在小鼠胰腺β-细胞团的原位定量

第1部分：试样制备

1. 下解剖镜下放置鼠标，整个胰腺仍然附着与十二指肠和脾脏中删​​除，并放在一个预先称重的载玻片机关。取出沿侧切割结缔组织，它必然胰腺十二指肠。剪切和删除对胰腺的脾和多余的脂肪，直到胰腺是幻灯片上的完全隔离。 （胰腺脂肪是从胰腺组织的颜色稍深和Tanner的区别，其白色区分开来。）
2. 将盖玻片（大盖玻璃50x75mm;标准盖玻片25x75mm）在胰腺，使其完全覆盖。使用重量（如一个沉重的书）扁平化之间的幻灯片的胰腺和它的封面。根据不同的重量，扁平化的胰腺，大约需要5分钟。
3. 起飞重量。如果胰腺是平坦的，对幻灯片，将在4％多聚甲醛（PFA），在4 ° C过夜。在早上，取出盖玻片，白天（6-8小时）暴露整个胰腺煤灰。如果胰腺是不固定的，允许它留在煤灰，可能一蹴而就。转让1％的幻灯片容器的Triton X - 100的磷酸盐的缓冲液（PBS）过夜。第二天，转让幻灯片饱和蔗糖的容器为1-2天。然后，将下滑到100％甘油的容器，直到组织被清除，这对荧光信号的最佳分辨率，允许组织清算大约需要1-3天。 （荧光信号可能会持续几周，甚至几​​个月，但成像应该执行后不久，该组织是为最佳分辨率清除。）
4. 储存在阴凉的区域胰腺，以维护机关及其荧光信号。

第2部分：成像和量化完整的胰腺β细胞的面积

1. 使用镊子或戴手套的手，容器的滑出100％的甘油。擦去多余的甘油和专门用乙醇清洗玻璃盖的背面，准备用于成像的幻灯片。
2. 打开StereoInvestigator软件（MicroBrightField，威利斯顿，VT），并选择2X物镜成像小鼠胰腺大型玻片3周以上，或10倍的物镜成像小鼠胰腺年龄小于3周两25毫米盖玻片压。可视化设置实时图像（图像→现场图像）图像。选择一个曝光时间，清楚地表明GFP标记的β细胞。 （曝光不足的图像排除较小的胰岛β细胞，而过度曝光的图像创建额外的虚假信号。）
3. 点击屏幕上的任何地方建立一个基准点，并着手拟订一个围绕整个胰腺的轮廓。启动虚拟切片的过程（图像→获取虚拟切片）。确定和选择最好的焦平面，即，具有显着的，重点突出的胰岛β细胞上滚动聚焦旋钮Z轴的数量最多的飞机。一旦选择，StereoInvestigator自动捕获屏幕上显示的图像。随着机动阶段，“虚拟切片”功能顺序捕捉每个光面板内绘制的轮廓（图1A）作为一个鲜明的形象，然后结合所有这些作为一个合并后的图像（图1B）。虚拟切片成像技术使用啶配置即过滤器，广角，让相机捕捉到的所有信号在一定的深度，包括那些不完美中的重点，使最终的虚拟片是一个集成的二维图像，是不是最大从整个胰腺三维重建的投影。平均虚拟切片扫描时间是每个样本30分钟，但可能需要长达一个小时为一个大的胰腺。
4. 保存图像后，开始开放ImageJ图像分析。当图像完成加载，并显示在屏幕上，打开和运行的虚拟切片分析的宏（补充材料 1 ）。
5. 按照提供的说明一步一步的宏观。消除光散射的“魔棒”和“选择区域”工具创建不受欢迎的文物。不必要的检查，并从图像中减去背景。确定半径最大的胰岛与“行”的工具，使随后的滚珠功能，能有效去除自体荧光和散射光。测试和选择最合适的“低门槛”，捕捉到的小胰岛β细胞群荧光信号^（<3X10 4 ^微米 2） 。测试和选择最合适的“高门槛”，捕捉到的胰岛荧光信号。运行虚拟切片的量化，将测量产生胰岛面积，周长，圆度，和FERET的直径。

图1A虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
在10周的一个雄性小鼠胰腺中的单个光学面板的图像下一个2倍的目标。这些图像包括整个小岛的分布，甚至小群的β细胞（<10个细胞）。

图1B虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
一个统一的虚拟切片与右侧背胰和腹胰左侧。比例尺为5毫米。

代表性的成果

精通虚拟切片成像胰腺准备将允许所有的有效量化GFP标记作为一个具有明确和独特的小岛的虚拟切片图像的整个胰腺的β细胞。成功的虚拟切片原位全胰腺成像提供的手段，研究和量化的β-细胞，不仅是个人和总胰岛面积，而且胰岛大小分布，区域分析，和增长方式转变以及的。虽然ImageJ维护的能力，同时在虚拟切片图像分析检测所有的β细胞，它也可以控制产生β细胞，进行量化分析，通过限制某些胰岛的尺寸（面积或直径），或由位置。一个标准的分析不包括文物，例如，比一个单一的β-细胞（<170微米）和记录的面积，周长（周边地区的距离），圆（一个圆度的程度，其中1.0代表一个完美的圆）小碎片。 FERET每个胰岛的直径（在一个区域内的最长的距离）检测。虚拟切片分析能力，提高用人的分水岭，区分和分离重叠成单个胰岛的胰岛细胞，根据它们的形状虚拟切片图像。进一步的分析产生了一系列详细的图像，这包括口罩的图像在低和高的强度（图1C），所有推定胰岛大纲，这是每个独立编号及相应的信息表中列出（图1D），和原来的虚拟切片图像（图1B）。选择可以倾斜的小岛，包括无偿光周围的大型结构的量化，或减少总数的胰岛细胞，尤其是小颗粒的微弱信号的阈值时，需要注意的是潜在的技术偏见。

图1C虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
在虚拟切片的荧光颗粒的面具。颜色代码：[1]蓝色：低强度的荧光; [2]绿​​色：中等强度的荧光; [3]红色：高强度的荧光。

图1D的虚拟切片图像，在一个完整的成人胰腺的β细胞的整个分布分析
量化的个别小岛/β-细胞群。请注意，每个胰岛（包括β细胞的小群）是其在相应的图表详细信息，编号。每个结构的四个参数：（1）区（2）周边;（3）循环：这里的人数1.0代表一个完美的圆某种程度的圆度;和（4）FERET的直径：在一个区域内最长的距离。请注意，＃706显示面积只有少数β-细胞分析的决议。分水岭分割检测相邻的小岛组，如所示，并适当的区分不同的胰岛细胞（胰岛1554，1555和1556），他们。

图1E虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
3维虚拟切片分析的情节，面积，周长，和FERET的直径的轴。每个点代表一个小岛。

完整的胰腺中的胰岛细胞和β细胞集群的虚拟切片图像分析提供了一个大规模的看法，整个小岛分布。发展，随着时间的推移，总胰岛分布的变化，因此可以研究和比较。在我们的胰岛形成（1）分析表明了这样一个例子。在不同时间点（P1 - P21）的综合分析表明新生小鼠的胰腺，胰岛裂变形成。虽然β-细胞的增殖与小鼠的对数正态分布的概率密度函数从P1 - P10适合从P12开始，胰岛分布向左偏离距离的对数正态分布模式，这表明一个裂变的过程。在小鼠体内胰岛素的逐步发展，它装有一个峰的位置和X -轴的刻度参数的对数正态分布函数和幂律分布（2）上进行类似的分析：



P（X）= AX ^Ÿ。数据是有效的立体地块的面积，周长和FERET的直径（图1E）。对于我们的研究，转基因小鼠，其中的胰腺β细胞的基因与绿色荧光蛋白（GFP的; 3，4）标记的小鼠胰岛素我子（MIP）的控制下，被使用。 MIP - GFP的也可以交叉与其他特定的转基因小鼠在今后的研究中。