분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

심근 세포의 세포 배양 현대 심장 연구에 중요한 도구입니다. 신생아 쥐의 심근 세포 (NRCMs)는 일반적으로 분리 이후 사용되며 문화는 성인 쥐의 심근 세포 ^1보다 쉽다. NRCM 방법은 여전히​​ 접시에 오래 격리 절차 및 제한 세포 증식 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 가장 일반적으로 작업 ^2-6의 4-48 시간을 필요로와 NRCMs의 분리를위한 다양한 프로토콜이있다. 또한, 세포는 종종 2 일된 래트 새끼 ^2,4-7를 1에서 분리된다; 출생의 타이밍은 실험실에서 다른 작업과 예측 불가능하고 충돌 할 수 있습니다. 세포의 소량 만이 실험을 위해 필요한 경우 아이솔레이션은 비효율적이며 소모적 일 수있다. 분리 시간을 줄이는 데 초점 흐름을 개선 대부분의 노력은 아직이 새끼의 탄생을 타이밍의 문제를 해결하지 못한다.

대안으로, 많은 실험실 활용배아 줄기 세포 (는 ESC) 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)로부터 유도 된 심근 세포. 그러나, 리 프로그래밍 및 / 또는 분화 과정은 매우 시간 소모 및 비용을 또한 할 수있다. 체외 심근 모델로 이들 세포를 사용하는 경우 다른 문제가있을 수 있습니다. 두 ESC-및 심근 유래 iPSC- 1 차 심근 ^8-10 전기 생리학에서의 차이를 나타내는 것으로 나타났다.

해리 NRCMs 냉장 ^11을 사용하여 몇 일 동안 저장 될 수있는, 그러나 이는 장기 저장을 허용 않는다. 액체 질소는 일반적으로 더 큰 시간 동안 세포를 보존하기 위해 사용되지만, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 등의 동결 방지제 등을 필요로한다. 이전 연구는 동결 미디어의 5 ~ 10 % DMSO 사이의 이상적인 농도가 NRCMs의 냉동 보존을 허용 것을 보여 주었다, 그러나 그렇다하더라도 가능성은 낮은 ^12로 유지됩니다. DMSO는 무료 동안 세포를 보호하는 데 도움이되지만열정, 그것은 1.5 % ¹³ 위의 농도에서 세포 독성이있을 수 있습니다. 이전 연구 천천히 DMSO를 세포로부터 제거, 세포 ^생존을 개선시킬 수있다 ⁽¹⁴⁾ 것으로 나타났다.

우리는 다음과 같은 격리 cryopreserving NRCM 세포에 의한 세포 - 기반 분석의 효율성을 개선하기 위해 노력했다. 이는 세포가 해동 필요한 절연 부 및 동물의 소비의 주파수를 감소 할 때 사용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는를 NRCMs cryopreserve 및 나중에 사용하기 위해 해동시킬 수 있음을 보여준다. 해동 후 세포 수용 가능성을 유지하고 자발적으로 α-sarcomeric 티닌 (α-SA)와 계약에 대한 긍정적 NRCM 문화를 생산하고 있습니다.

다음 프로토콜은 신생아 쥐 새끼 (10-14 새끼)의 한 쓰레기에서 심근 세포의 분리를 위해 설계되었습니다. 쓰레기의 크기가 현저하게 다른 경우, 절차는 보상을 확장 할 필요가있다. 새끼는 약 48 ± 6 시간 이전이어야한다. 모든 절차가 여기에 노스 캐롤라이나 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 세포 격리 준비

참고 : 분리하기 전에 다음 단계 일을 수행합니다.

1. 큰 가위, 작은 가위, 작은 날카로운 집게, 큰 집게 다음을 압력솥. 121 ° C의 최소 30 분의 건조 시간을 60 분 동안 중력 사이클을 사용한다.
2. / N을 O를 해동 냉장고에 0.1 % 트립신 용액 40ml를 놓습니다. 냉장 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 이미 감기 아니라면. 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 스톡 미디어 솔루션을 준비.
   1. 단락 전류의 400 mL에비켜의 수정 된 둘 베코의 미디어 (IMDM)는 100 ML의 FBS 5 ML의 L 글루타민 (200 mM)을 2.5 ml의 겐타 마이신 (10 ㎎ ml의 ^1), 0.9 ml의 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. 진공 필터를 이용하여 멸균. 저장 최대 3 주 동안 4 ^℃에서 미디어와이 작거나 큰 볼륨의 확장이다. 10 % FBS NRCM 미디어를 생산하는 IMDM와 1 : 20 % FBS 스톡 미디어 1을 희석. 만 반복 가열 및 미디어의 냉각을 방지하기 위해 작은 일괄 적으로 확인합니다.

2. 세포 분리 1 일

1. 시료의 오염을 방지하기 위해 배양 후드에서 다음 작업을 수행한다. O / N 배양이 있기 때문에 최적의 타이밍의 경우 오후에이 일을 시작합니다.
2. 멸균 문화 후드 내부 작업 공간을 준비합니다. 문화 후드에서 벤치 패드를 놓습니다. 70 % 에탄올로 두 250ml의 비커를 입력하고 그들에 수술 도구를 배치합니다. 후드에서 얼음의 작은 양동이를 놓습니다. 그것은 여러 튜브와 150mm 접시를 개최 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. FO 후드를 살균 UVR 10 분. 얼음에 40 ml의 0.1 % 트립신을 놓습니다.
3. 어머니로부터 신생아 쥐 새끼를 검색합니다. 사용할 때까지 따뜻한 동물을 유지하기 위해, 예를 따뜻하게 유지하는 벤치 패드에 싸서 얼음 양동이로 절연 컨테이너에 배치합니다.
4. 25 ml의 HBSS와 150mm 배양 접시를 입력하고 얼음에 배치합니다. 포장을 벗긴 2-3 거즈 패드와 작업 영역에 위치. 목에의 뒷면에 피부가 강아지를 잡고 후드에서 70 % 에탄올과 장소를 스프레이. 주 : 최상의 무균 상태를 유지하려면,이 후 후드 청소 강아지를 배치 다른 사람에 의해 수행 될 수있다.
5. 목에의 뒷면에 피부가 강아지를 잡으십시오. 그런 다음 잘린 안락사 한 빠르고 강력한 컷, 큰 가위를 사용하여. 거즈와 혈액을 오 점. 주 : IACUC 요건 분산하기 위해서는 에탄올 강아지 청소 더 적절할 수도 그것으로 인해 분무보다는 와이프. 이 단계에 대한 자신의 가이드 라인과 대학 IACUC 확인해야합니다.
6. 채널의 전방 측면을 자르고 계속흉곽을 통해 동부 표준시. 마음이 보일 때까지 흉곽을 열 수 있도록 목에 피부를 짜내. 작은 가위를 사용하여 얼음에 HBSS 배양 접시에 심장과 장소를 제거합니다. 다른 새끼에 대해 반복합니다.
7. 샘플에서 비 심장 조직을 제거하고 마음을 씻어 부드럽게 HBSS 소용돌이 친다. 신선한 HBSS 포함하는 다른 배양 접시에 심장 조직을 전송하고 더 조직을 씻는다. 조각 1-3mm ³ 때까지 더 조직을 절단 한 후 트립신 용액에 전송할 수 있습니다. 4 ^{° C} 냉장고 O / N에서 로커에 트립신 솔루션을 놓습니다.

세포 분리 2 일

주 : 다음 단계로 흡인하면서, 진공 라인보다는 ​​피펫을 사용한다. 조직은 쉽게 이동시키고, 진공 라인은 막힘 또는 세포를 포함하는 조직을 아직 제거 할 것이다. 대신 포부 피펫을 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다. 조직 피펫을 입력하면, 피펫을 제거 철회.

1. t 확인10 % NRCM 미디어하는 hree 분량 : 15 ml를 25 mL를 하나, 둘. 37 ° C의 물을 욕조에 미디어의 한 25 ML 튜브를 놓습니다. 5 가지 15 ML 원뿔 튜브에 4 ml의 HBSS를 추가하고 얼음에 모두 배치합니다. 각 15 ml의 튜브 # 1-5 레이블.
2. 50 ML 원뿔 관에 40 ml의 HBSS를 추가합니다. HBSS 10 ml의 일시 중단, 피펫을 콜라에 추가, 50 ml의 1 mg의 ml의 ^-1 콜라겐 솔루션을 만드는 솔루션을 결합한다. 0.22 μm의 진공 필터를 사용하여 소독하고, 실온에서 보관하십시오.
3. 심장 조직 / 트립신 튜브를 검색합니다. 그 확인 트립신 맑아 조직 무성 나타난다. 조직 튜브와 흡인의 코너에 많은 액체 가능한 정착하도록 허용합니다.
4. 손으로 튜브와 소용돌이에 25 ml의 따뜻한 10 % FBS NRCM 미디어를 추가합니다. 캡 및 2 분 동안 37 ° C까지 수조에서 회전한다. 다시 대기음 액체. 조직이 단계에서 부유한다; 그렇다면, 튜브의 바닥에서 흡 인물.
5. 10 ml의 콜라겐을 추가합니다. 2 분 동안이나 솔루션이 흐린 때까지 물을 욕조에 돌립니다. 숨어ickly 액체를 대기음. 조직을 포함하는 튜브에 10 ml의에게 신선한 콜라게나 제를 추가하고 2 분 동안 물을 욕조에 회전. 피펫, 튜브 # 1에 전송 솔루션을 혼합하고 얼음에 배치합니다. 그것은 모든 액체를 제거하는 것이 가능하지 않을 수있다. 반복하여 다른 세 15 ML 원뿔 튜브에 대한 3.2-3.6 단계를 반복합니다. 튜브 # 5에 남아있는 액체를 전송합니다.
6. 원심 분리기 8 분 410 RCF에서 15 ml의 튜브. 원심 분리하는 동안 물을 욕조에 15 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 관을 배치합니다. 40 μm의 세포 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너 2 ml의 차가운 HBSS 젖은 놓습니다.
7. 스핀 다운 세포에서 대기음 뜨는. 각각의 튜브에 resuspend 6 ml의 차가운 HBSS를 추가합니다. 50 ML 원뿔에 스트레이너를 통해 피펫 세포 현탁액은 조직을 제거합니다. 3 ㎖ 차가운 HBSS 각 15 ML 튜브의 측면을 씻어 여과기를 추가 할 수 있습니다. 10 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기 세포. 대기음 뜨는. T-75 플라스크에 10 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 및 전송에 재현 탁 세포 펠렛. 5ml의 미디어 원뿔을 씻어 FL에 추가부탁드립니다.
8. 37 ° C에서 1 시간, 5 % CO ₂ 품어. 물을 욕조에 지난 15 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 튜브를 놓습니다. T-75 새로운 T-175 플라스크의 내용을 전송, 15 ml의 매체와 T-75을 씻어 T-175에 추가. 1 시간 동안 품어.

4. 냉동 보존

1. 얼음에 미디어를 동결 놓습니다. T-175-50 ML 원뿔 튜브에서 세포 미디어를 전송하고, 셀 트리 판 블루를 사용하여 계산에 대한 세포 현탁액의 10 μl를 수집합니다. 5 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 원심 동안 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
2. 1 mL 당 2-4000000 세포의 농도로 미디어를 동결 대기음 배양액과 세포를 재현 탁. 극저온 유리 병에 세포 현탁액 1 ㎖를 꽂은 후, 장소는 -80 ° C 냉동고 O / N의 제어 냉각 컨테이너를 동결 속도, 장소를 유리 병. 1-2일 내에서 액체 질소에 튜브를 전송합니다.

5. 해동 세포

1. 250 μl를 용해하여 피브로넥틴의 코트 요리60; 9.75 ml의 물 (최종 농도 0.025 mg을 ml의 ^1)에 피브로넥틴 (재고 농도 1 mg을 ml의 ^1)의. 배양 플레이트를 커버하고 적어도 30 분 동안 37 ^O C에서 배양 할 수있는 충분한 솔루션을 추가합니다.
   1. 20 % DMSO 매체를 가산함으로써 다음과 같이 네 15ml의 원뿔형 튜브에, DMSO / 미디어의 혼합물을 만든다. 500 μL DMSO로 (5 %) 9.5 ml의 미디어를 추가합니다. 250 μL DMSO로 (2.5 %) 9.75 ml의 미디어를 추가합니다. 10 ml의 미디어를 (이 두을)를 추가합니다.
2. 37 ° C 물욕 상기 미디어의 혼합물을 가열한다. 액체 질소에서 세포를 제거하고 드라이 아이스에 배치합니다. 미디어 혼합물 따뜻한 때 바로 해동 될 때까지, 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동. 이 세포에 손상을 줄 수 있으므로 너무 오래 물을 욕조에 세포를 보관하지 마십시오.
3. 5 % DMSO / 미디어 관에 극저온 유리 병의 내용을 전송합니다. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. 2.5 % DMSO / 미디어 관의 내용은 펠릿 및 R 셀에 추가esuspend. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는.
4. 펠릿에 resuspend 셀 하나의 0 % DMSO / 미디어 튜브의 내용을 추가합니다. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는.
5. 세포 펠렛 및 재현 탁에 두 번째 0 %의 DMSO / 미디어의 내용을 추가합니다. 셀 카운팅을위한 작은 샘플을 가져 가라. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 혈구에서 원심 분리 카운트 세포는 트리 판 블루를 사용하는 동안 죽은 세포 레이블을. 기록 셀 량뿐만 아니라 생존.
6. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. 10 % NRCM 매체에 재현 탁 (옵션 : 100 μM의 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 추가) 피브로넥틴 코팅 요리와 플레이트 세포를.

6. 세포 배양

1. cm ² 당 약 10 만개 세포에서 플레이트 세포. 문화의 사용 목적에 따라 도금 밀도를 조정합니다. 1:10 비율로 IMDM 20 % 미디어를 희석하여 2 % NRCM 미디어를 준비합니다. 다음은 일반적인 배양의 개요이다. </ 리>
2. 1 일에, 멀리 따뜻한 IMDM와 죽은 세포를 씻어 10 % NRCM (옵션 100 μM의 BrdU)를 추가합니다. 2 일에, 멀리 따뜻한 IMDM와 죽은 세포를 씻어 10 % NRCM를 추가합니다. 3 일 - 추가 2 % NRCM을. 4 일에 2 % NRCM를 추가합니다. 5 일에 세포가 합류하고 구타되어 있는지 확인하십시오. 약 일주일 동안 문화의 세포를 유지한다. 그 시점에서 섬유 아세포는 크게 NRCMs을 빨리 성장하기 시작할 수 있습니다.

신생아 래트 심근 세포의 분리 후, 세포를 액체 질소로 동결 다운되고, 적어도 몇 달 동안 저장 될 수있다. 일반적 해동시 트립 판 블루 분석에 의해 측정 생존율​​ 40-60 % 사이가 될 것이다. 이 적절한 파종과 문화, 다른 세포 유형보다 낮은이지만 세포는 (그림 1) 증식합니다. 수축력을 검증하기 위해, 세포를 위상차 현미경을 이용하여 묘화 될 수있다. 세포는 자발적으로 3 일 (그림 2) 내에 계약을 시작해야한다. 면역 세포 화학 (ICC) 검정을 위해, 세포를 웰 당 200,000 세포 4 웰 배양 슬라이드에서 배양 하였다. 위해서 배양 세포는 세포가 α-SA로 표지 하였다 NRCMs하고 형광 현미경을 사용하여 영상화하는 것을 보여준다. 문화 NRCMs (그림 4)을 나타내는 다수의 α-SA 양성 세포가있다. 다른 실험은 막힌 포함 수행 된인간 심장 줄기 세포 유래 엑소 좀과 튜링 NRCMs는 엑소 좀 (그림 5)의 재생 특성을 테스트합니다.

그림 1. NRCM 체외. α-SA (녹색), Ki67 (빨간색)에 대한 염색 NRCM의 형광 현미경 이미지에서 대량 살상 무기 확산 및 DAPI 모두 (A)에 대한 (파란색) 갓 격리 NRCMs와 (B) 냉동 보관 후 해동 NRCMs. 화살표 세포 증식 나타냅니다 (ki67 양성). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

체외. NRCMs의는 자발적에서 냉동 보관 및 해동 NRCM 그림 2. 수축ously 체외에서 계약. 수축력이 회복되기 전에 갓 격리 NRCMs과는 달리 몇 일이 걸릴 수 있습니다. 비디오가 오일 해동 후 기록 하였다. 이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 체외에서 갓 고립 NRCM 3. 수축. 갓 격리 NRCMs 자발적으로 체외에서 계약. 이 세포들은 훨씬 더 빨리 수축을 전시하기 시작합니다. 비디오가 삼일 차단 후 기록 하였다. 이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

NRCM 문화 그림 4. 순도. </ strong>를 갓 문화 5 일 후에의 문화와 (B)의 동결 보존에 NRCMs 해동 NRCMs 고립 모두 (A)의 형광 현미경 이미지. NRCMs이 핵 (파란색)이 α-SA에 의해 포위되지 않는 경우 섬유 아세포를 볼 수있는 반면, α-SA (녹색)에 대한 긍정적 인 얼룩을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 세포 기반 분석을위한 해동 NRCM의 5.. NRCMs의 공 초점 현미경 이미지, α-SA (녹색)에 의해 강조, 심장 줄기 세포에서 DII 표지 엑소 좀 (빨간색)와 함께 배양 하였다. DAPI (파란색)으로 표시 세포 핵. 산화 스트레스 모델을 생성하기 위해, 이전 NRCMs exoso 배양되기, 18 시간 동안 100 μM의 과산화수소로 처리하여4 시간 동안 MES는 산화 스트레스를 반대합니다. 화살표는 어떤 세포에서 높은 엑소 농도의 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

NRCMs이, 고립 냉동 보관 및 해동 될 때까지이 프로토콜은 할 수 있습니다. 세포를 해동하여 절차의 중요한 부분이다. DMSO 희석액 시리즈 서서히 세포를 DMSO ^{(14)로부터} 제거하기 위해 사용된다. 그것은 DMSO의 추출 해동 세포 사망 직후에 특히 민감 재빨리 수행하는 것이 중요하다. 더 많거나 적은 세포가 해동이 필요한 경우 필요에 따라, DMSO 용액의 볼륨을 확장 할 수 있습니다.

NRCM 격리와 문화에 대한 하나의 도전은 섬유 아세포의 급속한 확산이다. 이 프로토콜은 섬유 아세포 ^(15)의 수를 감소하는 것으로 나타났다 예비 도금을 사용한다. 섬유 아 세포가 심근 세포보다 훨씬 빠른 연결되는 코팅 플라스크를 사용하여 작품을 예비 도금. 미디어 변경 시퀀스는 섬유 아세포 성장을 감소 변경 될 수있다. 섬유 아세포는 10 % NRCM 미디어에서 NRCMs을 빨리 성장하지만, 섬유 아세포 성장은 2 % NRCM 메드 크게 느립니다아이오와. 종래 섬유 아세포 성장 ^{3 느린 16,17} 또는 BrdU를 첨가 도금 섬유 아세포를 제거하는 등의 퍼콜 구배와 같은 다른 방법이있다. 과도한 섬유 아세포 성장 위상 현미경을 사용하여 검출하기 어려울 수 있지만, 쉽게 NRCM 같은 α-SA 같은 특정 염색 (도 3)를 사용하여 도시된다. 과도한 섬유 아세포 성장이 계속되면, 용지의 FBS 량이 일 2. 필요한 경우에 2 % FBS로 감소 될 수 있으며, 도금이 증가 된 세포 사멸을 초래할 수 있지만, 5 % FBS 배지에서 이루어질 수있다.

이 절차는 제한된 세포 ^18,19 대용량을 필요로 세포 배양 물을 사용하는 경우에는 더 이상 유리하다. 필요한 셀의 양이 쓰레기에서 수확 가능한 세포의 양이 1/2에 가까워 경우,이 절차는 세포의 대략 절반은 동결 보존으로 인해 손실되기 때문에 더 많은 동물을 필요로 할 것이다. 적은 CEL 사용시 냉동 보존 이점은 크다이러한 면역 염색 등의 분석을위한 LS.

이 프로토콜은 분리, 냉동 보존 및 NRCMs 후속위한 방법을 도시한다. 이러한이 방법을 사용하여, 공급 업체에서 냉동 세포를 구입하지만 구입 세포가 일부 실험실에 엄청난 비용이 될 수 있습니다 적은 대안이있다. 우리의 방법은 일반적으로 세포 배양에 사용되는 재료 및 시약을 필요로한다. 실험 동물의 사용을 감소시키면서 또한, 이러한 방법을 이용하면 크게 실험실 작업의 효율성 및 유연성을 증가시킬 수있다. 기재된 방법은 시험 관내 연구에서 이후에 사용될 수 생존 배양 생산.