Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

Här presenterar vi två ultrasnabb protokoll för beredning av membranproteiner in fusogenic proteoliposomes och fusion av sådan proteoliposomes med målet lipid lipidmonolager för tvättmedel-fri leverans av dessa membranproteiner in den postfusion lipidens. Kombinationen av dessa synsätt möjliggör snabb och lättkontrollerad montering av komplexa multi-komponent membransystem.

Abstract

Rengöringsmedel är nödvändiga för leverans av membranproteiner till 30-100 nm små unilamellar blåsor, medan mer komplexa, större modell lipid lipidmonolager är mindre kompatibla med rengöringsmedel.

Här beskriver vi en strategi för förbikoppling av denna grundläggande begränsning med fusogenic motsatt laddade liposomer bär ett membranprotein av intresse. Fusion mellan sådana blåsor uppstår inom 5 min i en låg jonstyrka buffert. Positivt laddade fusogenic liposomer kan användas som enkel transfer vektorer för tvättmedel-fri leverans av membranproteiner i biomimetiska mål lipid lipidmonolager, som är negativt laddade. Vi visar också hur man rekonstruera membranproteiner i fusogenic proteoliposomes med ett snabbt 30-min-protokoll.

Kombinera dessa två metoder, vi visar en snabb montering av en elektrontransport kedja bestående av två membranproteiner från E. coli, en primär proton pump bo3-oxidas och F1Fo ATP synthase, i membran av blåsor i olika storlekar, allt från 0,1 till > 10 µm, liksom ATP produktionen av denna kedja.

Introduction

Funktionalisering av konstgjorda lipid lipidmonolager med membranproteiner är ett viktigt steg i montering av membran modellsystem. Enklaste modellen, proteoliposomes (PL), består av små (30-200 nm diameter) unilamellar blåsor (SUV, även kallade liposomer), med proteiner integreras i membranen. PL bildas traditionellt i två steg1. Första, förformade SUV blandas med ett membranprotein av intresse och ett rengöringsmedel i en koncentration över dess kritiska micelle koncentration (CMC). Andra avlägsnas rengöringsmedel med olika dialys, ”bio-pärlor” eller gel filtrering tekniker, lämnar proteinet i membranet. Den senare metoden är mycket snabbare (~ 30 min1) och är därför att föredra för beredning av sårbara och känsliga membranproteiner, medan de två första metoderna är begränsade av tvättmedel borttagning hastighet, som tar många timmar och kan orsaka en betydande förlust av aktivitet och förlust av strukturell integritet av proteiner. Funktionalisering av större blåsor (stora unilamellar blåsor, LUV, upp till 1 µm i diameter) av detta tillvägagångssätt är mer utmanande, som vesikler storlek får minskas efter tvättmedel borttagning och det inte är möjligt för giant unilamellar blåsor (chef, > 1 µm), eftersom de är destabilisering av rengöringsmedel (men se Johnson et al. 2 för långsam 2D-kristallisering av membranproteiner i stora lipidmonolager). Alternativa metoder för GUV membran funktionalisering3,4,5 finns men är mödosam, tidskrävande och kräver fortfarande vissa tvättmedel vid koncentrationer under CMC. Mer komplexa eller ömtåliga lipid modeller (till exempel Droplet Hydrogel lipidmonolager6 och 3D utskrivbara Droplet gränssnitt lipidens-baserade artificiella vävnader7) tål inte tvättmedel. Snabbt framväxande syntetisk biologi tillämpningar8,beroende9,10 kritiskt av funktionalisering av sådana komplexa membranstrukturer. En enkel och robust metod medger snabb och skonsam tillförsel av membranproteiner i de målet bräckliga lipidmonolager är därför högt söket i fältet.

Ett alternativ, tvättmedel-fri protein leveransmetod är vesikel fusion, där samverkande vesikler membran förenas i den intakta postfusion lipidens, medan deras intravesicular aqueous innehållet blandas, utan släpps ut i externa miljö. Vesikler fusion är aktiverad och drivs antingen av konfirmerande omflyttningar inom kompletterande fusogenic agenter (vissa proteiner11,12 och peptider13 eller speciellt modifierad DNA14) ligger i det att kontakta lipidmonolager, eller Coulombic interaktioner mellan lipid lipidmonolager bildade avtalsstadgade laddade katjon och anjon lipider15,16, eller katjoniska lipidmonolager och negativt laddade proteiner17.

Den tidigare strategin kräver förekomsten av fusogenic ombud i de samverkande membran före fusion, är relativt långsam (~ 30 min att nå högsta halv-fusion12,18), men kan tillämpas på både naturliga och konstgjorda membran.

En fördel med metoden med fusogenic lipider (figur 1) är att det möjliggör mycket snabbare membran fusion (~ 1 min att nå högsta halv-, och 5-10 min att avsluta reaktionen). Dessutom kan omfattningen av fusion styras genom i) en lätt att formulera relativa innehåll av laddade lipider i fusogenic lipidmonolager, och (ii) joniska och i allmänt, osmotisk styrka av reaktion medium (salter på över 50 mM och, exempelvis sackaros15 visas att stoppa fusion), eller en kombination av båda. För att inleda fusion, blandas motsatt laddade fusogenic blåsor i en låg (normalt 10-20 mM salt) jonstyrka medium för 5-10 min. En relativ nackdel med metoden är att katjoniska lipider kan utöva en negativ effekt på funktionalitet av membranproteiner i katjoniska proteoliposomes före fusion, särskilt i låg jonstyrka, men denna effekt är reversibel och understötts av ett naturligt lipid sammansättning efter fusion membranet och dess retur till normal jonstyrka medium.

Protocol

1. beredning av fusogenic SUV och LUV

  1. Beredning av fusogenic lipid blandning
    1. Förbereda stamlösningar av neutrala, katjoniska, anjoniska och fluorescerande lipider i kloroform 25-50 mg/ml (exempelvis neutrala DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), katjoniska etyl-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), anjoniska POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), och fluorescerande cholesteryl-Bodipy-FL12, respektive) genom vägning lämpliga mängder torr lipider och upplösa dem i 100% kloroform (försiktighet! Detta gör under ett dragskåp) eller späda kommersiellt tillgängliga kloroform bestånd av lipider med kloroform.
      Obs: Både naturliga lipid extrakt och ren syntetisk lipider kan användas och visar liknande resultat.
    2. Blanda 2,5 mg en katjoniska och 2,5 mg av en neutral lipid i kloroform lager (1.1.1) i en injektionsflaska av glas.
      Obs: Detta steg ger 5 mg av katjoniska lipid blandning i kloroform, som innehåller 50% vikt bråkdel av katjoniska lipider. När det behövs, tillsätt 0,5% vikt bråkdel av en fluorescerande lipid till blandningen.
    3. Blanda 1 mg anjon och 4 mg av neutrala lipider i kloroform bestånd (1.1.1) i en injektionsflaska av glas. Detta ger 5 mg av anjon lipid blandning innehållande 20% vikt bråkdel av anjon lipider.
    4. Avdunsta kloroform under en ström av kväve för att bilda ett tunt lager av torr lipid.
    5. Ta bort de kvarvarande kloroform under vakuum i 10 min.
      Obs: Detta steg tar traditionellt mycket längre tid (1-12 h), men vi hittade att en längre behandling ger ingen uppenbar förbättring i koppling egenskaperna för SUV.
    6. Återfukta torr lipid filmen genom att 0,5 mL buffert A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM moppar, pH 7,4) till en injektionsflaska och lämnar dem stå i rumstemperatur i 30 min, och sedan vortex tills lipid filmen är helt fristående från glasytan och b ecomes en homogen lipid suspension. Detta tar ungefär 20-40 s.
  2. Bildandet av SUV och LUV genom extrudering
    1. Montera ihop en extrudering-systemet (se Tabell för material) med två 1 mL sprutor med polykarbonat filter med en av följande por storlekar: 100 eller 200 nm till formuläret SUV och 400 eller 800 nm till formuläret LUV.
    2. Över lipid till en spruta.
    3. Extrudera suspensionen genom passering genom filtret 21 gånger, som visas på andra ställen18,19.
      Obs: Ett udda antal passager behövs för att minimera överföringen i vesikler lösningen av stora lipid klumpar fastnat på den filter sidan mot den ursprungliga lipid-fjädringen.
    4. Överföra vesikler lösning i 1,5 mL mikrocentrifugrör.

2. bildandet av Fusogenic GUV av inverterad Emulsion metod

Obs: Denna procedur illustreras i figur 2.

  1. Beredning av lipid-i-olja lösning
    1. Blanda en kloroform lager (se steg 1.1.1) av en neutral lipid (2 mg) och en anjon lipid (0,5 mg) med 1 mL hexadecane i 1,5 mL mikrocentrifug rör.
    2. Avdunsta kloroform från blandningen under konstant blandning och värme vid 80 ° C i 30 min att hålla röret öppet. Nära röret och låt svalna till rumstemperatur.
  2. Bildandet av en lipid enskiktslager på gränssnittet lipid-i-olja/aqueous buffert
    1. Plats 200 µL av lipid-i-olja lösning ovanpå 0,5 mL buffert B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 mM moppar pH 7,4) i ett 1,5 mL centrifugrör. Observera den konvex formen av fas separation gränsen på grund av ytspänningen obalans mellan oljan och vattenhaltiga bufferten (figur 2A).
    2. Vänta tills fas separation gränsen flackar, som är vägledande för lipid enskiktslager bildning på den. Det tar vanligtvis 30-60 min i rumstemperatur.
  3. Beredning av en vatten-i-olja emulsion
    1. Bered en lösning av en vattenlöslig nonjoniska polysackarid i buffert B, med en densitet som är högre än vattnets densitet (t.ex. 15% Ficoll-400 (w/v), med densitet 1,05 g/mL)
      Obs: Valfritt, man kan lägga till fluorescerande vattenlösliga färgämnen bufferten för bättre visualisering av GUV och eventuella andra önskad aqueous innehållet i GUVs.
    2. Över 0,5 µL av ovanstående blandningen till ett separat 1,5 mL centrifugrör med 100 µL av lipid-i-olja lösningen från 2.1.2.
    3. Sonikera (44 kHz 14 W) blandningen för 30 s i en Ultraljuds vattenbad. Då kraftigt virvel för 45 min att bilda en vatten-i-olja emulsion, där varje droppe kommer att täckas av en lipid enskiktslager (figur 2B).
  4. Omvandling av vatten-i-olja emulsion till GUV
    1. Placera den resulterande emulsionen ovanpå lipid-i-olja/aqueous gränssnittet och omedelbart Centrifugera röret i en bordsskiva Centrifugera vid 10 000 x g under 2 minuter. Den resulterande pelleten av GUV bör vara klart synliga (figur 2 c).
    2. Cool röret till 4 ° C i kylskåpet att stelna lipid-i-olja blandningen (figur 2D, hexadecane stelnar under 18 ° C), ta försiktigt bort frusna olja, och sedan dra tillbaka vattenfasen.
      Obs: för att underlätta olja användes borttagning frysa en tråd böjd i form av ett ankare.
    3. Återsuspendera pelleten GUV i 50 µL av färska buffert B, överföring till en ny tub, och inspektera i fluorescens Mikroskop använder en 100 X oljeimmersionsobjektivet (figur 2E).

3. övervakning vesikler Fusion med kobolt-Calcein metod

  1. Beredning av en gel-filtrering gravitation kolumn.
    1. Blötlägg ~ 10 g av en gel-filtrering harts (t.ex. superfin sephadex G-50) i 100 mL avjoniserat vatten och låt svälla över natten.
    2. Packa 3 mL av kådan i en disponibel plast gravitation flöde kolumn, tvätta med ultrarent vatten och jämvikta med buffert C (100 mM KCl, 10 mM moppar, pH 7,4) vid rumstemperatur.
  2. Beredning av SUV+ eller SUV0 laddad med kobolt-calcein.
    1. Förbered en lösning innehållande 1 mM calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM moppar, sedan föra pH 7,4.
      Obs: Kärnan i metoden är att gratis fluorescerande calcein bildar en icke-fluorescerande komplex med Co2 +. Det blir fluorescerande igen vid tillägg av EDTA, som har högre affinitet för Co2 +, förflyttar calcein från komplexet kobolt-calcein (figur 3A).
    2. Tillsätt 500 µL av denna lösning till en torr film av katjoniska eller neutrala lipider som beretts enligt anvisningarna i punkt 1.1.
    3. Förbereda 100 nm SUV av extrudering som beskrivs i punkt 1.2.
    4. Pellet extruderad SUV på 1 000 000 x g i 20 min i en bordsskiva ultracentrifugen och resuspendera i 1 mL buffert C. Upprepa pelletering och resuspension tre gånger; använda 0,6 mL buffert C för sista resuspension.
      Obs: Dessa steg ta bort de flesta av de externa kobolt-calcein.
    5. Ta bort den återstående externa kobolt-calcein genom passerar en disponibel gravitation flöde kolumn laddad med gel-filtrering kådan jämviktas med buffert C som beskrivs för steg 3.1.2 SUV.
      Obs: Vi vanligtvis ignorera den första milliliter volymen av genomströmmande och samla den andra milliliter, som innehåller externa kobolt-calcein gratis SUV.
  3. Beredning av SUV– laddad med EDTA
    1. Bered 10 mm EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM moppar, pH 7,4.
    2. Tillsätt 500 µL av denna lösning till en torr film av anjon lipider bereds enligt anvisningarna i punkt 1.1.
    3. Förbereda SUV– genom extrudering som beskrivs i punkt 1.2.
    4. Pellet och resuspendera SUV– som beskrivs i 3.2.4.
    5. Ta bort den återstående EDTA som passerar SUV– genom gelfiltrering kolumnen som beskrivs i punkt 3.2.5.
  4. Förbereda SUV för fusion
    1. Späd SUV0, SUV+och SUV– med buffert D (1 mM moppar, pH 7,4) kompletteras med 0,2 mM CoCl2 och önskad koncentration av KCl. användning 5 µL av varje typ av SUV per 1 mL buffert D.
    2. Inkubera blandningen för minst 1 h.
      Obs: Detta steg kommer att minimera fluorescens bakgrundsnivån genom att blockera calcein som är ytan-bundna till SUV+.
  5. Vesikler fusion
    1. Starta fusionsreaktion genom att blanda 1 mL SUV+ eller SUV0 med 1 mL av SUV− (utspädd i buffert D som beskrivs ovan) 2 mL fluorimeter kyvetten, och bildskärm ökar fluorescensen av calcein med 480 nm excitation och 510 nm utsläpp (Figur 3B).
    2. Vänta tills reaktionen kommer till fullbordan.
    3. Tillsätt en blandning av rengöringsmedel Triton x-100 och EDTA (0,05% slutlig koncentration och 7 mM, respektive) att frigöra calcein av blåsor och få maximal fluorescens signalen.
    4. Avgöra omfattningen av fusion definieras som andelen av maximala fluorescens signalen efter tvättmedel tillsats som visas i figur 3 c.

4. snabb beredning av membranproteiner in Fusogenic Proteoliposomes

Obs: Denna procedur illustreras i figur 4A.

  1. Förbered en gravitation flöde kolumn med gel-filtrering kådan som beskrivs i 3.1 och temperera den med buffert A vid rumstemperatur.
    Obs: Alla ytterligare manipulationer måste göras strikt på ≤ 4 ° C, om inte annat anges, för att minimera förlust av proteinaktiviteten.
  2. Justera koncentrationen av den renade membranprotein 0,7 mg/ml genom att späda den med samma utvinning bufferten används för protein isolering.
  3. Mix 140 µL av protein med 300 µL av förformade SUV, 160 µL buffert A och 60 µL av 10% cholate i buffert A; Detta ger 1:30 protein: lipid viktförhållande i en slutlig 660 µL volym.
  4. Skaka försiktigt blandningen på en gungande plattform för 15 min.
    Obs: Följande steg kan göras i rumstemperatur.
  5. Passera blandningen genom gelfiltrering harts, och samla grumligt fraktioner som innehåller proteoliposomes.
  6. Pellet proteoliposomes med en bordsskiva ultracentrifugen vid 400 000 x g i 15 min.
  7. Tag bort supernatanten innehållande icke-beredd protein och återsuspendera pelleten i 1 mL av färska buffert A.
  8. Bestämma proteinhalten i PL och supernatanten med Amido-svart metod20.
  9. Bestämma avkastningen av beredning, som normalt är runt 50-70%.
    Obs: Steg 4.6-4.8 kan eventuellt ersättas med passerar PL lösning genom 1 mL av Ni-NTA harts packade i en kolumn i en disponibel gravitation och tvättas med buffert A som beskrivs i 3.1.2. Sådana passerar kommer separata icke-beredd protein, som binds företrädesvis till harts, från PL, mest som kommer att vara i genomflöde.

5. funktionella tester av Protein-aktivitet i Proteoliposomes

Obs: Båda proteiner som används i denna studie är kraftfulla proton pumpar som pumpar H+ i proteoliposomes vid tillsats av deras substrat (coenzym Q1 för bo3-oxidas och ATP för F1Fo, respektive), således byggnads en proton gradient över membranet (ΔpH). Vid lyckad samtidig beredning av fusion, kan sådan försurning observeras som en minskning av fluorescens av en pH-känsliga sonden ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, som används rutinmässigt för sådana uppgifter ( Figur 4B -C). Dessutom substrat-specifik aktivitet av proteiner (coenzym Q1 oxidation av bo3-oxidas22 och ATP hydrolys av F1Fo23,24) kan övervakas spektrofotometriskt med olika metoder. Här visar vi ATP hydrolys aktiviteten av F1Fo PL använder en ATP regenererande assay (figur 4 d), där två enzymer (pyruvat Kinas (PK) och laktatdehydrogenas (LDH) upprätthålla en konstant koncentration av ATP som följer. PK återvinner ATP genom att konvertera ADP produceras av F1Fo tillbaka till ATP på bekostnad av dess substrat phosphoenolpyruvate (PEP). Pyruvat, som är en produkt av denna reaktion, omvandlas till laktat av LDH på bekostnad av NADH, oxidation som kan övervakas som minskar optisk densitet vid 340 nm.

  1. Beredning av kemikalier
    1. Laga 1 mM ACMA lager i etanol.
    2. Förbereda ett 1 mM lager av nigericin (eller någon annan uncoupler) i etanol.
    3. Förbereda 25 mM coenzym Q1 lager i etanol, och 1 M DTT lager i buffert A.
    4. Förbered ett lager av 100 mM ATP i buffert A och justera dess pH till 7,4.
    5. Förbereda bestånd av ATP regenererande systemkomponenter i buffert A: 100 mM PEP, 1 mM NADH och lösningar av PK och LDH vid koncentration på ~ 500-1 000 enheter/mL.
  2. Coenzym Q1 oxidation-driven proton pumpning av bo3-oxidas PL
    1. Tillsätt 20 µL av PL till en fluorimeter kyvetten med 2 mL buffert A i närvaro av 0,5 µM ACMA och vänta tills stabil signal med 430 nm excitation och 515 nm utsläpp.
    2. Lägga till 40 µM coenzym Q1 i kyvetten.
    3. Initiera proton pumpning genom att lägga till 2 mM DTT PL (figur 4B).
      Obs: DTT minskar oxiderat coenzym Q1 och gör den tillgänglig för bo3-oxidas.
    4. Skingra bildade ΔpH genom att lägga till 2 µM uncoupler (till exempel nigericin). ACMA fluorescens signal bör snabbt återgå till nästan ursprungliga nivå.
      Obs: Bör ingen ACMA snabbkylning vid tillägg av underlaget, om uncoupler som finns i reaktionsblandningen initialt.
  3. ATP hydrolys-driven proton pumpning av F1FoPL
    1. Tillsätt 40 µL PL i en fluorimeter kyvetten som beskrivs i 5.2.
    2. Initiera proton pumpning genom att lägga till 0,2 mM ATP PL (figur 4 c).
    3. Skingra ΔpH som beskrivs i 5.2.4.
  4. ATP hydrolys av F1FoPL, och dess stimulans av uncoupler
    1. Lägga till 40 µL PL till en spektrofotometer kyvetten med 2 mL buffert A, innehållande 1 mM ATP, 0,2 mM NADH, 2 mM PEP, och 15 µL varje PK och LDH.
    2. Följ reaktionen genom att mäta absorbansen minskning av NADH vid 340 nm. 3-4 min senare lägga till 2 µM uncoupler till den kyvetten att släppa av mottrycket i ΔpH på ATP hydrolys. Reaktionstiden bör öka omedelbart.
      Obs: PL passerade Ni-NTA harts som beskrivs i 4.10 demonstrerar den starkaste stimuleringen av uncoupler (figur 4 d, röda trace), medan eluatet blir knappt stimuleras (blå trace).

6. provning av Lipid miljö och jonstyrka påverkar funktionalitet av membranproteiner i Fusogenic Proteoliposomes

  1. Bedöma proton pumpning av 40 µL av PL+, PL– och PL0 med ACMA släcka analys i 2 mL buffert D kompletteras med 1 mM MgCl2 och 20 (figur 5, Panel A) eller 100 mM KCl (Panel B) som beskrivs i 5.2 eller 5.3 (figur 5 röd, svart och blå spår).
  2. Säkring 40 µL av PL+ med samma volym av LUV– i 2 mL buffert D kompletteras med 20 mM KCl och test för ACMA släcka (gröna spår).
  3. Kör kontroll experiment som i steg 2 genom att blanda, exempelvis PL och SUV av samma laddning (grå spår).
    Obs: Proton pumpar bör förbättras genom postfusion PL.

7. leverans av membranproteiner i LUV och chef av Fusogenic Proteoliposomes

  1. Säkring 50 µL av PL+ med 50 µL av 800 nm LUV– i 1 mL buffert D kompletteras med 1 mM MgCl2och 20 mM KCl i 5 min.
  2. Pellet blåsor vid 6000 x g i 5 min, och Kassera supernatanten innehållande oreagerad PL+. Återsuspendera pelleten i 1 mL buffert D kompletteras med 1 mM MgCl2 och 100 mM KCl och upprepa pelletering och omblandning dubbelt mer.
  3. Kör ACMA kylning analys som beskrivs i 5.2 eller 5.4.
  4. Kör kontroll experiment, som i steg 1-3, med hjälp av kombinationer av kompletterande laddade blåsor i hög salthalt (200 mM KCl), icke-fusogenic blåsor och bara tomma LUV– pl+.
    Obs: Proton pumpning av postfusion LUV bör identifieras endast när avtalsstadgade laddade blåsor användes som visas i figur 6.

8. montering av elektron transportkedjan från enskilda komponenter i membran av LUV och chef, och ATP produktionen av denna kedja.

Obs: En schematisk av proceduren illustreras i figur 7A. ATP produceras i detta experiment kommer att registreras av systemet luciferin-luciferas, där omvandlingen av syntetiserade ATP till pyrofosfat och AMP av luciferas följs av ljusöppningen registrerade med en luminometern. Vi rekommenderar att du använder en enda-tube luminometer, istället för den mindre känsliga mikroplattan luminometers.

  1. Blanda 3 µL av bo3-oxidas PL+ och 5 µL F1Fo PL+ bildade som beskrivs i avsnitt 4.
  2. Säkring dem med 3 µL av LUV eller GUV– (bildas som beskrivs i avsnitt 2) i 800 µL buffert D kompletteras med 20 mM KCl och 1 mM MgCl2 för 5 min.
  3. Hög koncentration bestånd Lägg till KCl och moppar till 100 mM och 50 mM slutlig koncentration till postfusion membran.
    Obs: Vid efter fusion LUV, detta steg kommer att förhindra deras svullnad på grund av osmotisk förskjutning mellan externa (buffert A) och intravesicular (bufferten D) salter koncentration.
    1. Eventuellt, pellets postfusion membran som beskrivs i 7,2 att separera oreagerad SUV+och återsuspendera pelleten i 800 µL buffert A.
  4. Förbereda 200 µL av en luciferin-luciferas-ADP cocktail innehållande 400 µM ADP, 50 µM luciferin och 2,5 µg luciferas i buffert A
  5. Lägga till cocktail till postfusion blandningen från Step8.3.
  6. Lägga till 40 µM av oxiderat coenzym Q1och utlösa kroppsmedvetenheten av postfusion membran av bo3-oxidas genom att lägga till 2 mM DTT. Vänta 1 minut.
  7. Initiera ATP-syntes genom att lägga till 5 mM kalium fosfatbuffert (KPjag, pH 7,4) strömförande blåsor och upptäcka ATP produktionen med en luminometer (figur 7B). Kör reaktionen för ~ 3 min.
    Observera: ATP syntes reaktion försäljningsintäkt för 5-7 min tills utarmning av syre som förbrukas av bo3-oxidas och luciferas.
  8. Lägg till ATP referensstandard (0,5 nmol ATP) i reaktionsblandningen två gånger. Åtgärd ATP produceras.
  9. Få den faktiska mängden ATP produceras i reaktionen genom att dela upp signalen från ATP syntes reaktion av ATP referens standard signalen. Justera det här värdet till den totala mängden F1Fo används i reaktionen, och slutligen uttrycka graden av ATP-syntes i µmol ATP / (mg F1Fo* min).

Representative Results

Användning av fusogenic kompletterande laddade proteoliposomes för snabbt tvättmedel-fri leverans av membranproteiner i målet lipidens membran innehåller tre steg (figur 1): A, bildandet av fusogenic SUV från lipid blandningar med hög innehåll av laddade lipider; dessa SUV kan du också bära en intravesicular Last; B, omvandling av fusogenic SUV till PL med hjälp av vår snabba membran protein beredning; C, fusion av fusogenic PL med målet lipidmonolager i en låg salthalt medium, följt av tillägg av hög salthalt att stoppa fusion reaktionen. Vid stora blåsor (D), en bättre strategi är att leverera membranprotein in de anjon mål lipidens, vilket ger en bättre lipid miljö för aktiviteten av membranproteiner (diskuteras närmare i texten).

GUV bildandet protokollet med inverterad emulsion metod markeras i detalj i figur 2. Vi föredrar att använda hexadecane i lipid-olja blandningen på grund av dess relativt höga (18 ° C) Frystemperaturen, som tillåter enkel borttagning av stelnad olja efter GUV pelletering.

Figur 3 visar vesikler fusion med kobolt-calcein-EDTA-metoden. Fusion ses endast när kompletterande laddade blåsor används i låg salt buffertar, medan högre salt koncentrationer (> 50 mM14) eller användning av icke-fusogenic blåsor visar ingen fusion.

Detta snabb protokoll om beredning av membranproteiner in fusogenic SUV illustreras i figur 4A. Använder det här protokollet, vi visar snabb beredning av primära proton pump bo3-oxidas och F1Fo ATP synthase i PL och bedömning av deras specifika aktivitet i dessa membran. Det är viktigt att nämna att avkastningen av protein beredning beror inte på en lipid används15 laddning och är ca 50-75%25,12, och att proteinet efter beredning i PL, kan lagras i minst tre dagar, även vid rumstemperatur utan uppenbara förlust av proteinaktiviteten. Detta förfarande ger också enkelriktad orientering av ATP-syntas, där mer än 95% av det har dess hydrofila biexponentiellt F1 orienterade utåt15,26.

Figur 5 visar att protonen pumpning verksamhet i F1Fo (Panel A) och bo3-oxidas (Panel B) i katjoniska lipider är reducerad och känslig för låg jonstyrka, jämfört med anjoniska och neutrala lipider miljö, men Denna effekt är mildras i postfusion membran efter fusing PL+ med anjoniska LUV–.

Figur 6 visar leverans av F1Fo ATP synthase till membran av stora blåsor. I detta experiment, PL+ och 800 nm LUV– fixerades i 20 mM KCl för 5 min och reaktionsprodukten var pelleterat för att ta bort icke kondenserad PL+, resuspended och analyseras för proton pumpning. Kontroll experiment visade ingen proton pumpa när LUV0 istället av LUV– användes i fusionsreaktion (svart trace) eller tom LUV– ensam var analyseras (blå trace).

Snabb montering av en fungerande elektron transportkedjan i membran av stora blåsor med hjälp av fusogenic PL visas i figur 7. Vi använde F1Fo SUV+ och bo3 SUV+ för fusion med 800 nm LUV-, och visat ATP produktionen av denna kedja i de postfusion blåsor genom att sekventiellt lägga coenzym Q1 och DTT att vitalisera membran, och sedan lägga till fosfat för att utlösa ATP-syntes av F1Fo.

Figure 1
Figur 1: befruktningen av ultrasnabb tvättmedel-fri leverans av membranproteiner i målet lipid lipidmonolager via fusion av unilamellar blåsor bildas av kompletterande laddade lipider. (A) bildandet av katjon och anjon fusogenic små unilamellar blåsor (SUV+, SUV–) alternativt laddad med intravesicular laster. (B) omvandling av fusogenic SUV i fusogenic proteoliposomes (PL) genom beredning av membranproteiner. (C) tvättmedel-fri leverans av membranproteiner till postfusion membran med fusogenic PL. (D) att föredra strategi för leverans av membranproteiner till membran av stora blåsor, illustrerad av fusion mellan 100 nm PL+ och 800 nm LUV–. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: GUV bildandet protokoll med en inverterad emulsion metod. (A) bildandet av en lipid enskiktslager på gränsen mellan olja-lipid blandningen och vatten. (B) bildandet av en inverterad (vatten-i-olja) emulsion. (C), GUV bildandet av passerar emulsionen genom olja-vatten gränsen genom centrifugering. (D) kylning av röret nedan < 18 ° C till stelna och ta bort oljan. (E) A fluorescerande mikroskopi bilden av en GUV innehållande fluorescerande lipid (1% vikt bråkdel cholesteryl-Bodipy-FL12) i dess membran (grön) och en polar fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) i vesiklers lumen (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Lipid blåsor fusion studeras med metoden kobolt-calcein-EDTA. (A) Schematisk bild av metoden, där gratis calcein släpps från ett icke-fluorescerande kobolt-calcein komplex av EDTA. (B) Fusion av SUV i olika KCl koncentrationer. (C) Release av den intravesicular calcein genom tillsats av EDTA och Triton x-100 rengöringsmedel till postfusion blåsor visas i B som beskrivs i text. I fusion utsträckning (%) för röda spår beräknas genom att dividera den maximal bakgrundskorrigerade fusion signalen (1 - 2) av bakgrundskorrigerade maximal signalen efter utgivningen av inkapslade calcein (3-2) och multiplicera med 100. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Ultrasnabb beredning av bo3-oxidas och F1Fo i fusogenic proteoliposomes, och protein Aktivitetsmätningar i sådana proteoliposomes. (A) Schematisk av protokollet beredning. (B), coenzym Q1 oxidation driven proton pumpning av bo3-oxidas i PL mätt med ACMA kylning (förklaras i texten). (C), ATP hydrolys-driven proton pumpning av F1Fo i PL mätt med ACMA kylning (förklaras i texten). (D), ATP hydrolys av F1Fo i PL mätt med ATP-regenererande system (förklaras i text), och dess stimulans av uncoupler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: påverkan av lipid miljö och jonstyrka på aktivitet av membranproteiner. Proton pumpning av F1Fo (A) och bo3-oxidas (B) i katjoniska PL (röda spår), anjoniska PL (blå trace), neutrala PL (svart trace) och katjoniska PL smält med anjoniska LUV (gröna trace) i 20 och 100 mM KCl. kontrollen trace () grå) visar ingen förändring i proton pumpning av F1Fo PL– vid blandning med SUV–. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Leverans av F1Fo ATP synthase till membran av 800 nm LUV– via fusion med PL+. (A) Schematisk bild av experimentet: PL+ och 800 nm LUV– fixerades i 1 mM moppar (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl i 5 min, pelleterat för att ta bort icke kondenserad PL och resuspended i samma bufferten. (B) Proton pumpning av den postfusion LUV (röda spår). Kontroll experiment visade ingen ACMA kylning när PL0 blandades med LUV– (svarta spår), eller tom LUV– ensam var analyseras (blå trace). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: 5-min tvättmedel-fri montering av en elektron transportkedjan i membran på 800 nm LUV– via fusion med PL+. (A) Schematisk bild av experimentet: 100 nm F1Fo PL+ och 100 nm bo3-oxidas PL+ fixerades med LUV-, som beskrivs i figur 6. Fusion stoppades genom att lägga KCl och moppar till 100 och 50 mM, respektive. Membranen var blandat med ADP-luciferin-luciferas cocktail och strömförande genom tillsats av DTT och Q1, som beskrivs i texten. ATP produktionen inleddes genom tillsats av 1 mM fosfat (Pjag) och övervakade realtid med luciferas-luciferin system som beskrivs i texten. (B), ATP-syntes av postfusion blåsor (röda spår). Kontroll experiment visade ingen ATP produktionen när PL+ blandades med LUV– i hög salthalt (grå) eller PL0 blandades med LUV– (svart). ATP beräknades syntes som förklaras i texten (steg 8,8-8,9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Följande par frågor behöver beaktas för framgång med detta experimentella tillvägagångssätt:

Val av lipid avgift för proteoliposomes och målet lipidmonolager: Katjoniska lipider finns inte i naturen, medan anjon lipider finns rikligt i Biologiska membraners når, exempelvis ~ 25, 35 och 20% i inre membranet av E. coli, plasmamembranet av jäst S. cerevisiaeoch inre mitokondriell membran av många arter, respektive27,28,29. Det vore rimligt att förvänta sig att funktionaliteten av membranproteiner i PL+ kan påverkas av en positiv laddning av den lipidens, som i sin tur skulle bero på en relativ innehållet i katjoniska lipid i lipidens och externa jonisk styrka styrka. Det är därför viktigt att ta itu experimentellt i vilken utsträckning funktionalitet av membranproteiner av intresse skulle bero på laddning katjoniska lipid miljön. Här visar vi att både F1Fo ATP synthase och bo3-oxidas är känsliga för katjoniska lipid miljö, men vi lyckades modulera och vända denna effekt genom att första att placera proteinerna i PL+ och leverera dem till anjon att acceptera lipidmonolager och sedan öka jonstyrka av reaktion medium efter fusion är färdiga.

Val av en särskild katjoniska lipid: De flesta kommersiellt tillgängliga katjoniska lipider är av icke-triacylglyceride natur. Därför måste en potentiell kandidat lipid testas för kompatibilitet med membranproteiner sevärdheter. Vi hittade tidigare15 som den ATP-syntas som används i denna studie visade sitt bästa resultat i PL+ bildas av etyl-PC, som har den högsta strukturella likheten till de naturliga triacylglyceride lipider, medan i DOTAP (icke-triacylglyceride lipid) PL+ detta protein var mindre aktiva.

Vesikler fusion analyser: Sanna vesikler fusion (när intravesicular flytande innehållet blanda) behöver göras åtskillnad mellan från hemi-fusion mellanlägen, när blåsor fäster vid varandra utan att blanda deras aqueous innehåll, men lätt blanda innehållet i deras yttre eller båda lipid broschyrer30. Vid suboptimala lipid blandningar eller vissa villkor Visa blåsor också uttalad flytande innehåll läckage under fusion31. Minimal koncentrationer av laddade lipider i fusogenic blandningar möjliggör sann fusion måste hittas experimentellt för varje lipid art, men i allmänhet det konstateras att membran med mindre än 10% debiteras lipider återges icke-fusogenic 32.

Samtidigt bildar fusogenic SUV i närvaro av multi-valent joner, är det viktigt att inte blanda motsatt laddade komponenter, eftersom detta kan orsaka omedelbar klumpar och aggregering av lipider av dessa joner. Till exempel medan du förbereder SUV för metoden kobolt-calcein-EDTA, är det viktigt att undvika att blanda en katjoniska lipid blandning med EDTA att förhindra igensättning av filtret polykarbonat av sammanklibbade komponenter.

Det är också viktigt att nämna att metoden kobolt-calcein-EDTA, samtidigt som den är mycket känslig och bekvämt för realtid fusion övervakning, kan fortfarande underskattar omfattningen av fusion på grund av 1) själv snabbkylning av fluorescens gratis calcein inuti postfusion blåsor, som förväntas nå 1 mM, medan själv släcka tröskeln rapporteras vara runt 20 µM33, och 2) yta-bundna kobolt-calcein, som fortfarande är bundna till SUV+ efter passerar genom gelfiltrering kådan och färger blåsor till en ljus orange färg, medan SUV0 har en blek orange färg. Observera också att frisläppandet av den bundna kobolt-calcein vid tillsats av rengöringsmedel Triton x-100 i närvaro av EDTA genererar mycket starkare signaler för SUV+ (figur 3 c, röda spår) än SUV0 (grå spår).

Perspektiv: vi förväntar oss att de snabba metoder som beskrivs här kan kraftigt underlätta och påskynda montering av komplexa membran för behov av framväxande syntetisk biologi tillämpningar. Vårt membran protein beredning protokoll tar bara en halvtimme för beredning av bräckliga stora membranproteiner känd att vara känslig för långvarig dialys-baserade beredning tekniker, medan denna fusogenic strategi tar bara 5-10 min att leverera sådana proteiner i stora lipid lipidmonolager. Här, demonstrera vi fördelarna med dessa metoder genom att manipulera E. coli F1Fo ATP-syntas, som är ett exempel på en bräcklig protein. Den är gjord av 23 subunits och är kända för att lätt förlorar sin integritet om utsätts för suboptimala förhållanden (exempelvis värme) under/efter lösbarhet, men proteinet som används i dessa förfaranden, och visar reproducibly hög aktivitet i proton pumpning.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma att Robert Gennis från University of Illinois och Christoph von Ballmoos från universitetet i Bern för att ge en plasmid och en stam att uttrycka bo3-oxidas. Projektet stöddes av BBSRC bevilja R.I. och R.B. BB/L01985X/1

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).

Tags

Fråga 134 beredning membranproteiner biokemi proteoliposomes LUV GUV membran fusion elektron transportkedjan ATP-syntas ATP produktionen syntetisk biologi
Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik,… More

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter