NK com plasmídeos sempre foi um desafio. Isto foi devido a dificuldades na entrega do transgene em uma maneira dependente de DNA como transdução de Lentivirus e retroviral causando substancial associada a procedimento NK apoptose celular e a produção limitada da engenharia genética de células NK4 , 9.
Muitas células do sistema imune inatas expressam altos níveis de receptores para padrões moleculares associados patógeno como gene induzida em ácido retinoico eu (RIG-eu), que permitem maior reconhecimento de DNA estranho. Supressão destas vias permitiu maior eficiência de transdução em células NK quando usando métodos baseados em DNA por modificação genética10.
Descrevemos aqui o método para usar um genoma DNA livre edição de primárias e expandidas NK células humanas utilizando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs é composto de três componentes, recombinante Cas9 proteína complexada com RNA de single-guia sintético composto de um complexado crRNA e tracerRNA. Estes Cas9/RNPs são capazes de clivagem genômicos alvos com maior eficiência em comparação com abordagens de DNA-dependente estrangeiras devido a sua entrega como complexos funcionais. Além disso, liberação rápida de Cas9/RNPs das células pode reduzir os efeitos de fora do alvo como a indução da apoptose. Assim, eles podem ser usados para gerar nocautes, ou bater-ins quando combinado com o DNA para o recombination homologous6,7. Nós mostramos que eletroporação de Cas9/RNPs é um método fácil e relativamente eficiente que supera as limitações anteriores de modificação genética em células NK.
TGFβ é uma principais citocinas imunossupressoras, que inibe a ativação e funções das células NK. Tem sido sugerido que o direcionamento da via TGFβ pode aumentar funções de células imunes. Escolhemos a região de codificação TGBR2 ectodomínio que vincula TGFβ11. Os resultados representativos mostram uma diminuição significativa no nível de expressão de RNAm de um gene e ainda demonstram que as células NK modificadas se tornam resistentes aos TGFβ. Além disso, as células modificadas mantém viabilidade e potencial proliferativo, como eles são capazes de ser expandido post-electroporation usando células irradiadas alimentador. Portanto, o método a seguir é uma abordagem promissora para manipular geneticamente células NK para qualquer mais clínico ou fins de investigação.
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Protocol
Casacos de buffy de doadores saudáveis foram obtidos como fonte de materiais de Central Ohio região Cruz Vermelha americana. Esta pesquisa foi determinada como sendo pesquisa isenta por Review Board Nationwide Hospital infantil da institucional.
1. expansão e purificação de célula NK humana
- Isole PBMCs do Buffy Coat12.
- 35 mL de amostra de buffy coat em 15 mL de Ficoll-Paque de camada.
- Centrifugar a 400 x g por 20 minutos sem freio e coletar o PBMC através da interface.
- Lavar os PBMCs recuperados três vezes adicionando pelo menos um volume igual de PBS, centrifugação a 400 x g por 5 minutos e aspirando o PBC lavagem. Células NK podem ser isoladas nesta fase por RosettesSep,13.
- Expandir as células NK, estimulando com irradiados 10x106 mbIL21-expressando células alimentador em dias 0, 7 e 14. Substituir a mídia com RPMI fresco contendo 10% FBS, 1% glutamina, 1% penicilina estreptomicina e 100 UI/mL de Il-2 para o volume de toda a mídia todos os dias.
2. gRNA Design e seleção
- Escolha o locus genômicos específicos para o alvo, usando ferramentas on-line, por exemplo, NCBI, Ensemble.
Exemplo.
Descrição: Transformando o receptor de fator de crescimento beta 2 (TGFBRR2) ectodomínio
Exibir registro: PF08917
Ver os InterPro: IPR015013
Cargo: 49-157 aa
Sequência alvo: Exon 4 do gene TGFBR2 (ENSG00000163513) - Para projetar o gRNAs, usar ferramentas de web design CRISPR tais como http://crispr.mit.edu e 'Benchling'.
- Digite na sequência do DNA escolhida no passo 2.1. Escolha humano (hg 19) como um genoma alvo. CRISPR guias (20 nucleotídeos seguiram por uma sequência de PAM: NGG) serão digitalizados da sequência inserida anteriormente. Ele também mostra possíveis correspondências o alvo durante todo o genoma selecionado.
- Escolha os melhores três gRNAs que têm a maior pontuação, com base em suas taxas no alvo e o alvo. Por exemplo, a tabela 1 mostra os RNAs CRISPR projetado alvejar exon 4 do gene TGFBR2 sugerido por ferramentas de web design CRISPR.
- Ordem a RNAs CRISPR como sintética crRNAs sequência-específicos.
- Encomendar uma conservada, transactivating do RNA (tracrRNA) para interagir através de homologia parcial com o crRNA.
3. projeto exclusão Primers de triagem
- Cartilhas do projeto abrangendo os locais de clivagem de gRNA para ensaio de mutação T7E1.
- Uso as primeiras demão de pelo menos 100 bp longe do local de clivagem previsto para assegurar pequena inserção-exclusão (puntuais) no local de destino de sgRNA aparecerá em gel de agarose 1,5%, após o ensaio de mutação. A tabela 2 mostra os primers que são usados para amplificar o ectodomínio TGFBR2.
4. transdução de células humanas primárias e expandida NK
Nota: Transdução de elementos Cas9/RNPs em NK é feita por eletroporação usando sistema 4D como segue.
-
Celular Preparação
- Para primárias células NK, incubar recém isoladas células NK em meio RPMI na presença de 100 UI/mL de Il-2 por 4 dias e realizar a eletroporação no dia 5. Substitua a mídia todos os dias, conforme descrito anteriormente e no dia anterior a transdução.
- Para expandido células NK, estimulam as células no dia 0 com células irradiadas alimentador na proporção de 1:1 e executar o electroporation no dia 5 ou 6 ou 7. Substitua a mídia todos os dias, conforme descrito anteriormente e no dia anterior a transdução.
- No dia da eletroporação, prepare um frasco T25 preenchido com 8 mL de RPMI fresco contendo 100 UI/mL de Il-2 para células passando por eletroporação e pre-incubate frascos numa umidificado 37 ° C e 5% CO2 incubadora.
Nota: Nas células descongeladas ou que foram submetidos a 2nd ou 3rd estimulação pode ser electroporated a qualquer momento após a sua recuperação, conforme descrito. - Tome 3 a 4 × 106 células por condição para 26 µ l do mix de transdução.
Nota: Concentração muito elevada de células NK em solução de eletroporação aumenta a taxa de transdução. - Lave as células 3 vezes com PBS para remover todos os FBS, que geralmente contém atividade RNase. Girá-los para baixo cada vez a 300 x g durante 8 minutos.
Nota: Considere 7 condições electroporation Cas/RNPs como único gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) e uma combinação de dois gRNAs (gRNA1 + gRNA2 + gRNA3, gRNA1, gRNA2 + gRNA3) e um controle com nenhum Cas9/RNPs.
-
Formar o crRNA:tracerRNA / complexo
- Resuspenda crRNAs (gRNA1, gRNA2 e gRNA3) e tracerRNA em 1 x solução de TE para concentrações finais de 200 μM. 2.2 Mix μL de cada gRNA de 200 μM com 200 μM tracerRNA, conforme mostrado na tabela 3.
- As amostras a 95 ° C por 5 min do calor e deixe arrefecer no topo do banco para a temperatura ambiente (15-25 ° C). Loja resuspended RNAs e crRNA: tracerRNA/complexo a-20 ° C para uso posterior.
-
Formam o complexo RNP
Nota: para poupar tempo, formar complexo durante a lavagem da RNP passo 4.1.5.- Para crRNA:tracrRNA única reação frente e verso, dilua Cas9 endonuclease de 36 μM, como mostra o exemplo na tabela 4.
- Para a transdução de combinação de crRNA:tracrRNA duplex, diluir Cas9 endonuclease de 36 μM como mostrado pelo exemplo no tabela 5.
- Adicionar Cas9 endonuclease para crRNA:tracrRNA duplex lentamente enquanto rodando a ponta da pipeta, mais de 30 s a 1 minuto.
- Incube a mistura à temperatura ambiente por 15-20 min. Se não estiver pronto para usar a mistura após a incubação, manter a mistura no gelo até o uso.
-
Electroporation
- Adicionar o suplemento de todo a solução de eletroporação P3 e mantê-lo em temperatura ambiente.
- Ressuspender as células (3-4 × 106 células da etapa 4.1.5) em 20 μL de solução de eletroporação 4D primária P3. Evite bolhas de ar durante a pipetagem.
Nota: as pilhas não devem ser deixadas por um longo tempo na solução de P3. - Imediatamente Adicione 5 µ l de complexo RNP (passo 4.3) para a suspensão de eritrócitos.
- Adicione 1 μL de 100 μM Cas9 electroporation realçador à Cas9/RNPs/célula misturar.
- Transferi a mistura Cas9/RNPs/celular em 20 μL electroporation tiras.
- Bata levemente as tiras para certificar-se que a amostra cobre a parte inferior das tiras.
- Iniciar sistema de eletroporação de 4D e escolher o programa EN-138 .
5. post transdução
- Deixe descansar por 3 minutos nas tiras que as células.
- Adicione 80 µ l dos meios de cultura pré-equilibrado para a cubeta e suavemente, transferir a amostra para frascos.
- 48 horas depois de transdução, extrai DNA genômico de 5 × 105 células para as exclusões de gene de triagem.
- Amplifica o gene de interesse usando as primeiras demão projetadas no passo 3.2 com kits de Taq DNA polimerase.
- Formar PCR amplicons heteroduplexes para T7EI digestão e incubar o produto por 30-60 minutos com uma enzima de T7EI em 37 ° C.
Nota: O T7EI assay é preferencial para a seleção como ele é rápido, simples e fornece limpar resultados de electroforese em relação ao uso do ensaio de agrimensor. No entanto, esse método não é possível detectar inserções e deleções de < 2 bases que são geradas pela não-homóloga final ingressar na atividade (NHEJ) em experimentos de Cas9 RNPs14. - Executar o DNA digerido em 1,5% gel de agarose em 110 V por 30-45 minutos, a cada 15 minutos visualize o gel.
- Estimular o resto das células com o mbIL21-expressando células alimentador na proporção de 1:1.
- Cinco dias após estimulação extrair o RNA para nível de expressão do gene usando qPCR.
- Realizar ensaios de calceína como relatado anteriormente,12. Brevemente, carrega nas células-alvo com calceína AM (no exemplo mostrado, utilizou-se 3 µ g/mL/1.000.000 células DAOY). Prepare as células NK para ensaios de citotoxicidade, descansando durante a noite no IL2 (100 UI/mL) mais ou menos 10 ng/mL TGFβ solúvel. Realizar ensaios de calceína nas mesmas citocinas como as células NK foram descansou durante a noite.
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Representative Results
Eficiência de eletroporação
Para otimizar a eletroporação de Cas9/RNPs, testamos 16 programas diferentes com transdução de siRNA de direcionamento-GFP e plasmídeo de DNA em células NK. Ensaio de citometria de fluxo mostrou que o pt-138 teve a maior porcentagem de viabilidade e transdução eficiência da célula (35% GFP positivas células vivas) para ambas as partículas (Figura 1 e Figura 2). Curiosamente, a eficiência do uso deste programa para Cas9/RNPs electroporation foi maior, como vimos a redução de 60% no nível de expressão de RNAm de TGFBR2 (Figura 5). Além disso, as células NK geneticamente modificadas podem ser crescidas e expandidas para 30 dias e criopreservados (dados não mostrados).
Ensaio de mutação
Cas9/RNPs contendo gRNA2, gRNA1 + gRNA2 e gRNA3 teve sucesso nocaute de gene TGFBR2 ectodomínio, mas gRNA1 sozinho não fez qualquer T7E1 detectável puntuais (Figura 3). Além disso, a Figura 4 indica com êxito nocaute da HPRT1 humana (hipoxantina Fosforibosiltransferase 1) em expandido células NK usando comercialmente fornecido gRNAs. De acordo com a banda densitometria, as taxas proporcionais indel usando gRNA1 + gRNA2 resultaram na faixa de 34% para TGFBR2 modificado células NK, 25% para gRNA3 e 81% para o gene da HPRT modificado células NK.
Ensaio nível de expressão de gene
Como representante do nosso resultado, a Figura 5 mostra o efeito do Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) no nível de produção de mRNA do ectodomínio TGFBR2, analisado por RT-PCR. Como pode ser visto no gráfico, o nível de expressão do mRNA do gene alvo, diminuiu significativamente.
Citotoxicidade
Como pode ser visto na Figura 6, após incubação de gRNA1 + gRNA2, gRNA2 e gRNA3 Cas9/RNPs modificado células com TGFβ1, co cultivadas com células DAOY; as células modificadas não mostrou qualquer diminuição significativa no seu nível de citotoxicidade em comparação com o grupo de controle que tinha IL-2 nos meios de comunicação durante a noite. Este resultado demonstra que as células Cas9/RNPs modificados retêm sua função de citotoxicidade na presença de TGFβ1 e mostra que as células modificadas se tornou TGFβ1 resistente.
Figura 1. Estes números mostram a eficiência de eletroporação de siRNA e plasmídeo DNA expressando GFP em células NK usando o programa do pt-138. Como pode ser visto aqui, a viabilidade da célula NK é 77,5% e 35% de células vivas foram GFP positivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esta figura mostra a viabilidade e eficiência de outro dos 16 programas (DN-100) testado para otimização de eletroporação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Cas9/RNPs-mediada TGFBR2 nocaute em gastos (a) primário NK células (b) medida pelo ensaio de mutação T7E1. T7E1 enzima reconhece e cliva o DNA incompatível. Cada pequeno grupo (setas azuis) representa digeridos fragmentos de DNA que carregam um indel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Cas9/RNPs - mediada interrupção HPRT em expandido células NK, medido por ensaios de mutação T7E1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. nível de expressão do mRNA de TGFBR2 ectodomínio em CRISPR modificado células NK introduzidas por Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) usando o RT-PCR. GAPDH foi usado como um gene de controle endógeno. A diminuição dos níveis de RNA indica uma disrupção do gene TGFBR2 (quer dizer SEM ±, valor P < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. r. O ensaio de citotoxicidade usando uma amostra representativa de Cas9/RNPs modificado (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 e gRNA3) mostra células NK que durante a noite incubação das células com TGFβ1 não diminui significativamente sua capacidade de lisar células DAOY. b. quando comparado com não-modificadas as células NK, a Cas9/RNP modificadas células NK (gRNA2 e gRNA3) são menos sensíveis à TGFβ1 (média ± SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| gRNA não. | sequência de gRNA | Ordenou-se como crRNA sintético | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Tabela 1. Três projetado gRNAs alvo exon 4 do ectodomínio TGFBR2 como crRNA sintético.
| TGFBR 2 ectodomínio Primers FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomínio Primer REV | 5 GGG CCT MORDAÇA AAT CTG GATO TTA 3 |
Tabela 2. Primeiras demão usadas para amplificar o gene TGFBR2 ectodomínio
| Componente de | Quantidade (uL) |
| CrRNA de 200 µM | 2.2 |
| 200 µM tracer RNA | 2.2 |
| Buffer IDTE | 5.6 |
| Produto final | 10 |
Tabela 3. Formar o crRNA:tracerRNA / complexo usando 200 µM de RNAs
| Componente de | Quantidade (µ l) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA frente e verso (da etapa 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease (estoque de 61 µM) | 2 |
| Volume total | 5 ul |
Tabela 4. Para crRNA:tracrRNA única reação frente e verso, dilua Cas9 endonuclease de 36 µM.
| Componente de | Quantidade (µ l) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA frente e verso (ex. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA frente e verso (ex. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease | 2 |
| Volume total | 5 Μ l |
Tabela 5. Para combinação de transdução de crRNA:tracrRNA duplex diluir Cas9 endonuclease de 36 µM.
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Discussion
Modificação de dependente de DNA das células NK tem sido desafiador4,9. Portanto, introduzimos diretamente um complexo ribonucleoprotein sinteticamente pré-formadas (RNPs) e proteína Cas9 como proteína purificada no de células NK primárias e expandida8. Este método permitiu-na eliminar tampando, seguindo, e outros processos transcricionais e translacionais começaram pela RNA polimerase II, que pode causar apoptose de células NK associados a métodos de transdução de DNA-dependente.
Além disso, o método relatado aqui usa proteína purified Cas9 complexada como Cas9/RNPs, que são ativos imediatamente após electroporation e são degradados rapidamente, assim, aumentando no alvo e diminuindo o alvo efeitos sobre protocolos atuais 5 , 6 , 7 , 16. Além disso, otimizar uma nova abordagem de eletroporação para transduce Cas9/RNP com alta eficiência é outro passo fundamental introduzido aqui, que são aplicáveis a qualquer outros genes de interesse. Esse método pode ser ampliado para a modificação de um número maior de células NK usando cubetas de eletroporação maiores comercialmente disponível (dados não mostrados).
Em resumo, Cas9/RNPs pode ser usados para modificar geneticamente células humanas de NK de primárias e expandidas para imunoterapia utilizando o método descrito acima. Nossos resultados também demonstraram que uma bem sucedido nocaute do gene TGFBR2 ectodomínio leva a estas células NK modificadas, tornando-se resistente TGFβ111.
Combinem a RNP entrega com uma fonte do modelo de DNA (por exemplo, naturalmente o vetores recombinogenic vírus adeno-associado (AAV) doador) pode permitir a inserção de site-specific gene por recombinação homóloga3,18,19 .
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Disclosures
DAL serve/serviu como consultor por Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, laboratórios de pesquisa da Merck e Miltenyi Biotec e tem participações/liderança em CytoSen Therapeutics.
Acknowledgments
Reconhecemos o Brian Tullius por sua gentil ajuda em editar o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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