Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

En los últimos años, las células linfoides innatas (ILC) se han investigado cada vez más. A pesar de su falta de receptores específicos de antígeno, que pertenecen al linaje linfoide y representan centinelas importantes para la homeostasis de los tejidos y la inflamación. CIL se divide actualmente en tres grupos basados en su expresión de combinaciones específicas de factores de transcripción y de su capacidad para producir citocinas ^{6, 7.}

ILC contribuyen a numerosas situaciones homeostáticos y fisiopatológicos en diversos órganos a través de la producción de citoquinas específicas ^{8, 9.} Para poder entender el papel de estas células, es importante para determinar las diferentes subpoblaciones de la CDI por órganos e identificar sus relaciones de desarrollo. Además, los fenómenos de plasticidad entre los diferentes subconjuntos se han relacionado. Mediante el estudio de la heterogeneidadde las células presentes en un órgano, es posible delimitar su etapa de maduración y para distinguir sus funciones específicas.

Para ilustrar la técnica de multiplexación de una sola célula de RT-qPCR, las CIL hepáticas fueron elegidos, con un énfasis particular en su heterogeneidad dentro del mismo grupo CIT (CIT tipo 1) ^10. En primer lugar, mediante el uso de citometría de flujo, tres poblaciones distintas de la CIT se caracterizaron en el hígado. Grupo 1 CIT representa alrededor del 80% de los efectores innatos, mientras que las otras dos poblaciones son las poblaciones de la CDI hepáticas raras (menos del 5% de los efectores innatos). Esas poblaciones fueron ordenados usando ampliamente expresadas marcadores de la superficie celular de las poblaciones de la CDI. Como resultado, las poblaciones ordenadas CIT en el hígado miran uno similar en términos generales a otro.

Múltiplex de una sola célula de RT-qPCR ha emergido como una de las mejores técnicas para investigar con prontitud a la heterogeneidad de estas poblaciones ¹¹

A continuación, por clasificación de todas las células con un fenotipo ILC global, se obtiene una amplia visión general de la expresión de múltiples genes de las poblaciones de la CIT del hígado, a pesar de que representan poblaciones extremadamente raros. Un chip basada en la microfluídica permite la experimentación con inclusouna pequeña cantidad de material celular. Como consecuencia, los perfiles de expresión génica de las poblaciones de células raras se pueden obtener. El uso de software en línea de la firma de análisis de genes, núcleos de población de células y las relaciones celulares potenciales pueden ser investigados. En consecuencia, las pruebas funcionales pueden llevarse a cabo para validar los datos de agrupación a nivel in vivo.

Decenas de expresiones de genes podrían evaluarse de forma concomitante en cientos o más células individuales en el mismo chip ^{3, 11, 12.} Diseño del ensayo es la parte más larga y más importante del experimento. La determinación de los genes correspondientes a la hipótesis de que ser probado es de suma importancia para obtener resultados relevantes. En segundo lugar, se necesita un control interno (tales como marcadores de superficie conocidos utilizados para la clasificación) y controles específicos. Esto es crucial para probar la especificidad de amplificación de cebador, la eficiencia de la amplificación, y tque la ausencia de competencia de imprimación. Por lo tanto, trabajando con multiplex de una sola célula RT-qPCR es una técnica de ahorro de tiempo, ya que la expresión de genes múltiples de una célula se evalúa al mismo tiempo.

Usando el mismo chip y mezcla de reactivos para todas las células limita los posibles errores de manipulación y permite la reproducibilidad entre las muestras. En total, los diferentes aspectos de multiplex de una sola célula RT-qPCR permite la producción de resultados altamente fiables a nivel clonal, con un gran nivel de sensibilidad para una amplia variedad de muestras y genes. Los resultados obtenidos ofrecen datos potentes y robustos para pruebas bioestadísticos.

Esto se puede lograr debido al aspecto de microfluidos del método, lo que permite para el trabajo en muy pequeñas cantidades de material y conduce a resultados exhaustivos. Por último, el uso de software en línea, es posible comparar las poblaciones deseadas.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Seguridad Instituto Pasteur, de acuerdo con el Ministerio de Agricultura de Francia y las directrices de la CEE.

1. Preparar una placa de 96 pocillos de clasificación de celda única

1. Preparar la mezcla de pre-amplificación en un tubo de 1,5 ml mediante la adición de 5,0 l de tampón de retro-transcripción específico, 1,3 l de bajo ácido etilendiaminotetraacético tampón (EDTA) TE (solución 10 TE mM, pH 8, y la solución de EDTA 0,1 mM; 0,2 mM filtró ), y 0,2 l de Taq ADN polimerasa por pocillo (Figura 1a).
2. En una placa de 96 pocillos, distribuir 6,5 l de la mezcla de pre-amplificación en cada pocillo (hasta 48 pozos). Esta placa es la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos.
   NOTA: El uso de una pipeta electrónica se recomienda para este protocolo. Permite mediciones de volumen precisos y reproducibles y ahorra tiempo.

(A) En el 96 pocillos de una sola célula placa de clasificación, la mezcla pre-amplificación se distribuye primero, seguido de la mezcla de ensayo 0,2x. (B) El registro de cada posición de una sola célula debe mantenerse en una hoja de cálculo. Un bien sin una célula se denomina también "no entrada" y se puede utilizar como un control. Dos filas se puede ahorrar para controlar la eficiencia del cebador con la dilución de cDNA (secuencial uno de cada diez diluciones desde el equivalente de 10 ⁵ células a una célula). (C) En la placa de ensayo de 96 pocillos, el reactivo de carga de ensayo se distribuye primero, seguido de la adición de los cebadores. No se olvide de mantener un diseño de cada posición de imprimación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparar una mezcla de ensayo 0,2x en un tubo de 1,5 ml mediante la adición de 1,4 l de cada cebador (cebadores 20x; hasta 48 sondas diferentes; ver Tabla 1). Ajustar el volumen final de 140 l con tampón de baja EDTA TE.
4. Distribuir 2,5 l de la mezcla de ensayo 0,2x a los 48 pocillos en la placa de clasificación de una sola célula 96 pocillos que contiene la mezcla de pre-amplificación.
   NOTA: El volumen final en cada pocillo de la placa de muestra de 96 pocillos debe ser de 9 l.
5. Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y girar hacia abajo a 280 xg durante 45 seg. Guarde la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos a -20 ° C o usarlo inmediatamente.

2. La disociación de los organismos unicelulares

1. El uso de un sistema de suministro de CO _2, la eutanasia a un ratón por la hipoxia. Fijar el ratón sobre una placa de disección y abrir la cavidad peritoneal longitudinalmente con unas tijeras.
2. Recuperar las CIL desde el hígado.
   1. Antes del aislamiento del hígado, al ras del livcélulas er-circulación.
      1. Para llevar a cabo la vena porta, mover el pequeño y el intestino grueso en el lado izquierdo del ratón; la vena portal aparece como la vena más grande en la cavidad peritoneal.
      2. Con una jeringa de 10 ml y una aguja de 0,45 mm, lavar el hígado con un medio de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a través de la vena porta. Para facilitar el lavado de hígado, cortar la arteria gástrica con unas tijeras.
      3. Para extraer la vesícula biliar, pellizcar la base de la vesícula biliar con pinzas y separarlo del hígado con unas tijeras.
      4. Para aislar el hígado, pellizcar la base del hígado con fórceps, y el uso de tijeras, separar el hígado del resto de la cavidad peritoneal.
      5. Transferir el hígado en un tubo de alfarero con 5 ml de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de suero de 2% de ternera fetal (FCS).
3. Disociar el hígado con una disociación mecánica usando una mano de mortero. Pasar el medio a un tubo de 15 ml. Llevar el volumen totala 14 ml con RPMI 2% de FCS. Deja la suspensión de células en hielo durante 15-20 minutos para decantar los hepatocitos.
4. Recuperar el sobrenadante (sin los hepatocitos) en un nuevo tubo de 15 ml con una pipeta de 1 ml (12 ml de sobrenadante se puede esperar). Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Descartar el sobrenadante después de la centrifugación.
5. Resuspender el precipitado obtenido en la etapa 2.4 en 14 ml de medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Percoll 40%). Centrifugar a 600 xg durante 20 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
6. Resuspender el precipitado en 1 ml de acetato de potasio (ACK). Dejar a temperatura ambiente durante 1 min. Después de 1 min, llevar el volumen total a 14 ml con solución de Hank equilibrada Salado (HBSS) 2% de FCS. Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Descartar el sobrenadante.
7. Teñir las células.
   1. Resuspender el precipitado en 300 l de mezcla de anticuerpos con biotina (véase la Tabla de Materiales; añaden todos los anticuerpos con biotina mencionaned) y la transferencia de las células en 1,5 ml tubo. Dejarlo en la oscuridad durante 20 minutos a 4 ° C.
   2. Llevar el volumen total a 1 ml con HBSS 2% de FCS. Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Resuspender el precipitado en 300 l de mezcla de anticuerpos acoplados a fluorocromo y estreptavidina conjugada con fluorocromo (véase la Tabla de Materiales, añadir todos los anticuerpos-fluorocromo junto mencionados). Dejarlo en la oscuridad durante 20 minutos a 4 ° C.
8. Llevar el volumen total a 1 ml con HBSS 2% de FCS. Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de 1 ml. Resuspender el precipitado en 1 ml de HBSS y yoduro de propidio (Pi; 1: 4.000).
   NOTA: Al utilizar los marcadores de la superficie celular de la CDI ampliamente expresadas, se definen 3 poblaciones: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ^+, y NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Todas las poblaciones están ordenados linaje ^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+.

3. Una sola célula células activadas por fluorescencia (FACS)

1. Utilice FACS para clasificar las células individuales ^13.
   NOTA: Los diferentes tipos de células pueden ser ordenados en la misma placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos (Figura 2).
   1. Utilice FACS para ordenar una célula por pocillo que contiene la mezcla de ensayo 0,2x y la mezcla de pre-amplificación en la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos. Use un plato de clasificación de una sola célula de 96 pocillos recién preparada o descongelar si se almacena a -20 ° C.
      1. Poner una placa de 96 pocillos sellada en el soporte de la placa de FACS. Utilice una placa de 96 pocillos vacíos como una prueba. Coloque la placa con la A1-bien de la izquierda y hacia el experimentador.
      2. Ajuste el soporte de la placa para obtener una gota en el centro de la A1-bien con los granos de verificación.
      3. Repita el paso 3.1.1.2 con todos los pozos de la línea A.
      4. Retire el sello de la placa de 96 pocillos y ordenar 100 perlas de verificación por pocillo. Compruebe si dformación rop en el centro de los pocillos.
      5. Cuando se ajusta adecuadamente, coloque la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos en el soporte de la placa. Dibujar el diseño de la placa y el tipo 1 de células por pocillo.
         NOTA: El posicionamiento apropiado de cada célula en la placa de clasificación 96 pocillos de una sola célula es esencial. Una disposición de la placa debe mantenerse en un software de hoja de cálculo. La disposición de la placa se utilizará en los próximos pasos (Figura 1B) ^14. Deja un pozo que contiene la mezcla de ensayo de 0,2x y una mezcla de pre-amplificación en la placa de muestra de 96 pocillos sin células. Esto bien se utiliza como un control sin entrada. Dejar dos filas de 6 pozos para una dilución de ADNc. Estos pozos se utilizan como controles para la eficiencia del cebador (Figura 1b).
      6. Guarde la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos a -20 ° C o usarlo inmediatamente.

4. Pre-amplificación

1. Utilice una sola célula de clasificación OBT plato fresco o descongelado de 96 pocillosained en el paso 3.1.1.6. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 xg durante 45 seg).
2. Coloque la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos en el termociclador. Realizar la transcripción inversa y de pre-amplificación de acuerdo con el programa mencionado en la Figura 3 y la Tabla 2.

Figura 3: Programa de pre-amplificación. Con el fin de tener suficiente material, se requiere pre-amplificación de genes diana específicos en las células individuales ordenados. La placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos se carga en un termociclador para seguir el programa de pre-amplificación. Los productos de pre-amplificación se diluyen a continuación con baja EDTA tampón TE y se pueden utilizar inmediatamente o se congelaron a -20 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Se diluye el pre-amplificadorlified muestras mediante la adición de 36 l de tampón de baja EDTA TE en cada pocillo.
4. Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 g durante 45 segundos). Almacenar la, placa de 96 pocillos pre-amplificada de una sola célula de clasificación a -20 ° C o usarlo inmediatamente.

5. Preparar una placa de muestra de 96 pocillos

1. Preparar 191 l de mezcla maestra mediante la adición de 175 l de qPCR mezcla maestra y 17,5 l de reactivo de carga de muestra.
2. En una nueva placa de 96 pocillos, distribuir 3,6 l de mezcla maestra en cada pocillo (hasta 48 pozos). Esta es la placa de muestra de 96 pocillos.
3. Transferir 2,9 l de cDNA pre-amplificado a partir de la placa de muestra de 96 pocillos a la nueva placa de 96 pocillos. Mantener la misma posición para cada muestra entre la placa de clasificación de células de 96 individual y la placa de muestra de 96 pocillos.
4. Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 xg durante 45 seg). Coloque la nueva placa de 96 pocillos en hielo protegido de la luz. Almacenar el 96 pocillos samplia placa a -20 ° C o usarlo inmediatamente.

6. Preparar una placa de ensayo de 96 pocillos

1. En una nueva placa de 96 pocillos, distribuir 3 l de reactivo de ensayo de carga en cada pocillo (hasta 48 pozos). Esta placa se llama la placa de ensayo de 96 pocillos.
2. Añadir 3 l de cebadores para cada pocillo. Mantenga un diseño en una hoja de cálculo (Figura 1c y en la Tabla 1, el uso de todos los primers que figuran en la Tabla 1). El correcto posicionamiento de cada cebador en la placa de ensayo de 96 pocillos es esencial para los próximos pasos.
   1. Si el número de muestras está por debajo de 48, añadir agua en lugar de los cebadores a los pocillos no utilizados.
3. Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 xg durante 45 seg). Guarde la placa de ensayo de 96 pocillos a -20 ° C o usarlo inmediatamente.
   NOTA: Para evitar los ciclos de congelación y descongelación de los cebadores, distribuir los cebadores para la mezcla de pre-amplificación y para el 96-welplaca de ensayo l al mismo tiempo.

7.-celular de chip único de expresión génica

1. Coloque el circuito integrado de microfluidos (CFI) en el banco y comprobar las válvulas utilizando la jeringa con tapa. Abra la jeringa, lo coloca perpendicular a la válvula, y presione firmemente. La junta tórica debe moverse. Llenar el chip con el fluido de control (0,3 ml de tuberculina).
2. Repita el paso 7.1 con la segunda válvula.
   NOTA: No se derrama líquido debe ser sobre el chip.
3. Retire la película azul de la parte inferior del chip. Cargar el chip en el controlador de la CFI. En la pantalla del controlador de la CFI, seleccione "PRIME" y luego "Ejecutar". El control de las líneas de microfluidos duró 10 minutos.
4. Expulsar el chip y volver a sellar la película azul en la parte inferior del chip.

Figura 4: Una sola célula múltiplex de expresión génica de carga de chip. Estos pasos requieren gprecisión reat, especialmente durante la transferencia de la placa de 96 pocillos para el chip de expresión génica multiplex de una sola célula. Para evitar errores de carga y extravíos, es muy recomendable para trabajar de forma secuencial. El volumen ocupado por cada transferencia debe ser controlado durante el proceso de pipeteado. Por último, es importante para evitar cualquier burbuja y para eliminar de ellos en caso de formación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Usando una pipeta de 8 canales, la transferencia de 5 l de la placa de ensayo de 96 pocillos en el lado A1 (lado izquierdo) del chip. Llenar el lado izquierdo del chip, como se indica en la Figura 4. Tenga cuidado para dibujar siempre el mismo volumen en las puntas.
   1. No crear burbujas. Si aparecen burbujas, sáquelas con 10 consejos l. Cambie las puntas de cada pocillo de la viruta.
6. Repita el paso 7.5 en el lado derecho of el chip usando 5 l de la placa de muestra de 96 pocillos.
7. Retire la película azul de la parte inferior del chip. Cargar el chip en el controlador de la CFI. En la pantalla del controlador de la CFI, seleccione "Ejecutar script" y luego "Ejecutar". La carga de las líneas de microfluidos dura 45 min.
8. Expulsar el chip y volver a sellar la película azul en la parte inferior del chip.

8. Ejecutar el chip

1. En el equipo de qPCR de microfluidos, seleccione el software "Data Collection". Una vez que se inicia, seleccione "Nueva Ejecutar".
2. Seleccione "Expulsar", retire la película de color azul de la parte inferior del chip, y cargar el chip. Coloque el chip para obtener el A1 bien a la izquierda y hacia el experimentador.
3. On "Proyecto", seleccione "Ninguno" y luego "Siguiente".
4. Seleccione "Nuevo plazo chip", "Nuevo directorio chip" (crear una carpeta para el experimento), y "Siguiente".
5. En "La expresión de genes", seleccione "; Referencia pasiva = ROX "(carboxi-X-rodamina) y" sonda individual; "seleccionar el filtro correcto de acuerdo con los cebadores Seleccionar." Siguiente ".
6. Seleccione "Examinar" y seleccionar el programa correcto de acuerdo con los cebadores utilizados.
   NOTA: "Default-10min-Hotstart.pcl" es el programa más utilizado para múltiplex de una sola célula de RT-qPCR.
7. Seleccione "Inicio Ejecutar". La reacción tarda aproximadamente 90 min.
8. Una vez terminado, seleccione "Expulsar-Hecho".

Análisis de datos 9.

1. Abra el software "Real-Time PCR Análisis", seleccione "Archivo" y "Abrir", busque la carpeta experimento, y seleccione "archivo ChipRun.bml."
2. Haga clic en "Vista de Análisis", "Resultados En la tabla," y "Heat mapa;" casillas marcadas con una "X" están por debajo del nivel de detección de umbral y / o tenido malas curvas de amplificación.
3. Nombre las muestras. Ir a "Configuración de ejemplo" y select "Nueva SBS 96." Haga clic en "Mapping" y seleccione "..." Copiar y pegar el diseño de la disposición de la muestra desde el software de hoja de cálculo. Definir el diseño pegado como "nombre de la muestra."
4. Nombrar los ensayos. Repita el paso 9.3 con los nombres de cebadores en "Configuración del detector." Definir el diseño pegado como "Nombre del Detector."
5. Haga clic en "Vista de análisis" y "Analizar"; los nombres de las muestras y de cebadores se pueden atribuir automáticamente a las muestras y los cebadores (Figura 7).
6. Calcula Ct, Delta Ct, y el doble cambio para cada muestra. Use un gen de mantenimiento como control interno (en este caso, GAPDH):
   Ct = Ct _{de la muestra} - _{control interno} Ct
   Doblar el Cambio = 2 ^{- (control ΔCtsample-ΔCtnegative)}
   1. Haga clic en "Configuración del detector" y seleccione el pozo sin control de entrada (utilice la limpieza de genes como un control interno para normalizar la expresión génica). Seleccione "EDitor "," definir referencia "y" Actualizar ".
   2. Seleccionar todos los pozos a los cuales se aplicará el control interno definido anteriormente. Seleccione "Editor" y "definir como prueba." Seleccionar un gen de referencia adecuado y haga clic en "Update".
   3. Seleccionar "Configuración de ejemplo" para seleccionar bien el control negativo. Seleccione "Editor" y definir "de referencia". Haga clic en "Update".
   4. Seleccione "Vista de Análisis" y "Analizar"; el Delta Ct y el cambio veces se calculará automáticamente.
7. Exportar los datos. Seleccione "Archivo" y "Exportar, guardar como" Resultados de la mesa ", seleccione la carpeta de destino, y pulsa" Guardar "y" Salir ".
8. Repita el paso 9.7, pero en lugar de "Resultados de la mesa," Guardar como "HeatMap resultados."

poblaciones linfoides muestran una gran diversidad en la expresión génica. En este protocolo, la heterogeneidad hígado compartimento ILC se investigó utilizando multiplex de una sola célula de la expresión génica por RT-qPCR. A diferencia de otras técnicas de expresión génica, multiplex de una sola célula de la expresión génica por RT-qPCR permite el trabajo en varias poblaciones, incluso los más raros, al mismo tiempo. Esta especificidad, junto con una alta sensibilidad a nivel clonal, permite la investigación de las diferencias en las firmas genéticas dentro de una población y entre poblaciones raras. A modo de ejemplo, se evaluaron las firmas genéticas de las poblaciones de la CDI 3 de los hígados de los ratones 4 semanas de edad. Una población es lo suficientemente frecuentes como para ser fácilmente identificado, mientras que los otros dos son raras (menos del 1% de las células de linaje negativo) en el hígado.

Una placa de clasificación de 96 pocillos de una sola célula y una placa de ensayo de 96 pocillos se prepararon antes de dissectio hígadon y disociación (Figura 1). Cada mezcla se preparó bajo una campana estéril y se distribuye con una pipeta electrónica de precisión y reproducibilidad del volumen. Todos los reactivos se agitaron antes de pipetear para mantener la homogeneidad. Después de la preparación, la placa de clasificación de células de 96 pocillos se puede congelar hasta clasificación de células, y la placa de ensayo de células de 96 pocillos se puede congelar hasta IFC carga.

Los hígados fueron disecados y se disociaron en suspensiones de una sola célula. Las células se tiñeron y se clasifican en descongeladas placas de clasificación de una sola célula 96 pocillos. El uso de FACS, 3 poblaciones de la CDI se ordenan en función de los marcadores de la CDI ampliamente expresados (Figura 2). Después de la clasificación de células, se sintetizó ADNc, y genes diana específicos fueron amplificados (Figura 3 y Tabla 2). Después de la etapa de pre-amplificación, el ADNc se diluyó en tampón de baja EDTA TE. Los cebadores y ADNc de células individuales se cargaron en el chip IFC (Fifiguras 4 y 5a). Se simplificaron los resultados obtenidos (Figura 7a) para facilitar la lectura y el análisis (Figura 7b). Ejemplos de chips de bien o mal cargados se muestran (Figura 5). Se muestra una figura FAM de un chip cargado correctamente (Figura 6) con diferentes señales de amplificación.

Los resultados muestran que después de la clasificación apropiada de células, pre-amplificación, y la carga, la población ILC aparece heterogéneo para la expresión génica en el hígado de ratones de tipo salvaje adultos (Figura 7). El uso de software en línea, firmas de expresión de genes específicos de células (Figuras 7 y 8) y las relaciones entre población celular (Figura 8) se pudo identificar. Cada población ordenados tiene una firma gen específico enriquecido en la expresión génica. Por ejemplo, las células ordenadas como NKp46 ^- IL-7Rα ⁺ disponen de correonriched expresión del RORC, el principal factor de transcripción del grupo 3 CIL; Rora, un factor de transcripción -homologous RORC; e IL-23R y CXCR6, dos receptores importantes del grupo 3 marcadores hepáticos CIT en el hígado. Las mismas observaciones se pueden hacer con NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- y poblaciones NKp46 ⁺ IL-7Rα ^+. Cada célula está marcada para la expresión de genes de limpieza (HPRT, Ley, y GAPDH) para excluir los pozos no válidos; al menos dos genes de limpieza deben expresarse a considerar los valores como válido.

Curiosamente, esta técnica permite la definición de dos subpoblaciones de NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- sobre la base de firmas de genes. Las diferencias entre estas dos firmas tienen que ser validados por otros conjuntos de diferentes experimentos funcionales.

Figura 2: Estrategia de células FACS. Las imágenes son representativas de las células hepáticas aisladas de ratones 4 semanas de edad. (A) FSC-A / SSC-Una compuerta, la discriminación doblete (b) FSC-H / W-FSC, (c, d, ye) vivos, CD45.2 linaje negativo CD4 ^{+ -} CD3 ^- células gating. (F) El uso de marcadores de la superficie celular de la CDI ampliamente expresadas, definimos 3 poblaciones: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ^+, y NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: figuras de ROX correctamente (una) E impropiamente (b) cargado fichas. (A) de chips múltiplex de expresión de genes de una sola célula correctamente cargado debería aparecer con líneas rectas y filas. Cada cámara de reacción se llena y tiene la misma dimensión. (B) que haya sido cargado una sola célula múltiplex de chips de expresión genética. Las líneas vacías y las filas de cámaras de reacción aparecen (cuadrado verde), así como las líneas de plegado (cuadrados azules). Estas características pueden ser debido a la inadecuada "PRIME" o pasos de "carga", así como a las burbujas residuales en los pozos de la CFI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: FAM (fluoresceína amidita) figura de un chip cargado correctamente. Después de unos pocos ciclos (dependiendo de las muestras y en el cebador s evaluado), deben aparecer diferencias en el brillo cámara de reacción. Las cámaras de reacción con una señal de amplificación deben aparecer más brillante (cuadrado azul) de las cámaras de reacción sin o con señales de amplificación bajas (cuadrado verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Mapa de calor obtenido antes (A) y después (B) modificaciones. (A) un mapa de calor directo obtenerse sin análisis o la modificación de la orden de ensayo / muestra. (B) un mapa de calor modificada obtenida después de la muestra de ensayo y nombre de la definición. No hay pozos de entrada (cuadrados azules) se obtienen si no se produce la amplificación. cebadores ineficientes (cuadrado verde). ensayo de dilución de cDNA (púrpura cuadrados). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Una sola célula agrupación población. Un software de análisis de datos se utiliza para determinar la agrupación entre poblaciones. El software libre agrupamiento están disponibles en línea. Mediante la evaluación de todo el perfil de expresión de una sola célula, el software puede mostrar firmas de genes y relaciones población celular. Cada cuadrado representa una célula: azul son NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, rojo son NKp46 ⁺ IL-7Rα ^+, y verde son NKp46- IL-7Rα ^+. Cada población tiene una firma gen específico. Dentro del NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- población, dos firmas se pueden ver, lo que demuestra la heterogeneidad de la población.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de Primer.

Tabla 2: Programa de pre-amplificación. Cada paso del programa pre-amplificación se muestra con la información completa sobre el tiempo, la temperatura, y el número de ciclos.

Este protocolo se describe cómo obtener información exhaustiva de la expresión génica a nivel clonal. A continuación, se investigó la heterogeneidad de hígado CIT compartimento. Después de la clasificación de una sola célula de diferentes poblaciones de la CDI (basados ​​en marcadores de la superficie de la CDI ampliamente expresados), las muestras fueron pre-amplificadas por los genes preseleccionados específicos. Entonces, el ADNc y los cebadores obtenida se cargaron en un chip microfluídico multiplex RT-qPCR. Por último, se obtuvo la expresión de 48 genes diferentes de 48 células individuales. Gene resultados de la expresión se analizaron por medio de un software en línea para investigar las relaciones de la firma de genes y la población celular.

La principal ventaja de esta técnica es la capacidad para evaluar la expresión de múltiples genes al mismo tiempo. También permite el trabajo a nivel clonal y en poblaciones muy raros. A diferencia de los métodos de RT-qPCR convencionales, múltiplex de una sola célula de RT-qPCR no tiene ningún efecto de promedio, ya que la expresión génica se evalúa a nivel clonal. Así, La heterogeneidad dentro de una población puede ser detectado y analizado. Una sola célula de expresión de RT-qPCR permite trabajar en poblaciones muy raros, ya que sólo se necesitan muy pocas células para obtener información amplia sobre la expresión génica. Por otra parte, las diferentes poblaciones de células pueden ser probados en la misma placa. Esto permite la detección de diferencias en la firma de genes entre poblaciones y, con herramientas de datos en línea, la evaluación de las relaciones entre población celular. Esta técnica presenta otras ventajas también. múltiplex de una sola célula de RT-qPCR tiene la ventaja de los avances recientes de microfluidos. Volúmenes necesarios en las cámaras de la CFI no superan el nivel de nanolitros. Por lo tanto, se usan cantidades más bajas de los reactivos, lo que reduce el costo de experimentos. Por último, el número total de pasos de pipeteado se reduce, lo que limita la posibilidad de errores de pipeteo. Los pasos son simultánea para todas las células y se pueden hacer con una pipeta multicanal, lo que permite el trabajo de una manera rápida y con ahorro de tiempo. Los resultados obtenidos enel nivel clonal son reproducible, fiable, y se puede utilizar para llevar a cabo los análisis de datos robusta.

múltiplex de una sola célula de RT-qPCR, sin embargo, presenta algunas limitaciones. En primer lugar, esta técnica requiere equipo caro y específico, tal como un chip de microfluidos, un controlador de chip microfluídico, y un termociclador específico. A diferencia de los métodos de RT-qPCR convencionales, esta técnica requiere mucho tiempo y ahorro de reactivo, ya que, con convencional RT-qPCR, se necesitan numerosos estudios para obtener comparaciones estadísticamente significativas. En este protocolo, se presenta un procedimiento para obtener la expresión génica de 48 genes. 96-96 chips microfluídicos multiplex RT-qPCR están disponibles. Estos chips pueden evaluar la expresión del gen para 96 ​​genes a partir de 96 células al mismo tiempo. Durante la clasificación de células, se necesita un número mínimo de células de partida, ya que la precisión y la pureza de la celda debe ser máxima. Sin embargo, incluso con un pequeño número de células, todavía es posible ordenar para multiplex de una sola célula RT-qPCR exp genresión (paso 3). Finalmente, multiplex de una sola célula RT-qPCR es un método sensible. Diferentes pruebas deben ser realizadas antes de iniciar este tipo de experimentos. Por ejemplo, para especificidad de la diana del cebador, cebadores deben ser probados para la eficiencia de amplificación y para la competición relativa para el objetivo.

Varias etapas del protocolo deben realizarse con precaución. Las manipulaciones de pequeños volúmenes combinados con un gran número de muestras y ensayos al mismo tiempo aumenta el riesgo de errores de pipeteado (pasos 1, 4, 5, 6, y 7). Todos los reactivos y mezclas deben agitaron en vórtex antes de pipetear el fin de asegurar una solución homogénea. La evaporación durante la pre-amplificación (paso 4) también puede afectar a los resultados finales. Las placas se deberán cerrar correctamente con una película de recubrimiento adecuado. Ordenando estrategia debe ser muy preciso (paso 3) para evitar las células muertas o células múltiples en los pozos dentro de las placas. FACS máquinas de clasificación están ahora equipados con ind de una sola célula de clasificaciónex software que puede registrar qué celda específica se ordena en cada pocillo. Esta nueva herramienta de interés para la determinación de si las firmas de genes se correlacionan con la intensidad de marcador de la superficie celular. De muestras y análisis posiciones en los chips deben ser organizados meticulosamente, ya que esto es esencial para el experimento (pasos 1, 5 y 6). Por último, la selección de los cebadores (paso 1 y 6) es un paso crítico. Cada cebador debe ser seleccionada basándose en los resultados descritos anteriormente o los resultados esperados. Una selección aleatoria de cebadores en el conjunto de genes evaluados podría poner en peligro la lectura final del experimento. Además, los cebadores que se correlacionan con el marcador de la superficie celular utilizado para clasificación de células tienen que ser utilizados como controles con genes de limpieza.

La evaluación de la expresión génica múltiplex a nivel clonal ofrece una mejor caracterización del hígado compartimento heterogénea CIT que en investigaciones previas. Esta técnica, suministrado por software en línea, se describe con mayor precisión el dsubconjuntos ifferent de CIT en el hígado en la homeostasis de los estudios que utilizan sólo los marcadores de la superficie celular. Además, es posible considerar las relaciones entre población celular y para construir redes de diferenciación. Las firmas de genes, a partir de la expresión de genes de una sola célula, también son herramientas importantes para discernir las características de la población celular y para examinar posibles funciones. multiplex de celda única RT-qPCR es una de las mejores técnicas para un ensayo de la expresión de genes para obtener datos fiables. Estos datos son fácilmente manejables con el software de bioinformática ^15. Con respecto a otras técnicas para los estudios de expresión de genes, tales como microarrays o secuenciación de ARN, multiplex de una sola célula RT-qPCR ofrece alta sensibilidad. Otros enfoques para el análisis de una sola célula se han descrito y se pueden utilizar como técnicas complementarias a multiplex de una sola célula RT-qPCR ^{15, 16.} Además, la técnica se puede realizar con cualquier combinación de cebadores, allowing usuarios que miran genes firmas personalizadas. Muchas otras aplicaciones se pueden utilizar con esta técnica. Por ejemplo, del curso del tiempo de la expresión génica de las células en todo el desarrollo se puede hacer para evaluar la modificación del perfil molecular durante el desarrollo. Los efectos del fármaco sobre las células también pueden ser investigados con dilución de fármaco para determinar el umbral de la eficacia de drogas en la expresión génica.