Isolatie en cryopreservatie van de neonatale rat Cardiomyocytes

Celcultuur van hartspiercellen is een instrument van cruciaal belang in de moderne cardiale onderzoek. Neonatale rat cardiomyocyten (NRCMs) worden vaak gebruikt omdat de isolatie en cultuur is makkelijker dan die van volwassen ratten hartspiercellen ^1. De NRCM methode heeft nog steeds een aantal beperkingen waaronder een lange isolatie procedure en beperkte celproliferatie in de schotel. Er zijn een aantal protocollen voor het isoleren van NRCMs meeste algemeen vereisen 4-48 uur werk ^2-6. Bovendien worden de cellen vaak geïsoleerde 1-2 dagen oude rat pups ^2,4-7; de timing van de geboorte kan onvoorspelbaar en conflicten met ander werk in het lab zijn. De isolatie kan inefficiënt en verkwistend zijn als alleen een kleine hoeveelheid cellen nodig voor experimenten. De meeste inspanningen op het verbeteren van de workflow focus op de ontsluiting tijd, maar dit is niet de problemen van de timing van de geboorte van de pups op te lossen.

Als alternatief heeft vele laboratoria gebruikencardiomyocyten afgeleid van embryonale stamcellen (SER) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Echter, de herprogrammering en / of differentiatie proces zeer tijdrovend en kostbaar ook. Er kunnen andere problemen bij het ​​gebruik van deze cellen in vitro modellen myocyten. Zowel ESC- en iPSC- afgeleide cardiomyocyten bleken verschillen in elektrofysiologie van primaire cardiomyocyten ^8-10 vertonen.

Gedissocieerde NRCMs zijn kunnen worden opgeslagen voor enkele dagen met behulp van koeling ^11, toch is dit niet toestaat voor lange termijn opslag. Vloeibare stikstof wordt meestal gebruikt om cellen te behouden voor een grotere tijdsperiode, maar vereist een koude beschermend middel zoals dimethylsulfoxide (DMSO). Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de ideale concentratie van 5-10% DMSO in de bevriezing media zorgt voor cryopreservatie van NRCMs, maar zelfs dan is de levensvatbaarheid blijft laag ^12. Hoewel DMSO helpt bij de bescherming van de cellen tijdens de vrijezing kan toxisch zijn voor cellen in concentraties boven 1,5% ^13. Eerdere studies hebben aangetoond dat langzaam verwijderen van DMSO uit de cellen, cel levensvatbaarheid kunnen ¹⁴ verbeteren.

We zochten de efficiëntie van NRCM celgebaseerde proeven door cryopreserveren de cellen na isolatie te verbeteren. Hierdoor kunnen de cellen worden ontdooid en gebruikt wanneer nodig, waardoor de frequentie van isolatie en het gebruik van dieren. Met deze methode wordt aangetoond dat het mogelijk is NRCMs cryopreserve en ontdooien deze voor gebruik op een later tijdstip. Na het ontdooien van de cellen te behouden een aanvaardbare levensvatbaarheid en produceren NRCM culturen die positief zijn voor α-sarcomerische actinine (α-SA) en contract spontaan zijn.

Het volgende protocol is bedoeld voor de isolatie van hartspiercellen van het ene nest van de neonatale rat pups (10-14 pups). Als worpgrootte significant verschilt, kan de procedure worden geschaald te compenseren. De pups moet ongeveer 48 ± 6 uur oud zijn. Alle procedures die hierin zijn goedgekeurd door de North Carolina State University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. celisolatie Voorbereiding

OPMERKING: Voer de volgende stappen op de dag voor isolatie.

1. Autoclaaf het volgende: grote schaar, kleine schaar, kleine scherpe tang, grote tang. Gebruik een zwaartekracht cyclus gedurende 60 min bij minimaal 121 ° C en een droogtijd van 30 min.
2. Plaats 40 ml 0,1% trypsine-oplossing in de koelkast te ontdooien O / N. Koelkast Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) als deze niet al koud. Bereid een 20% foetaal runderserum (FBS) stock mediaoplossing.
   1. In 400 ml Iscove gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) 100 ml FBS, 5 ml L-glutamine (200 mM), 2,5 ml gentamicine (10 mg ^ml-1), en 0,9 ml 2-mercaptoethanol. Steriliseren met behulp van vacuüm filter. Sla materialen bij 4 ^{° C} gedurende maximaal 3 weken en dit is schaalbaar voor kleinere of grotere hoeveelheden. Verdunnen met 20% FBS voorraad media 1: 1 met IMDM tot 10% FBS NRCM media te produceren. Alleen te maken in kleine batches om herhaalde verwarming en koeling van de media te voorkomen.

2. celisolatie Dag 1

1. Voer de volgende werkzaamheden in een kweek kap om verontreiniging van de monsters te voorkomen. Voor de beste timing Start deze werkzaamheden in de namiddag omdat er een O / N incubatie.
2. Bereid werkruimte in een steriele cultuur kap. Plaats bankje pad in cultuur kap. Vul twee 250 ml bekers met 70% ethanol en zet chirurgische instrumenten daarin. Plaats kleine emmer ijs in capuchon. Zorg ervoor dat het groot genoeg is om meerdere buizen en een 150 mm schaal vast te houden. UV steriliseren de motorkap for 10 min. Plaats 40 ml 0,1% trypsine op ijs.
3. Ophalen neonatale rat pups van de moeder. Om de dieren warm te houden tot gebruik, plaats ze in een geïsoleerde container, zoals een ijsemmer verpakt in een bench pad om ze warm te houden.
4. Vul een 150 mm cultuur schotel met 25 ml HBSS en plaats op ijs. Uitpakken 2-3 gaasjes en plaats in het werkgebied. Houd pup door de huid op de rug van de nek, spray met 70% ethanol en plaats kap. OPMERKING: steriliteit best behouden, dit kan worden gedaan door iemand die vervolgens plaatst de gereinigde pup in de kap.
5. Houd de pup door de huid op de rug van de nek. Vervolgens met behulp van de grote schaar, in een snelle, sterke cut euthanaseren door onthoofding. Dep het bloed met een gaasje. LET OP: Door verschillen in IACUC eisen, kan het beter zijn om de pup met een ethanol schoon te vegen in plaats van spuiten. Zorg ervoor dat u met de universiteit IACUC als hun richtlijnen voor deze stap.
6. Blijven kappen anterieure kant van de lest via de ribbenkast. Druk de huid van de hals om de borstkas te openen totdat het hart zichtbaar. Met behulp van de kleine schaar, verwijder het hart en de plaats in de HBSS cultuur schotel op ijs. Herhaal dit voor de andere pups.
7. Verwijder eventuele niet-hartweefsel van de monsters en zwenk de HBSS zachtjes om de harten te wassen. Transfer het hartweefsel een andere cultuur schotel met verse HBSS en verder was het weefsel. Snijd het weefsel verder totdat de stukken zijn 1-3 mm ^3, en vervolgens over te dragen aan de trypsine-oplossing. Plaats trypsine oplossing rocker in 4 ^{° C} koelkast O / N.

Celisolatie Dag 2

OPMERKING: Tijdens het opzuigen in de volgende stappen, gebruik dan een pipet in plaats van een vacuüm lijn. Het weefsel soepel loopt, en een vacuüm lijn zal verstoppen of te verwijderen weefsel nog bevattende cellen. Het beste is om een ​​pipet te gebruiken in plaats van aspiratie. Als weefsel komt in de pipet, pipet terug naar buiten om deze te verwijderen.

1. Maak trie porties van 10% NRCM Media: een met 25 ml en twee met 15 ml. Plaats een 25 ml buis van media in 37 ° C waterbad. Voeg 4 ml HBSS tot 5 verschillende 15 ml conische buizen en eerst alle op ijs. Label elke 15 ml tube # 1-5.
2. Voeg 40 ml HBSS aan een 50 ml conische buis. Voeg 10 ml HBSS collagenase, pipet te schorten, en combineer de oplossing 50 ml van 1 mg ^ml-1 collagenase oplossing creëren. Steriliseren met behulp van 0,22 pm vacuümfilter, en op te slaan bij KT.
3. Ophalen hartweefsel / trypsine buis. Zorg ervoor dat trypsine is duidelijk, en het weefsel verschijnt pluizige. Laat het weefsel om zo zoveel mogelijk vloeistof te vestigen op de hoek van de buis en zuig.
4. Voeg 25 ml warm 10% FBS NRCM media om de buis en swirl met de hand. Dop en draai in 37 ° C waterbad gedurende 2 min. Zuig vloeistof weer. Het weefsel moet drijven bij deze stap; zo ja, aspireren van de bodem van de buis.
5. Voeg 10 ml collagenase. Draai in een waterbad gedurende 2 minuten of totdat de oplossing troebel. Quickly zuigen de vloeistof. Voeg 10 ml vers collagenase aan buis met het weefsel en roteren in een waterbad gedurende 2 min. Pipet te mengen, overdracht oplossing voor de buis # 1, en plaats op ijs. Het kan onmogelijk zijn om alle vloeistof te verwijderen. Herhaal stap 3,2-3,6 voor de andere drie 15 ml conische buizen. Transfer eventuele resterende vloeistof buis # 5.
6. Centrifugeer 15 ml buizen bij 410 RCF gedurende 8 min. Terwijl centrifugeren, plaats 15 ml 10% FBS NRCM media buis in een waterbad. Plaats 40 um cel zeef bovenop een 50 ml conische buis en nat met 2 ml koude HBSS.
7. Zuig supernatant van afgedraaid cellen. Voeg 6 ml koud HBSS aan elke buis en resuspendeer. Pipet celsuspensies door de zeef in 50 ml conische aan elk weefsel te verwijderen. Spoel zijden van elk 15 ml buis met 3 ml koud HBSS en voeg aan zeef. Centrifugeer cellen bij 410 RCF gedurende 10 min. Zuig supernatant. Resuspendeer celpellet in 10 ml 10% FBS NRCM media transfer naar T-75 kolf. Spoel conische met 5 ml media en toevoegen aan flvragen.
8. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% _CO2. Plaats laatste 15 ml 10% FBS NRCM media buis in een waterbad. Breng inhoud van T-75 een nieuwe T-175 kolf, spoel T-75 met 15 ml medium en aan T-175. Incubeer gedurende 1 uur.

4. cryopreservatie

1. Plaats bevriezing media op ijs. Transfer celmedia van T-175 tot 50 ml conische buis, en het verzamelen van 10 ul van celsuspensie voor cel tellen met behulp van trypaanblauw. Centrifugeer bij 410 RCF gedurende 5 min. Terwijl centrifugeren, tellen cellen met behulp van een cel teller.
2. Zuig kweekmedia en resuspendeer cellen bevriezen media bij een concentratie 2-4 miljoen cellen per ml. Plaats 1 ml celsuspensie in cryogene flacon, dan plaats injectieflacons een gecontroleerde afkoeling tarief bevriezing container, en plaats in -80 ° C vriezer O / N. Binnen 1-2 dagen, overdragen flesjes in vloeibare stikstof.

5. Ontdooien Cellen

1. Jas schotel in fibronectine door het oplossen van 250 ul60; van fibronectine (voorraad concentratie van 1 mg ^ml-1) in 9,75 ml water (uiteindelijke concentratie 0,025 mg ^ml-1). Voeg voldoende oplossing kweekplaat bedekken en incubeer bij ³⁷ ° C gedurende ten minste 30 min.
   1. In vier 15 ml conische buizen, maken de DMSO / media mengsels als volgt door het toevoegen van DMSO tot 20% Media. Voeg (5%) 9,5 ml medium met 500 ul DMSO. Voeg (2,5%) 9,75 ml medium met 250 ul DMSO. Voeg 10 ml media (maak twee van deze).
2. Verhit de bovengenoemde media mengsels in 37 ° C waterbad. Cellen verwijderen uit vloeibare stikstof en plaats op droog ijs. Als media mengsels zijn warm, ontdooien cellen in 37 ° C waterbad tot net ontdooid. Niet cellen in waterbad reactie te lang dit schade aan de cellen veroorzaakt.
3. Transfer inhoud van cryogene flacon tot 5% DMSO / media buis. Centrifugeer bij 410 RCF gedurende 8 min. Zuig supernatant verlaten cel pellet. Voeg inhoud van 2,5% DMSO / media buis te pellet en r celesuspend. Centrifugeer bij 410 RCF gedurende 8 min. Zuig supernatant verlaten cel pellet.
4. Inhoud van een 0% DMSO / media buis toe te voegen aan pellet en resuspendeer cel. Centrifugeer bij 410 RCF gedurende 8 min. Zuig supernatant verlaten cel pellet.
5. Inhoud van de tweede 0% DMSO / media toe te voegen aan de cel pellet en resuspendeer. Neem kleine steekproef voor cel tellen. Centrifugeer bij 410 RCF gedurende 8 min. Terwijl centrifugeren tellen cellen in een haemocytometer behulp trypaanblauw om dode cellen te labelen. Neem cel bedrag, en levensvatbaarheid.
6. Zuig supernatant verlaten cel pellet. Resuspendeer in 10% NRCM media (optioneel: voeg 100 uM broomdeoxyuridine (BrdU)) en plaat cellen op met fibronectine gecoate gerechten.

6. Celkweek

1. Cellaag ongeveer 100k cellen per ^cm2. Pas de beplating dichtheid gebaseerd op het beoogde gebruik van de cultuur. Bereid 2% NRCM media door verdunning van 20% Media in IMDM in een 01:10 verhouding. Hieronder volgt een overzicht van een typische cultuur. </ Li>
2. Op dag 1, spoelen dode cellen weg met warme IMDM, voeg 10% NRCM (optioneel 100 uM BrdU). Op dag 2, spoelen dode cellen weg met warme IMDM, voeg 10% NRCM. Dag 3-voeg 2% NRCM. Op dag 4 voeg 2% NRCM. Op dag 5 ervoor dat de cellen confluent en slaan. Behouden cellen in cultuur voor ongeveer een week. Op dat moment kan beginnen de fibroblasten aanzienlijk ontgroeien de NRCMs.

Na de isolatie van de neonatale rat cardiomyocyten worden de cellen omlaag bevroren vloeibare stikstof, en kan worden bewaard gedurende ten minste enkele maanden. Meestal bij het ontdooien, de levensvatbaarheid bepaald door trypaanblauw analyse zal tussen 40-60%. Hoewel deze waarde onder andere celtypes, met correcte zaaien en cultuur de cellen (Figuur 1) prolifereren. Om contractiliteit controleren, kunnen de cellen worden afgebeeld met behulp van een fase-contrast microscopie. De cellen moeten beginnen spontaan kloppen binnen ongeveer drie dagen (figuur 2). Voor immunocytochemie (ICC) assays, werden cellen uitgeplaat in 4-en cultuur dia's met 200.000 cellen per putje. Om aan te tonen dat de cellen in cultuur NRCMs de cellen werden gelabeld met α-SA en afgebeeld met fluorescentiemicroscopie. Er zijn talrijke α-SA positieve cellen aangeeft NRCMs in de kweek (figuur 4). Andere experimenten werden uitgevoerd zoals culTuring NRCMs met menselijke cardiale stamcellen afgeleide exosomen om te testen regeneratieve eigenschappen van exosomen (Figuur 5).

Figuur 1. NRCM Proliferatie in fluorescentie microscopie beeld van NRCM met kleuring voor α-SA (groen), Ki67 (rood) Vitro., En DAPI (blauw) voor zowel (A) vers geïsoleerde NRCMs en (B) gecryopreserveerde vervolgens ontdooid NRCMs. Pijlen geeft prolifererende cellen (Ki67-positief). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Contractie van Gecryopreserveerde en Ontdooide NRCM In Vitro. NRCMs spontaneDUREND aanbestedende in vitro. In tegenstelling tot vers geïsoleerde NRCMs, kan het enkele dagen duren voordat de contractiliteit wordt teruggewonnen. Video werden opgenomen vijf dagen na het ontdooien. Klik hier om deze video te bekijken.

Figuur 3. Inkrimping van vers geïsoleerde NRCM In Vitro. Vers geïsoleerde NRCMs spontaan samentrekkende in vitro. Deze cellen zullen beginnen contractiliteit vertonen veel sneller. Video werden opgenomen 3 dagen na isolatie. Klik hier om deze video te bekijken.

Figuur 4. Zuiverheid van NRCM Cultuur. </ Strong> Fluorescentiemicroscoop beelden van beide (A) vers geïsoleerde NRCMs in cultuur en (B) gecryopreserveerd en ontdooid NRCMs na 5 dagen in de cultuur. NRCMs tonen positieve kleuring voor α-SA (groen), terwijl fibroblasten kan worden gezien waar kernen (blauw) niet worden omringd door α-SA. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Confocale microscopie beeld van NRCMs figuur 5. Gebruik van Ontdooide NRCM voor Cell-gebaseerde test., Gemarkeerd door α-SA (groen), geïncubeerd met DII-gelabelde exosomen (rood) van cardiale stamcellen. Celkernen gelabeld met DAPI (blauw). Om een ​​oxidatieve stress model te maken, werden NRCMs behandeld met 100 uM waterstofperoxide 18 uur, alvorens te worden geïncubeerd met exosomes voor 4 uur naar de oxidatieve stress te keren. Pijlen geven de regio's van hoge exosome concentraties in sommige cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Dit protocol maakt het NRCMs worden geïsoleerd, gecryopreserveerd en ontdooid. Het ontdooien van de cellen is een cruciaal deel van de procedure. Een reeks verdunningen DMSO wordt gebruikt om langzaam verwijderen DMSO uit de cellen ^14. Het is belangrijk dat de winning van DMSO snel mogelijk nadat de cellen zijn bijzonder gevoelig voor onmiddellijk sterven na ontdooien. Indien meer of minder cellen voor ontdooiing kunnen de volumes van de DMSO oplossingen worden geschaald als nodig.

Een uitdaging om NRCM isolatie en cultuur is de snelle proliferatie van fibroblasten. Dit protocol maakt gebruik preplating waarvan is aangetoond dat het aantal fibroblasten ¹⁵ verminderen. Preplating werken met onbeklede kolven waarbij de fibroblasten hechten veel sneller dan cardiomyocyten. De sequentie van media veranderingen kunnen worden gewijzigd fibroblastgroeifactor verminderen. Fibroblasten zal ontgroeien NRCMs in 10% NRCM media, maar fibroblast groei is beduidend langzamer in 2% NRCM media. Er zijn andere methoden zoals Percoll gradiënten te fibroblast verwijderen voorafgaand aan uitplaten ^16,17 of toevoeging van BrdU ³ fibroblast groei vertragen. Overmatige fibroblastgroeifactor kan moeilijk te detecteren met fase microscopie, maar wordt eenvoudig weergegeven middels NRCM specifieke kleuring zoals α-SA (figuur 3). Als er blijft overmatige groei fibroblast, kan de hoeveelheid FBS in de media worden verlaagd tot 2% FBS op dag 2. Indien nodig kan plateren worden gedaan in 5% FBS media, maar dit kan leiden tot een verhoogde celdood.

Deze procedure is beperkt en niet langer nuttig bij gebruik celculturen die veel cellen ^18,19 vereisen. Wanneer de hoeveelheid cellen die nodig nadert helft hoeveelheid cellen mogelijk te oogsten uit een nest, zal deze procedure meer dieren aangezien ongeveer de helft van de cellen verloren door cryopreservatie vereisen. De voordelen van cryopreservatie groter bij gebruik minder CELls voor testen zoals immunokleuring.

Dit protocol geeft de methoden voor de isolatie, cryopreservatie en daaropvolgende van NRCMs. Er zijn weinig alternatieven, zoals het kopen van bevroren cellen van leveranciers, om deze methode maar het kopen cellen kunnen onbetaalbaar worden kosten sommige laboratoria. Onze werkwijze vereisen slechts en reagentia vaak gebruikt in celcultuur. Daarnaast is het gebruik van deze methoden kan verhogen de efficiëntie en flexibiliteit van lab werk, terwijl het verminderen van het gebruik van proefdieren. De beschreven werkwijzen levensvatbare kweken die kan worden gebruikt voor daaropvolgende in vitro studies.