Isolering och Kryokonservering av neonatala råttkardiomyocyter

Cell kultur av hjärtmuskelceller är ett viktigt verktyg inom modern hjärtforskning. Neonatal råttkardiomyocyter (NRCMs) används vanligtvis eftersom isoleringen och kultur är lättare än för vuxna råttkardiomyocyter ^en. Den NRCM metoden har fortfarande flera begränsningar, inklusive en lång isoleringsförfarande och begränsad celltillväxt i skålen. Det finns många protokoll för isolering av NRCMs med mest allmänt kräver 4-48 tim arbete ^2-6. Dessutom är cellerna ofta isoleras från 1 till 2 dagar gamla råttungar ^2,4-7; tidpunkten för födseln kan vara oförutsägbara och konflikt med annat arbete i labbet. De isoleringar kan vara ineffektivt och oekonomiskt om endast en liten mängd celler som behövs för experiment. De flesta ansträngningar på att förbättra arbetsflödet fokus på att minska isoleringen tiden, men detta löser inte problemen med tids födelsen av valparna.

Som alternativ, många laboratorier utnyttjarkardiomyocyter härledda från embryonala stamceller (ESCS) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Emellertid kan omprogrammering och / eller differentiering processen vara mycket tidskrävande och kostsamt också. Det kan finnas andra problem när du använder dessa celler som in vitro myocyt modeller. Både ESC- och iPSC- härledda hjärtmuskelceller har visats uppvisa skillnader i elektrofysiologi från primära kardiomyocyter ^8-10.

Dissocierade NRCMs är kan lagras i flera dagar med kylning ^11, men detta gör det möjligt för långtidsförvaring. Flytande kväve används typiskt för att bevara celler under en längre tidsperiod, men kräver ett kryoskyddsmedel såsom dimetylsulfoxid (DMSO). Tidigare forskning har visat att den ideala koncentrationen mellan 5-10% DMSO i frysmedier möjliggör frysförvaring av NRCMs, men även då lönsamheten är fortsatt låg ^12. Även DMSO skyddar cellerna under frizing, kan det vara toxiska för celler vid koncentrationer över 1,5% ^13. Tidigare studier har visat att långsamt avlägsna DMSO från cellerna, kan förbättra cellviabilitet ^14.

Vi sökte att förbättra effektiviteten i NRCM cellbaserade analyser genom cryopreserving cellerna efter isolering. Detta möjliggör för cellerna att tinas och användas när det är nödvändigt, vilket minskar frekvensen av isoleringar och konsumtion av djur. Med användning av denna metod, visar vi att det är möjligt att cryopreserve NRCMs och tina dem för användning vid ett senare tillfälle. Efter upptining cellerna bibehålla en acceptabel lönsamhet och producera NRCM kulturer som är positiva för α-sarcomeric actinin (α-SA) och kontrakts spontant.

Följande protokoll är avsedd för isolering av hjärtmuskelceller från en kull med neonatala råttungar (10-14 PUP). Om kullstorlek är väsentligt annorlunda, kan proceduren behöva skalas för att kompensera. Valparna bör vara cirka 48 ± 6 tim gammalt. Alla förfaranden häri har godkänts av North Carolina State University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Cell Isolering Förberedelse

OBS: Utför följande steg dagen före isolering.

1. Autoklav följande: stora saxar, små saxar, små vassa pincett, stora pincett. Använd en gravitationscykel för 60 minuter vid minst 121 ° C och en torktid av 30 minuter.
2. Häll 40 ml 0,1% trypsin lösning i kylskåp för att tina O / N. Refrigerate Hanks Balanced Salts Solution (HBSS), om inte redan kall. Bered en 20% fetalt bovint serum (FBS) lager medielösning.
   1. I 400 ml Iscove modifierade Dulbeccos medium (IMDM) tillsätt 100 ml FBS, 5 ml L-glutamin (200 mM), 2,5 ml gentamicin (10 mg ml ^-1), och 0,9 ml 2-merkaptoetanol. Sterilisera använder vakuumfilter. Butiks medier vid 4 ^{° C} i upp till 3 veckor och det är skalbar för mindre eller större volymer. Späd 20% FBS lager media 1: 1 med IMDM att producera 10% FBS NRCM medier. Endast göra i små satser för att förhindra upprepade uppvärmning och kylning av media.

2. Cell Isolering Dag 1

1. Utför följande arbeten i en kultur huva för att förhindra förorening av proven. För bästa tidpunkten påbörja detta arbete på eftermiddagen eftersom det finns en O / N-inkubering.
2. Förbered arbetsyta i en steril kultur huva. Placera bänkdyna i kultur huva. Fyll två 250 ml bägare med 70% etanol och placera kirurgiska verktyg i dem. Placera liten hink is i huva. Se till att det är tillräckligt stort för att rymma flera rör och en 150 mm skål. UV sterilisera huven for 10 min. Placera 40 ml 0,1% trypsin på is.
3. Hämta neonatala råttungar från mamman. För att hålla djuren varma fram till användning, placera dem i en isolerad behållare såsom en ishink insvept i en bänk pad för att hålla dem varma.
4. Fyll en 150 mm odlingsskål med 25 ml HBSS och placera på is. Packa 2-3 gasbinda kuddar och plats i arbetsområdet. Innehav valp av huden på baksidan av halsen, spraya den med 70% etanol och placera i huvan. OBS: För att bäst bevara steriliteten, detta kan göras av en annan person som sedan placerar rengjorda valpen i huven.
5. Håll valpen av huden på baksidan av halsen. Sedan använda de stora saxar, i en snabb, stark nedskärning avliva genom halshuggning. Blot blodet med gasbinda. OBS: På grund av variationer i IACUC krav, kan det vara mer lämpligt att rengöra valpen med en etanol torka snarare än besprutning. Var noga med att kolla med universitetet IACUC om sina riktlinjer för detta steg.
6. Fortsätt skära ner främre sidan av lmest genom bröstkorgen. Kläm huden på halsen för att hjälpa till att öppna bröstkorgen tills hjärtat är synlig. Med hjälp av en liten sax, ta bort hjärtat och plats i HBSS odlingsskålen på is. Upprepa för de andra valparna.
7. Ta bort alla icke-hjärtvävnad från proverna och snurra HBSS försiktigt tvätta hjärtan. Överför hjärtvävnaden till en annan kultur maträtt som innehåller färsk HBSS och tvätta vävnaden vidare. Skär vävnaden ytterligare tills bitarna är 1-3 mm ^3, och sedan överföra till trypsinlösning. Placera trypsinlösning på rocker i 4 ^{° C} kylskåp O / N.

Cell Isolation Dag 2

OBS: Medan aspire i följande steg, använd en pipett snarare än en vakuumledning. Vävnaden rör sig lätt, och en vakuumledning kommer att täppa till eller ta bort vävnad som fortfarande innehåller celler. Det är bäst att använda en pipett för aspiration istället. Om vävnad in i pipetten, pipetten backa ut för att ta bort den.

1. Gör tRE portioner av 10% NRCM Media: en med 25 ml och två med 15 ml. Placera en 25 ml tub av media i 37 ° C vattenbad. Lägg 4 ml HBSS till 5 olika 15 ml koniska rör och placera alla på is. Märk varje 15 ml tub # 1-5.
2. Lägg 40 ml HBSS till en 50 ml koniska rör. Tillsätt 10 ml HBSS att kollagenas, pipett att avbryta, och kombinera de lösningar för att skapa 50 ml 1 mg ml ^-1 kollagenas lösning. Sterilisera med ett 0,22 ^ m vakuumfilter, och förvara vid RT.
3. Hämta hjärtvävnad / trypsin rör. Se till att trypsin är tydligt, och vävnaden verkar fluffigt. Låt vävnaden sedimentera till hörnet av röret och aspirera så mycket vätska som möjligt.
4. Lägg 25 ml varm 10% FBS NRCM medier till röret och virvla runt för hand. Cap och roterar i 37 ° C vattenbad i två minuter. Aspirera vätskan igen. Vävnaden bör flyta i detta steg; om så är fallet, aspirera från botten av röret.
5. Lägg 10 ml kollagenas. Rotera i vattenbad under två minuter eller tills lösningen är grumlig. Quickly aspirera vätska. Lägg 10 ml färskt kollagenas till rör innehållande vävnaden och rotera i vattenbad under 2 minuter. Pipett för att blanda, överföra lösningen till röret # 1, och placera på is. Det kanske inte är möjligt att ta bort all vätska. Upprepa steg 3,2-3,6 för de andra tre 15 ml koniska rör. Överför eventuell kvarvarande vätska till röret # 5.
6. Centrifugera 15 ml rör vid 410 RCF i 8 min. Medan centrifugering, placera 15 ml 10% FBS NRCM mediaröret i vattenbadet. Placera 40 um cell sil ovanpå en 50 ml koniska rör och våt med 2 ml kall HBSS.
7. Sug ut supernatant från spunnet ned celler. Lägg 6 ml kall HBSS till varje rör och återsuspendera. Pipettera cellsuspensioner genom silen in i 50 ml koniska för att avlägsna eventuell vävnad. Skölj sidor av varje 15 ml rör med 3 ml kall HBSS och lägga till sil. Centrifugera cellerna vid 410 RCF i 10 minuter. Sug ut supernatant. Resuspendera cellpelleten i 10 ml 10% FBS NRCM media och överföring till T-75-kolv. Skölj konisk med 5 ml media och lägga till flfrågar.
8. Inkubera i 1 h vid 37 ° C och 5% _CO2. Placera senaste 15 ml 10% FBS NRCM mediaröret i vattenbadet. Överför innehållet i T-75 till en ny T-175 kolv och skölj T-75 med 15 ml medium och lägga till T-175. Inkubera under en timme.

4. Frysförvaring

1. Placera frysmedier på is. Överför cell media från T-175-50 ml koniska rör, och samla 10 pl av cellsuspension för cellräkning med hjälp Trypanblått. Centrifugera vid 410 RCF i 5 min. Medan centrifugering, räkna celler med hjälp av en cellräknare.
2. Sug odlingsmedia, och återsuspendera cellerna i frysmedier i en koncentration på 2-4 miljoner celler per ml. Placera 1 ml cellsuspension i kryogen flaskan, sedan plats Flaskor kontrollerad kylningshastighet frysning container, och plats i -80 ° C frys O / N. Inom 1-2 dagar, överför flaskor i flytande kväve.

5. Upptining Celler

1. Coat skålen i fibronektin genom att lösa 250 ^60; av fibronektin (aktiekoncentration 1 mg ml ^-1) i 9,75 ml vatten (slutlig koncentration 0,025 mg ml ^-1). Tillsätt tillräckligt lösning för att täcka odlingsplatta och inkubera vid 37 ^° C under minst 30 min.
   1. I fyra 15 ml koniska rör, gör DMSO / media blandningar enligt följande genom att lägga DMSO till 20% Media. Tillsätt (5%) 9,5 ml medium med 500 | il DMSO. Lägg (2,5%) 9,75 ml media med 250 pl DMSO. Tillsätt 10 ml media (gör två av dessa).
2. Värm ovannämnda medieblandningar i 37 ° C vattenbad. Ta bort celler från flytande kväve och placera på torris. När media blandningar är varm, tina cellerna i 37 ° C vattenbad tills precis tinat. Lämna inte celler i vattenbad för länge eftersom det kan skada cellerna.
3. Överför innehållet i kryogen flaska till 5% DMSO / media röret. Centrifugera vid 410 RCF i 8 min. Sug ut supernatant lämnar cellpellet. Tillsätt innehållet i 2,5% DMSO / mediaröret till cellpelleten och resuspend. Centrifugera vid 410 RCF i 8 min. Sug ut supernatant lämnar cellpellet.
4. Lägg innehållet i en 0% DMSO / media röret till cell pellets och resuspendera. Centrifugera vid 410 RCF i 8 min. Sug ut supernatant lämnar cellpellet.
5. Lägg innehållet i andra 0% DMSO / media till cellpelleten och resuspendera. Ta litet urval för cellräkning. Centrifugera vid 410 RCF i 8 min. Medan centrifugering räkna celler i ett haemocytometer använder trypanblått att märka döda celler. Record cellbelopp, samt lönsamhet.
6. Sug ut supernatant lämnar cellpellet. Resuspendera i 10% NRCM media (tillval: lägg 100 iM bromodeoxiuridin (BrdU)) och platt celler på fibronektinbelagda rätter.

6. Cell Culture

1. Plate celler vid ca 100k celler per ^cm2. Justera plätering tätheten baserad på den avsedda användningen av kulturen. Bered 2% NRCM medier genom att späda 20% Media i IMDM i ett 01:10 förhållande. Följande är en skiss av en typisk kultur. </ Li>
2. Dag 1, skölj döda celler bort med varmt IMDM, lägg 10% NRCM (tillval 100 iM BrdU). På dag 2, skölj döda celler bort med varmt IMDM, lägg 10% NRCM. Dag 3-tillsätt 2% NRCM. På dag 4 tillsätt 2% NRCM. På dag 5 se till att cellerna är sammanflytande och misshandeln. Behåll celler i kultur för cirka en vecka. Vid den tidpunkten fibroblaster kan börja betydligt växa ur de NRCMs.

Efter isolering av de neonatala råttkardiomyocyter cellerna fryses ner till flytande kväve, och kan lagras under minst flera månader. Typiskt vid tining, kommer lönsamheten bestäms av trypanblått-analys vara mellan 40-60%. Även om detta är lägre än andra celltyper, med ordentlig sådd och kultur cellerna kommer föröka (Figur 1). För att verifiera kontraktilitet kan cellerna avbildas med en faskontrastmikroskopi. Cellerna bör börja spontant kontrakt inom cirka tre dagar (Figur 2). För immunocytokemi (ICC) assayer spreds cellerna i 4-brunnars odlingsobjektglas med 200.000 celler per brunn. För att visa att cellerna i odling är NRCMs märktes cellerna med α-SA och avbildas med fluorescensmikroskopi. Det finns många α-SA positiva celler indikerar NRCMs i kulturen (Figur 4). Andra experiment har utförts inkluderande culturerings NRCMs med humana hjärtstamcellsderiverade exosomes att testa regenerativa egenskaper exosomes (Figur 5).

Figur 1. NRCM Proliferation in vitro. Fluorescensmikroskopi bild av NRCM med färgning för α-SA (grön), Ki67 (röd), och DAPI (blå) för både (A) nyligen isolerade NRCMs och (B) frysförvarade sedan tinade NRCMs. Pilar indikerar celler som förökar (Ki67-positiv). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Sammandragning av kryokonserverade och tinades NRCM in vitro. NRCMs spontanegare upphandlande in vitro. Till skillnad från nyligen isolerade NRCMs, kan det ta ett par dagar innan kontraktilitet återvinns. Video registrerades fem dagar efter upptining. Klicka här för att se filmen.

Figur 3. Sammandragning av nyligen isolerade NRCM In Vitro. Nyligen isolerade NRCMs spontant upphandlande in vitro. Dessa celler kommer att börja uppvisa kontraktilitet mycket tidigare. Video registrerades 3 dagar efter isolering. Klicka här för att se filmen.

Figur 4. renhet NRCM kultur. </ Strong> fluorescensmikroskop bilder av både (A) nyligen isolerade NRCMs i kultur och (B) frysförvarade och tinade NRCMs efter 5 dagar i kultur. NRCMs visar positiv färgning för α-SA (grön), medan fibroblaster kan ses där kärnor (blå) inte är omgivna av α-SA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Användning av upptinad NRCM för cellbaserad analys. Konfokalmikroskopi bild av NRCMs, markeras av α-SA (grön), odlades med Dil-märkta exosomes (röd) från hjärtstamceller. Cellkärnor märkta med DAPI (blå). För att skapa en oxidativ stressmodell har NRCMs behandlades med 100 | iM väteperoxid under 18 h, innan den inkuberas med exosomes för 4 timmar för att vända den oxidativa stressen. Pilar indikerar regioner av höga Exosome koncentrationer i vissa celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Detta protokoll möjliggör för NRCMs skall isoleras, frysförvarade, och tinas. Upptining av cellerna är en avgörande del av förfarandet. En serie DMSO utspädningar används för att sakta ut DMSO från cellerna ^14. Det är viktigt att extraktionen av DMSO utföras snabbt när cellerna är särskilt känsliga för att dö omedelbart efter upptining. Om fler eller färre celler erfordras för upptining, kan volymerna av DMSO-lösningar skalas efter behov.

En utmaning till NRCM isolering och odling är den snabba proliferationen av fibroblaster. Detta protokoll använder preplating som har visat sig minska antalet fibroblaster ^15. Preplating verk genom att använda obelagda kolvar till vilka fibroblaster fäster mycket snabbare än kardiomyocyter. Sekvensen av förändringar medie kan förändras för att reducera fibroblasttillväxt. Fibroblaster växer ur NRCMs i 10% NRCM media, men fibroblasttillväxt är betydligt långsammare i 2% NRCM Media. Det finns andra metoder såsom Percoll gradienter för att ta bort fibroblast före plätering ^16,17 eller tillägg av BrdU att bromsa fibroblasttillväxt ^3. Överdriven fibroblasttillväxt kan vara svårt att upptäcka med hjälp av fas mikroskopi, men är lätt visas med hjälp NRCM specifik färgning såsom α-SA (Figur 3). Om det fortfarande alltför fibroblasttillväxt, kan mängden FBS i media minskas till 2% FBS dag 2. Vid behov kan plätering göras i 5% FBS media, även om detta kan leda till ökad celldöd.

Detta förfarande är begränsad och inte längre fördelaktigt om du använder cellkulturer som kräver stora mängder celler ^18,19. I de fall där mängden celler som behövs närmar sig halv mängd celler möjliga att skörda från en kull, kommer detta förfarande kräver fler djur eftersom ungefär hälften av cellerna går förlorade på grund av frysförvaring. Fördelarna med frysförvaring är större när man använder färre cells för analyser såsom immunfärgning.

Detta protokoll illustrerar de metoder för isolering, frysförvaring, och efterföljande av NRCMs. Det finns få alternativ, som att köpa frysta celler från leverantörer, för att använda denna metod, men köper celler kan kosta oöverkomliga för vissa laboratorier. Våra metoder kräver endast material och reagens som vanligen används i cellkultur. Dessutom använder dessa metoder kan öka effektiviteten och flexibiliteten i laborationer och samtidigt minska användningen av försöksdjur. De beskrivna metoderna producera viabla kulturer som kan användas för efterföljande in vitro-studier.